Révéler l'organisation du cytosquelette des cellules invasives du cancer en 3D

Summary

Cet article présente une méthode pour étiqueter fluorescence collagène qui peut encore être utilisé à la fois fixe et imagerie en temps réel des cultures cellulaires en 3D. Nous fournissons également un protocole optimisé pour visualiser les protéines du cytosquelette endogènes des cellules cultivées dans des environnements 3D.

Abstract

La migration cellulaire a traditionnellement été étudié dans des substrats 2D. Cependant, il est devenu de plus en plus évident qu'il est nécessaire d'étudier la migration cellulaire dans des environnements 3D plus appropriées, qui ressemblent mieux la dimensionnalité des processus physiologiques en question. Cellules migratrices peuvent différer substantiellement dans leur morphologie et leur mode de migration selon qu'ils se déplacent sur des substrats 2D ou 3D. En raison de difficultés techniques et d'incompatibilités avec la plupart des protocoles standard, l'analyse structurelle et fonctionnelle des cellules incorporées dans des matrices 3D reste encore rare. Cet article décrit les méthodes de préparation et d'imagerie de cultures de cellules cancéreuses 3D, que ce soit sous forme de cellules ou de sphéroïdes simples. Comme un substrat d'ECM approprié pour la migration des cellules cancéreuses, nous utilisons nonpepsinized collagène de queue de rat je polymérisé à température ambiante et marqué par fluorescence pour faciliter la visualisation en utilisant microscopie confocale standard. Ce travail comprend également un protocol pour le marquage par immunofluorescence 3D du cytosquelette de la cellule endogène. L'utilisation de ces protocoles, nous espérons contribuer à une meilleure description de la composition moléculaire, la localisation et les fonctions des structures cellulaires en 3D.

Introduction

Le domaine de la migration cellulaire a été bravant dans le nouveau monde de troisième dimension de la marque. Il est intuitif pour étudier la migration cellulaire dans un environnement qui ressemble le plus à celui physiologique et, par conséquent, en trois dimensions (3D). Toutefois, en raison de limitations techniques, des études de migration plus cellulaires ont été faites analyser le mouvement des cellules à travers des substrats à deux dimensions (2D) rigides, soit non traitées ou enrobées de protéines de la matrice extracellulaire appropriés (ECM).

Les premières études consacrées à la migration des cellules dans trois réseaux de collagène dimensions remontent plus de 20 ans ^1-3. Toutefois, seulement au cours des 5 dernières années, il est devenu clair que les cellules migratrices pourraient différer substantiellement dans leur morphologie et leur mode de migration en fonction de la dimension du substrat. En 2D, les cellules ne contacter le substrat avec sa surface ventrale en utilisant des points d'adhésion, aboutissant à la formation de larges parties saillantes plates (lamellipode) avecprotubérances en forme de doigt embarqués (filopodia) à leur bord d'attaque. Ces structures, en même temps que les fibres de stress qui relient l'avant de la cellule au bord de fuite, sont considérées comme cruciale pour le mouvement de cellule à 2D. Dans les matrices 3D, les cellules sont généralement plus allongée, avec toute la surface de la cellule communiquant avec l'ECM, provoquant des changements considérables dans la formation et la pertinence fonctionnelle de plusieurs de ces structures. Inversement, d'autres caractéristiques cellulaires gagnent en pertinence migration 3D, telle que déformation nucléaire et structures impliqués dans remodelage de la MEC ^4.

