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Medicine

Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Fluoreszenz beschriften Kollagen, das weiter für beide fix und Live-Darstellung von 3D-Zellkulturen verwendet werden kann. Wir bieten auch ein optimiertes Protokoll endogene Proteine ​​des Zytoskeletts von Zellen in 3D-Umgebungen kultiviert visualisieren.

Abstract

Die Zellmigration wurde traditionell in 2D Substraten untersucht. Es hat sich jedoch zunehmend klar, dass es notwendig ist, die Zellmigration in geeigneter 3D-Umgebungen, die besser ähneln die Dimensionalität der physiologischen Prozesse in Frage zu untersuchen. Wandernde Zellen können im Wesentlichen in ihrer Morphologie und die Art der Migration unterscheiden sich je nachdem, ob sie auf 2D-oder 3D-Substrate bewegt. Aufgrund technischer Schwierigkeiten und Inkompatibilitäten mit den meisten Standard-Protokolle, strukturelle und funktionelle Analyse von Zellen in 3D-Matrices eingebettet bleibt ungewöhnlich. Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Erstellung und Darstellung von 3D-Krebs Zellkulturen, entweder als einzelne Zellen oder Kügelchen. Als geeignete ECM Substrat für Krebs Zellmigration, verwenden wir nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I polymerisiert bei Raumtemperatur und fluoreszenzmarkierte, um die Visualisierung mit Standard Konfokalmikroskopen erleichtern. Diese Arbeit umfasst auch eine Protocol für 3D Immunfluoreszenz Kennzeichnung von endogenen Zelle Zytoskeletts. Mit diesen Protokollen wir hoffen auf eine bessere Beschreibung der molekularen Zusammensetzung, Lokalisierung und Funktionen der zellulären Strukturen in 3D beitragen.

Introduction

Das Feld der Zellwanderung wurde in der brandneuen dritten dimensionalen Welt trotzen. Es ist intuitiv zu Zellwanderung in einer Umgebung, die am ehesten die physiologischen und somit dreidimensionale (3D) zu studieren. Doch aufgrund technischer Einschränkungen haben die meisten Zellwanderung Studien durchgeführt, die Analyse Zellbewegung über starren zweidimensionalen (2D)-Substraten, entweder unbehandelt oder beschichtet mit entsprechenden extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine.

Die ersten Studien gewidmet Zellwanderung im dreidimensionalen Kollagen Gittern zurück über 20 Jahre 1-3. Doch erst in den letzten 5 Jahren ist klar geworden, dass wandernde Zellen konnten im Wesentlichen in ihrer Morphologie und die Art der Migration abhängig von der Dimensionalität des Substrats unterscheiden. In 2D Zellen nur dem Substrat in Berührung mit ihren ventralen Fläche mit fokalen Adhäsionen, was zur Bildung von breiten, flachen Vorsprünge (lamellipodia) miteingebettet Finger Fortsätze (Filopodien) an deren Vorderkante. Diese Strukturen, die mit Stress Fasern, die die Zelle vor Verbindung mit der Hinterkante, wird angenommen, dass entscheidend für Zellbewegung in 2D. In 3D-Matrices sind die Zellen im Allgemeinen länglichen, mit der gesamten Zelloberfläche Kontaktieren der ECM, die zu erheblichen Veränderungen in der Bildung und funktionelle Bedeutung von vielen dieser Strukturen. Umgekehrt gewinnen andere zelluläre Funktionen Relevanz in 3D Migration, wie nukleare Verformung und Strukturen in ECM Umbau 4 beteiligt.

Trotz dieser bekannten morphologischen Veränderungen sowie Unterschiede in der Migration Modi 5-7, die je nach dem ECM-und Zelltypen, strukturelle und funktionelle Analyse von Zellen in 3D-Matrices eingebettet bleibt ungewöhnlich. Arbeiten mit dicke und dichte 3D-Matrices trägt technischen Schwierigkeiten, wie hochauflösende Mikroskopie und Inkompatibilitäten mit den meisten standard Protokolle für 2D-Kulturen optimiert, wie Immunfluoreszenz Kennzeichnung von endogenen Proteinen. Auch, weil die Verwendung von 3D-Matrices ist ein relativ neuer Ansatz sind die Forscher noch untersuchen die besten Voraussetzungen, um ähneln spezifische in vivo Situationen, wie dem normalen Stromazellen Architektur verschiedener Gewebe Organe oder der ECM Organisation um einen Tumor. Diskrepanzen in den Ergebnissen von verschiedenen Gruppen über, zum Beispiel, haben Krebszelle Modi der Migration oder die Existenz von fokalen Adhäsionen, einige Kontroversen 8 erzeugt. Mit viel Aufwand wurde kürzlich eingeweiht, um einen Konsens in Bezug auf ECM chemische Natur, Porengröße, Faser Dicke und Steifigkeit Matrix zu erreichen. Viele verschiedene Arten von 3D-ECM werden derzeit verwendet, variierend von Zellen abgeleiteten Matrizen im Handel erhältlich Matrigel, pepsinized Rinder-Kollagen I oder nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I. Jede dieser Matrizen hat bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften und man muss Beziehungente die Matrix der Wahl, um den physiologischen Prozess untersucht. Darüber hinaus kann die Porengröße und Faserdicke auf Polymerisationsbedingungen wie pH-Wert und Temperatur 9,10 abhängen. Die Bindung an und die Entfernung von starren Substraten wie Glas, können auch die elastischen Eigenschaften der Matrix 10,11.