En dépit de ces altérations morphologiques connus, ainsi que les différences dans les modes de migration ^5-7, qui peut varier en fonction de l'ECM et de types de cellules, l'analyse structurelle et fonctionnelle des cellules incorporées dans des matrices 3D reste encore rare. Travailler avec des matrices 3D épais et dense porte difficultés techniques, telles que l'imagerie par microscopie à haute résolution, et des incompatibilités avec plus standard protocoles optimisés pour les cultures 2D, comme l'étiquetage immunofluorescence des protéines endogènes. Aussi, parce que l'utilisation de matrices 3D est une approche relativement nouvelle, les chercheurs sont en train de rechercher les meilleures conditions pour ressembler étroitement spécifique dans les situations in vivo, tels que l'architecture du stroma normal des différents organes de tissus ou de l'organisation ECM autour d'une tumeur. Les écarts dans les résultats des différents groupes concernant, par exemple, les modes de cellules cancéreuses de la migration ou l'existence d'adhérences focales, ont suscité une certaine controverse ^8. Beaucoup d'efforts ont été récemment consacrée à parvenir à un consensus en termes d'ECM nature chimique, la taille des pores, l'épaisseur de la fibre, et la rigidité de la matrice. De nombreux types d'ECM 3D sont actuellement utilisés, allant de cellules dérivées de matrices matrigel disponible dans le commerce, le collagène pepsine bovine I, ou nonpepsinized queue de rat collagène I. Chacune de ces matrices a des propriétés physiques et chimiques spécifiques et on a besoin de relationste la matrice de choix pour le processus physiologique à l'étude. En outre, la taille et la fibre épaisseur des pores peut dépendre des conditions de polymérisation, tels que le pH et la température de ^9,10. La liaison à distance et de supports rigides tels que le verre, peut également modifier les propriétés élastiques de la matrice ^10,11.

Cet article décrit les méthodes de préparation et d'imagerie de cultures de cellules cancéreuses 3D, que ce soit sous forme de cellules ou de sphéroïdes simples. Procédés de fabrication de sphéroïdes de cellules cancéreuses ont déjà été décrits, plus populaires étant la méthode de la goutte suspendue ^12,13 et la méthode de la plaque d'agarose enduit ^14. En tant que substrat d'ECM approprié pour la migration des cellules de cancer, nonpepsinized collagène de queue de rat I polymérisé à température ambiante est utilisé à 2 mg / ml. Nonpepsinized collagène acido-extrait I de queue de rat conserve les deux C-terminale et N-télopeptides, les portions non hélicoïdale de la molécule de collagène responsables de collagène natif intermolecréticulation culier et la stabilité fibrilar ^15. Ensemble, ces conditions permettent la formation de réseaux de collagène qui ressemblent le plus à ceux observés in vivo ^10. Pour permettre la visualisation des fibres de collagène, à la fois dans les cultures fixes et de vie, un protocole détaillé est prévu pour marquer par fluorescence collagène in vitro, ¹⁰ à l'aide de 5 - (et-6)-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA), ester de succinimidyle. Ce protocole a été adapté à partir de Baici et al. ^16,17, où l'isothiocyanate de fluorescéine est utilisée pour marquer les molécules de collagène solubles. Que la fluorescéine, TAMRA est un colorant fluorescent amino-réactif qui réagit avec les groupes amino aliphatiques non protoné de protéines, tels que le groupe amino libre à l'extrémité N-terminale et, plus important encore, le groupe amino côté de lysines. Cette réaction se produit uniquement à pH basique, lorsque le groupe amino de lysine se présente sous forme non protoné. En plus de TAMRA être plus stable que la fluorescéine surtemps, son spectre d'émission se situe sur la gamme orange / rouge (ex / em = 555/518 nm), qui peut être utilement combiné pour l'imagerie des cellules vivantes de protéines GFP-taggés. Utilisation de collagène solubles molécules marquées avec des colorants amino-réactifs n'a pas d'incidence sur le procédé de polymérisation, ni la densité, la taille des pores et de l'état de réticulation de la matrice de collagène ^10,16,18,19.

Ce protocole comprend également un procédé de marquage par immunofluorescence 3D des protéines endogènes, qui a été encore optimisé pour marquer le cytosquelette ou protéines associées cytosquelette. L'objectif final de ce protocole est sur les méthodes pour acquérir des images à haute résolution des cultures 3D en utilisant la microscopie confocale à contribution réduite à partir de lamelles de verre rigides sur la tension de la matrice de collagène.

Protocol

1. TAMRA-collagène I étiquetage

1. Préparer un 10 mg / ml solution TAMRA en ajoutant 2,5 ml de DMSO à celui fourni 25 mg poudre TAMRA. Dissoudre au vortex jusqu'à dissolution complète. Conserver à -20 º C et protéger de la lumière.
2. Préparer 2 litres d'étiquetage tampon (0,25 M NaHCO _3, 0,4 M de NaCl). Ajuster le pH à 9,5 en utilisant une solution 10 M de NaOH. Conserver à 4 º C. De ce point, toutes les opérations sont effectuées à 4 º C, sauf indication contraire matériau fluorescent et est protégé de la lumière en utilisant du papier d'aluminium.
3. Remplir une seringue jetable de 1 ml avec 1 ml de concentré hautement queue de rat collagène de la solution I. Solutions de collagène de haute concentration sont généralement fournis à des concentrations d'environ 10 mg / ml et sont très visqueux. Veillez à manipuler lentement pour éviter la formation de bulles d'air.
4. En utilisant une aiguille hypodermique 21, injecter du collagène dans un prétrempé 3 ml cassette de dialyse de 10.000 MWCO coupée. Faites preuve de prudence pour éviter damaging la membrane avec l'aiguille. Retirer tout l'air de la cassette de dialyse en tirant le piston de la seringue. Dialyser pendant la nuit contre 1 L de tampon de marquage.
5. Mélanger 100 ul de 10 mg / ml solution TAMRA avec 900 pi de tampon d'étiquetage. Note: Ceci devrait être fait à la fois solution TAMRA et le tampon de marquage à la température ambiante depuis DMSO gèle à 4 º C. Après le mélange, apporter la solution diluée TAMRA revenir à 4 º C.
6. Retirez délicatement le collagène de la cassette de dialyse à l'aide d'une seringue jetable de 2 ml avec une aiguille de calibre 21 hypodermique. Mélanger 1 ml de la solution de collagène dialysée avec 1 ml de solution TAMRA dilué par pipetage.
7. Transférer le collagène / TAMRA mélange dans un tube de 2 ml et incuber une nuit avec rotation.
8. Transférer le 2 ml de collagène TAMRA marqué dans un prétrempé 3 ml cassette de dialyse et on dialyse pendant la nuit contre 1 L de l'étiquetage tampon pour éliminer l'excès de colorant libre.
9. Pour restaurer la TAMRA-labELED collagène de la solution initiale de collagène, placer la cassette de dialyse dans 1 L de 0,2% (v / v) d'acide acétique, pH 4, et on dialyse pendant une nuit.
10. Mesurer le volume final du collagène TAMRA-marquée et calculer sa concentration finale, en tenant compte du volume initial et la concentration de la solution de collagène utilisée. Conserver à 4 º C.