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Erstellung und Darstellung von 3D-Krebs Zellkulturen, entweder als einzelne Zellen oder Kügelchen. Verfahren zur Herstellung von Krebszellen Sphäroide wurden bisher beschrieben, die populärsten ist der hängende Tropfen Methode 12,13 und die Agarose-beschichtete Platte 14 Verfahren. Als geeignete ECM Substrat für Krebszelle Migration wird nonpepsinized Rattenschwanzkollagen I bei Raumtemperatur polymerisiert bei 2 mg / ml verwendet. Nonpepsinized Säure extrahierten Kollagen I aus Rattenschwanz behält beide N-und C-terminalen Telopeptide, nichthelicale Teile des Kollagen-Molekül verantwortlich für natives Kollagen intermolekularedere Vernetzung und Stabilität fibrilar 15. Zusammen ermöglichen diese Bedingungen die Bildung von Kollagen-Netzwerke, die am ehesten Ähnlichkeit mit den in vivo 10 beobachtet. Um die Visualisierung der Kollagenfasern, sowohl in fixierten und lebenden Kulturen zu ermöglichen, wird ein ausführliches Protokoll vorgesehen, um Fluoreszenz beschriften Kollagen in vitro 10 mit 5 - (und-6)-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Succinimidylester. Dieses Protokoll wurde von Baici et al angepasst. 16,17, wo Fluoresceinisothiocyanat verwendet wird, um lösliche Kollagen-Moleküle zu markieren. Beispiel Fluorescein ist TAMRA eine Amino-reaktiven Fluoreszenzfarbstoff mit protonierten aliphatischen Aminogruppen von Proteinen, wie z. B. die freie Aminogruppe am N-Terminus und, noch wichtiger, der Seite Aminogruppe von Lysin reagiert. Diese Reaktion tritt nur bei basischem pH-Wert, wenn der Lysin-Aminogruppe in der protonierten Form. Neben TAMRA stabiler als Fluorescein überZeit fällt seine Emissionsspektren auf dem orange / roten Bereich (ex / em = 555/518 nm), die sinnvollerweise für Live Cell Imaging von GFP-markierten Proteine ​​können kombiniert werden. Verwendung von löslichem Kollagen markierten Moleküle mit Amino-Reaktivfarbstoffen hat keinen Einfluss auf die Polymerisation oder die Dichte, Porengröße und Vernetzen Status der Kollagenmatrix 10,16,18,19.

Dieses Protokoll umfasst ferner ein Verfahren für die 3D-Immunfluoreszenz-Markierung von endogenen Proteinen, die weiter optimiert wurde, um die Zytoskelett oder Zytoskelett assoziierte Proteine ​​zu markieren. Der letzte Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf Methoden, um hochauflösende Bilder von 3D-Kulturen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie mit reduzierter Beitrag von starren Deckgläschen auf die Kollagen-Matrix Spannung zu erwerben.

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Protocol

1. TAMRA-Kollagen I Labeling

  1. Bereiten Sie eine 10 mg / ml Lösung TAMRA durch Zugabe von 2,5 ml DMSO mit dem mitgelieferten 25 mg TAMRA Pulver. Löse es durch Vortexen bis zur vollständigen Auflösung. Lagerung bei -20 º C und vor Licht schützen.
  2. Bereiten 2 l Labeling Buffer (0,25 M NaHCO 3, 0,4 M NaCl). Der pH-Wert auf 9,5 mit 10 M NaOH-Lösung. Halten bei 4 º C. Ab diesem Zeitpunkt werden alle Operationen bei 4 º C durchgeführt soweit nicht anders angegeben und fluoreszierendes Material von Licht mit Aluminiumfolie geschützt ist.
  3. Füllen Sie eine 1 ml Einwegspritze mit 1 ml hochkonzentrierte Rattenschwanzkollagen I-Lösung. Hohe Konzentration Kollagen-Lösungen werden in der Regel in Konzentrationen von etwa 10 mg / ml zur Verfügung gestellt und sind sehr viskos. Seien Sie sicher, es langsam zu manipulieren, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
  4. Mit einer 21 G Kanüle injizieren das Kollagen in eine vorgetränkten 3 ml Dialysekassette von 10.000 MWCO abgeschnitten. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden damaGing der Membran mit der Nadel. Entfernen Sie alle Luft aus dem Dialysekassette durch Hochziehen Kolben der Spritze. Dialysieren es über Nacht gegen 1 l Labeling Buffer.
  5. Mischen Sie 100 ul von 10 mg / ml Lösung TAMRA mit 900 ul Labeling Buffer. Hinweis: Dies sollte sowohl mit TAMRA Lösung und Labeling Buffer bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da DMSO gefriert bei 4 º C. Nach dem Mischen, bringen die verdünnte Lösung TAMRA wieder auf 4 º C.
  6. Entfernen Sie vorsichtig das Kollagen aus der Dialyse-Kassette mit einer 2 ml Einwegspritze mit einer 21 G Kanüle. Mischen Sie 1 ml der dialysierten Kollagen-Lösung mit 1 ml der verdünnten Lösung durch Pipettieren TAMRA.
  7. Übertragen Sie die Kollagen / TAMRA Mischung in eine 2 ml Mikrozentrifugenröhrchens und Inkubation über Nacht mit Drehung.
  8. Übertragen Sie die 2 ml TAMRA-markiertes Kollagen in einer vorgetränkten 3 ml Dialysekassette und Dialyse gegen 1 l Labeling Buffer um den Überschuss an freiem Farbstoff zu entfernen Übernachtung.
  9. Um die TAMRA-lab wiederherstelleneLED Kollagen an das Kollagen ursprüngliche Lösung, platzieren Sie den Dialyse-Kassette in 1 L von 0,2% (v / v) Essigsäure-Lösung, pH 4 und Dialyse über Nacht.
  10. Messen der Endvolumen des TAMRA-markiertes Kollagen und berechnet seine Endkonzentration angesichts der ursprünglichen Volumens und der Konzentration der Collagen-Lösung verwendet. Lagern bei 4 º C.

2. 3D TAMRA-Kollagen-Matrices mit Embedded Einzelzellen

  1. Berechnen des Volumens von 2 mg / ml Collagen TAMRA-Mix, die für das Experiment. Immer werden 20% mehr zu berücksichtigen Pipettierverlusten aufgrund der Kollagen hohe Viskosität.
  2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10x PBS und 1 N NaOH. Filtern sterilisieren und bei 4 º C zu halten Von diesem Punkt werden alle Operationen auf Eis durchgeführt, wenn nicht anders angegeben und unter sterilen Bedingungen.
  3. Mix 10x PBS und 1 N NaOH in angemessenen Mengen, um die gewünschte Kollagen-Konzentration und pH 7,4 zu erreichen. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 mlvon TAMRA-Collagen Mix bei pH 7,4, kombiniert 100 ul 10x PBS mit 5 ul 1N NaOH. Gut mischen.
  4. Fügen Sie die entsprechenden Volumina der beiden TAMRA-markiertes Kollagen und unmarkiertem Kollagen in einer im Verhältnis 1:6, um eine endgültige insgesamt Kollagen-Konzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 ml 2 mg / ml Collagen TAMRA-Mix, fügen 90,48 ul von 3,68 mg / ml TAMRA-markiertes Kollagen und 415,71 ul von 4,01 mg / ml unmarkiertes Kollagen. Gut mischen und langsam durch Pipettieren und vermeidet die Bildung von Luftbläschen.
  5. Hinzufügen von Zellen in dem entsprechenden Volumen gekühlt Zelle ohne FBS suspendiert an das TAMRA-Kollagen-Mischung, um eine endgültige Zelldichte von 10 5 Zellen / ml und einen End Kollagen-Konzentration von 2 mg / ml zu erhalten. Zum Beispiel, für 1 ml 2 mg / ml Collagen TAMRA-Mix, fügen 388.81 ul Medium mit 10 5 Zellen. Gut mischen und langsam durch Pipettieren und vermeidet die Bildung von Luftbläschen. Bestätigen Sie durch Testen pH 10 ul der Mischung auf einen pH-Test sReise.
  6. Je 100 ul Tropfen TAMRA-Collagen Mix auf Petrischalen mit Glasboden und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 30-45 min polymerisieren. 100 ul Kollagen Tropfen haben einen typischen Durchmesser von 7 mm und 2 mm hoch. Wenn polymerisiert, schaltet sich