2. 3D Matrices TAMRA-collagène avec des cellules individuelles embarqués

1. Calculer le volume de 2 mg / ml TAMRA-Collagène Mix nécessaire pour l'expérience. Toujours préparer plus de 20% pour tenir compte de pipetage pertes dues à la viscosité élevée de collagène.
2. Préparer une solution stock de 10x PBS et 1 N NaOH. Filtrez-stériliser et conserver à 4 º C. De ce point, toutes les opérations sont effectuées sur la glace, sauf indication contraire et dans des conditions stériles.
3. Mélanger 10x PBS et 1 N NaOH en quantités suffisantes pour atteindre la concentration de collagène désiré et pH 7,4. Par exemple, pour un volume final de 1 mlde TAMRA-Collagène Mix à pH 7,4, mélanger 100 pi de PBS 10X avec 5 pi de NaOH 1N. Mélangez bien.
4. Ajouter les volumes appropriés de collagène TAMRA-étiqueté et non étiqueté collagène dans un rapport 1:6 à obtenir une concentration en collagène total et final de 2 mg / ml. Par exemple, pour un volume final de 1 ml de 2 mg / ml TAMRA-Collagène Mix, ajouter 90,48 pi de 3,68 mg / ml de collagène TAMRA marqué et 415,71 pi de 4,01 mg / ml de collagène sans étiquette. Bien et lentement mélanger par pipetage, en évitant la formation de bulles d'air.
5. Ajouter des cellules en suspension dans le volume approprié de milieu de cellules réfrigérées sans FBS au mélange TAMRA-collagène pour obtenir une densité cellulaire finale de 10 ⁵ cellules / ml et une concentration finale en collagène de 2 mg / ml. Par exemple, pour 1 ml de 2 mg / ml TAMRA-Collagène Mix, ajouter 388,81 pi de milieu contenant 10 cellules ^5. Bien et lentement mélanger par pipetage, en évitant la formation de bulles d'air. Confirmez pH en testant 10 pl du mélange sur un test pH svoyage.
6. Ajouter 100 ul de gouttes TAMRA-Collagène Mix sur des boîtes à fond de verre et lui permettre de polymériser à température ambiante pendant 30-45 min. 100 ul de gouttes de collagène ont un diamètre typique de 7 mm et sont de 2 mm de hauteur. Lorsque polymérisé, le collagène se transforme en un gel blanc-ish. Remarque: Permettre le collagène de polymériser sans fermer la coupelle permet d'éviter la formation d'un film d'eau autour de la goutte de collagène, ce qui réduit le détachement du verre. Pour améliorer l'adhérence, de la vaisselle en verre peuvent être revêtues de poly-L-lysine à 100 pg / ml.
7. Ajouter délicatement milieu de culture suffisant pour couvrir les collagène / cellule gouttes. Évitez les flux élevés de médias ou de mouvements brusques depuis gouttes de collagène peuvent se détacher facilement. Gardez à 37 º C à 10% de CO ₂ de l'air humidifié pendant suffisamment de temps pour les cellules de migrer dans la matrice (en général 1-3 jours).

3. 3D Matrices TAMRA-collagène embarqués Spheroids cellulaires

1. Calculer le volume de 2 mg / ml TAMRA-Collagène Mix nécessaire pour l'expérience. Toujours préparer plus de 20% pour tenir compte de pipetage pertes dues à la viscosité élevée de collagène.
2. Préparer une solution stock de 10x PBS et 1 N NaOH. Filtrez-stériliser et conserver à 4 º C. De ce point, toutes les opérations sont effectuées sur la glace, sauf indication contraire et dans des conditions stériles.
3. Mélanger 10x PBS, 1 N NaOH et médias cellulaires sans FBS en quantités suffisantes pour atteindre la concentration de collagène désiré et pH 7,4. Par exemple, pour un volume final de 1 ml de TAMRA-Collagène Mix à pH 7,4, mélanger 100 pi de PBS 10X, 5 pl de NaOH 1 N et 388,81 pi de milieu. Mélangez bien.
4. Ajouter les volumes appropriés de collagène TAMRA-étiqueté et non étiqueté collagène dans un rapport 1:6 à obtenir une concentration en collagène total et final de 2 mg / ml. Par exemple, pour un volume final de 1 ml de 2 mg / ml TAMRA-Collagène Mix, ajouter 90,48 pi de 3,68 mg / ml de collagène TAMRA marqué et 415,71 pi de 4,01 mg / ml de unlacollagène beled. Bien et lentement mélanger par pipetage, en évitant la formation de bulles d'air. Confirmez pH en testant 10 pl du mélange sur une bandelette de test de pH.
5. Ajouter 100 ul de gouttes TAMRA-Collagène Mix sur des boîtes à fond de verre et lui permettre de déclencher la polymérisation pendant 2-5 min. Cela aidera à éviter la submersion des sphéroïdes en augmentant légèrement la viscosité du gel. 100 ul de gouttes de collagène ont un diamètre typique de 7 mm et sont de 2 mm de hauteur.
6. Recueillir un sphéroïde cellulaire et le placer sur une boîte de Petri propre. Enlever tout excédent de liquide et remettre en suspension dans 10 pi de TAMRA-Collagène Mix. Ceci est important pour éviter la dilution du collagène avec les médias cellulaires.
7. Avec une pipette P20, recueillir le collagène suspendu sphéroïde et placez-le sur le dessus du centre de la pl chute de Mix 100 TAMRA-collagène. Note: Ne placez pas plus d'un sphéroïde par goutte de collagène, car ils peuvent affecter l'autre la capacité d'envahir et / ou migrer.
8. Autoriser le TAMRA-Collagène Mix de polyMérize à température ambiante pendant 30 à 45 min. Lorsque polymérisé, le collagène se transforme en un gel blanc-ish. Remarque: Permettre le collagène de polymériser sans fermer la coupelle permet d'éviter la formation d'un film d'eau autour de la goutte de collagène, ce qui réduit le détachement du verre. Pour améliorer l'adhérence, de la vaisselle en verre peuvent être revêtues de poly-L-lysine à 100 pg / ml.
9. Ajouter délicatement milieu de culture suffisant pour couvrir le collagène / sphéroïdes gouttes. Évitez les flux élevés de médias ou de mouvements brusques depuis gouttes de collagène peuvent se détacher facilement.
10. Gardez à 37 º C à 10% de CO ₂ de l'air humidifié pendant suffisamment de temps pour que les cellules envahissent / migrent dans la matrice (en général 1-3 jours).

4. Immunofluorescence 3D

1. Retirez délicatement les milieux cellulaires et rincer les matrices de collagène contenant des cellules / sphéroïdes avec PBS.
2. Simultanément fixer et extraire les cellules en incubant avec du tampon d'extraction / de fixation (PFA 4%, 0,3% de Triton X-100, 5% de saccharose dans PBS) pendant 5 min. Compléter le tampon avec 2 uM Phalloidin et 2uM Taxol pour la visualisation des cytosquelette ou des protéines associées cytosquelette.
3. En outre fixer les cellules avec PFA 4%, 5% de saccharose dans du PBS pendant 30 min. Rincer avec 0,05% de Tween 20 dans du PBS.
4. Préparer des solutions d'anticorps primaires dans PBS. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant au moins 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 º C. Assurez-vous d'ajouter suffisamment de solution pour couvrir la perte de collagène entier. Pour une boîte de 35 mm à fond de verre, de 1,5-2 ml de solution sera nécessaire. Remarque: Pour réduire le volume de la solution d'anticorps, une barrière insoluble dans l'eau, comme une ligne de cercle de la graisse de silicone ou une bague PDMS, peut être placé autour de la goutte de collagène.
5. Laver 3x 30 min avec 0,05% de Tween 20 dans du PBS.
6. Préparer des anticorps secondaires conjugués, Alexa solutions DAPI phalloïdine Alexa conjugué et PBS. Incuber les cellules avec les anticorps secondaires appropriés pendant 2 h à température ambiante.
7. Laver 3x 30 min avec 0,05% de Tween 20 dans du PBS.
8. Enlever l'excès de liquide, ajouter suffisamment de montage médias pour remplir le bas fond du plat en verre (environ 500 pi) et placer une lamelle 24 mm sur le dessus pour sceller. Ne pas enfoncer la lamelle à éviter de compresser la chute de collagène et d'endommager l'organisation 3D.

5. Imagerie de l'échantillon

Microscopes confocaux disques classiques ou de filature peuvent être utilisés. Un système inversé doit de préférence être utilisé pour déterminer la distance des cellules imagées à partir du bas de la vitre. Le système utilisé pour ce travail est un disque en rotation inversé confocal équipé d'un 40X/1.3NA et un 60X/1.4NA objectifs à immersion d'huile (travail distances de 200 um et 130 um, respectivement), un appareil photo CoolSNAP HQ2 Photometrics, 1392 x 1040 la matrice d'imagerie, 6,45 x 6,45 pixels um et contrôlées par un logiciel d'imagerie Metamorph. 405 nm, 491 nm, 561 nm et 633 nm lasers sont généralement utilisés à la puissance de 30-50%, le gain de 1 et de 2 binningx 2 pour réduire les temps d'exposition. Le microscope est également équipé d'une lampe au mercure et les cubes de filtre pour DAPI (EXC 400 à 418 nm; lui 450-465), FITC (HT 478-495; em 510-555) et Texas Red (HT 560-580; em 600 -650) à utiliser avec l'oculaire.

1. Utilisation de la lampe fluorescente, de placer l'objectif 40X au milieu de la perte de collagène. Obtenez une vue d'ensemble de l'échantillon, à la fois dans l'axe XY et dans l'axe z. Veillez à ne pas s'écarter de plus de 100 um à partir du bord de gel sur l'axe xy lors de l'acquisition des images pour éviter les effets de bord. Quand sphéroïdes d'imagerie, assurez-vous qu'ils sont sous la distance de travail objectif. Objectif de changement si nécessaire.
2. Passez en mode d'imagerie confocale en direct. En utilisant le laser de 561 nm de visualiser le collagène TAMRA-marquée, à partir du fond de verre déterminer la valeur de z à laquelle les fibres de collagène commencent à apparaître. C'est le fond du substrat et z = 0.
3. Utilisation de la molette de mise au point, aller jusqu'à 100 um à partir de z = 0. Seules les cellules à Z = 100 umou au-dessus doit être imagée pour éviter les effets de tension à partir du fond de verre rigide.
4. Sélectionnez les cellules à l'image. Optimiser les temps d'exposition de la caméra et la puissance du laser pour chaque longueur d'onde. Temps d'exposition typiques de DAPI et Alexa-488 Phalloidin sont entre 100-200 ms. Les temps d'exposition pour la coloration des anticorps peuvent varier.
5. Le mode live confocale en utilisant le laser approprié pour visualiser le phalloïdine coloration et en utilisant la molette de mise au point, de définir l'intervalle de série Z en définissant des valeurs z supérieure et inférieure de courant.
6. Définissez la taille z-étape. Pour 40x, utilisez 1 um. Pour 60X, utiliser 0,5 um. Commencez acquisition.

Representative Results

Étiquetage queue de rat collagène I avec TAMRA permet une préparation facile et la visualisation des réseaux de collagène 3D. Lente polymérisation à manger résultats de température dans la formation de réseaux de collagène avec l'organisation comparable à ceux trouvés in vivo ^10.

Nous présentons ici un protocole d'immunofluorescence du cytosquelette des cellules CT26 de cancer, tant sphéroïdes et comme des cellules individuelles. Afin de mieux préserver le cytosquelette, les tampons sont complétées par des non étiqueté phalloïdine et le taxol, des médicaments connus pour stabiliser F-actine et les microtubules, respectivement. En outre, les cellules sont simultanément fixes et extraits de supprimer les piscines de tubuline non polymérisée cytosolique qui pourraient interférer avec la visualisation des microtubules individuels. Cette technique peut également être utilisée pour visualiser des protéines associées au cytosquelette. Quand en 3D, les cellules CT26 présentent une morphologie typique mésenchymateuses caractérisé par une forme allongéecorps de la cellule, incliné avec F-actine riches saillies cellulaires qui ressemblent filopodia et lamellipode (figures 1 et 2). Cette morphologie allongée est encore plus évidente dans les cellules qui tentent d'échapper à sphéroïdes cellulaires en envahissant la matrice de collagène (figure 2). Coloration des microtubules en utilisant un anticorps anti-tubuline représente un réseau de microtubules bien conservé et organisé (figures 1 et 2). Cette forme de la cellule diffère grandement de celui des cellules CT26 dans des substrats 2D, où ils ont généralement plusieurs bords d'attaque avec grand large lamellipode plat et bien définis filopodia ^10.

Pour traiter les images acquises dans ce travail, Imaris a été utilisé. Ce logiciel convertit automatiquement le grand acquis z-piles dans une projection 3D de faciliter la navigation et la visualisation sur tous les plans (XY, XZ et YZ) et des angles différents (figures 1, 2 et 3, orthogonal constatations). En utilisant la fonction "3D des cultures", des avions z inutiles au-dessus ou au-dessous de la région des intéressés peuvent être enlevés. Comme représenté sur la figure 3, il est crucial d'analyser les piles z recueillies auprès de tous les avions de vue d'assurer une répartition uniforme 3D des cellules. Dans ce cas, CT26 cellules cultivées en sphéroïdes semblent envahir une matrice de collagène 3D largement lorsque visualisé comme une projection xy maximale. Cependant, une vue XZ révèle que toutes les cellules envahissent un intervalle z restreint en comparaison avec le volume sphéroïde, suggérant une région préférentielle de l'invasion. Ce sphéroïde est en effet trop proche du fond de verre de la vaisselle et des cellules déplacé rapidement vers et sur le substrat rigide 2D.

Figure 1. Cytosquelette de cellules CT26 cellules cancéreuses intégré dans TAMRA marqué collagène I. Colsur l'adénocarcinome des cellules CT26 ont été intégrés comme des cellules individuelles dans 2 mg / ml TAMRA marqué collagène de type I (rouge). Images par immunofluorescence de cultures colorées avec un anticorps de la tubuline en microtubules label (bleu), Alexa-488 phalloïdine de visualiser la F-actine (vert) et DAPI pour la coloration nucléaire (cyan). Image 3D correspond à xy projection maximale de z-piles de 38 um. XZ orthogonale (en bas de fusion) et yz (droit de Merge) fusionnent vues. Barre d'échelle, 20 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2. Cytosquelette des cellules CT26 cellules cancéreuses envahissent collagène I. cellules CT26 TAMRA marquées cultivées comme sphéroïdes cellulaires ont été intégrés dans 2 mg / ml TAMRA marqué collagène de type I (rouge). Après 2 jours de culture, les cellules ont commencé àvading la matrice de collagène 3D, en s'éloignant de la sphéroïde cellulaire. Images par immunofluorescence de cultures colorées avec un anticorps de la tubuline en microtubules label (bleu), Alexa-488 phalloïdine de visualiser la F-actine (vert) et DAPI pour la coloration nucléaire (cyan). Image 3D correspond à xy projection maximale de z-piles de 66 um. XZ orthogonale (en bas de fusion) et yz (droit de Merge) fusionnent vues. La barre d'échelle, 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3. CT26 cellules invasion en collagène de type I dépend de la distance de verre. Cellules CT26 ont été cultivées en sphéroïdes cellulaires et incorporé de 2 mg / ml de collagène I. Après 2 jours de culture, les cellules considérablement éloignés de la sphéroïde cellulaire, pas en envahissant til matrice de collagène 3D, mais en rampant sur le verre rigide 2D. Images de fluorescence de cultures colorées avec Alexa-488 phalloïdine de visualiser la F-actine. Une) image en 3D correspondant à xy projection maximale de z-stacks de 200 um. B) Orthogonal de vue XZ. La barre d'échelle, 150 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Le protocole décrit ici pour identifier fluorescence collagène I en utilisant TAMRA fournit une excellente méthode pour permettre la visualisation facile de l'organisation du réseau de collagène, en utilisant un microscope confocal équipé en standard d'un laser 561 nm. Un avantage de cette technique comparant à microscopie confocale de réflectance est la capacité de fibres de collagène d'image plus profondément dans la matrice 3D. L'intensité et le contraste de la réflexion des fibres diminue de façon importante avec la profondeur due à l'absorption de la lumière laser et de la dispersion. En outre, l'orientation des fibres de collagène peut être un handicap majeur lors de l'utilisation microscopie confocale de réflectance, car les fibres alignées autour de 50 ° par rapport au plan d'imagerie sont totalement inaperçue. Fibres marqués par fluorescence sont détectés avec une luminosité similaire, indépendamment de leur orientation ^20. Une autre méthode qui a été de plus en plus utilisée pour visualiser des faisceaux de collagène, à la fois in vitro et in vivo, est en deuxième génération harmoniquetion (SHG). Ce processus est basé sur l'émission de signaux par des structures non-centrosymétriques, comme le collagène ²¹ SHG. Cependant, SHG nécessite un microscope multiphotonique, qui ne fait pas partie de l'équipement d'imagerie de laboratoire standard.

L'utilisation de TAMRA comme un fluorophore n'est pas exclusive. D'autres fluorophores, comme Cy2, Cy5 ou la famille Fluor Alexa, disponible dans le commerce dans les kits d'étiquetage de protéines, peuvent être utilisés pour le collagène de l'étiquette dans la couleur la plus pratique pour l'utilisateur. Un autre avantage de l'utilisation de collagène fluorescent est le potentiel pour être combinés avec des cellules transfectées avec des protéines par fluorescence taggés pour imagerie time-lapse, à suivre de près les interactions cellule-matrice ou des déformations de la matrice de cellules induites. Il peut également être utilisé pour les fines lamelles de revêtement de collagène dans des expériences 2D.

Intégration de cellules dans des matrices 3D est une procédure délicate, en particulier lors de l'utilisation de grands sphéroïdes, car ils ont tendance à s'enfoncer en raison de la gravité. Aussi,les cellules sont généralement attirés par des environnements sévères et lorsque noyées dans les régions de la matrice 3D suffisamment près de la lamelle de verre de sentir l'augmentation de la tension induite par le verre, ils se déplacent vers le substrat rigide 2D. Une astuce technique pour aider à éviter la submersion de grandes sphéroïdes est de permettre au collagène de polymériser brièvement (2-5 min) avant de placer le sphéroïde au-dessus de la chute de la matrice. Ce sera légèrement augmenter la viscosité du gel, l'augmentation du temps d'amortissement. Néanmoins, il est recommandé de préparer plusieurs répétitions pour augmenter les chances de succès. D'autre part, il est important de garder les cellules sous la distance de travail objectif. Des objectifs moins élevés d'agrandissement ont généralement plus grandes distances de travail et peuvent être utilisés pour les images ensemble sur le terrain, par exemple, de comparer invasion de différents types de cellules à partir d'un sphéroïde. Lorsque des images haute résolution sont nécessaires, l'eau les objectifs d'immersion, avec de plus grandes distances de travail, sont fortement recommandés.

10. Nous n'essayons pas de créer un protocole général de immunocoloration 3D. Comme en 2D, chaque anticorps peut exiger une procédure de fixation différente et la conception d'un protocole spécifique pour chaque anticorps peut être besoin d'd. Ce protocole est présenté comme point de départ, et il est suggéré que les utilisateurs comprennent un phalloïdine fluorescent coloration pour donner une idée de la forme des cellules et la localisation dans la matrice.

Matrices de collagène épaisses sont un bon simplifiée système in vitro pour étudier la migration cellulaire dans un ECM physiologique. Bien qu'il manque la complexité chimique et physique d'un tissu vivant, ce système permet la manipulation des propriétés ECM spécifiques, tels que la taille des pores, l'élasticité et la réticulation. Nous espérons que ces protocoles contribueront à une meilleure description de la composition moléculaire, la localisation et les fonctions des structures cellulaires pendant de nombreuses années analysées en 2D et d'améliorer notre connaissance du comportement des cellules en 3D.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane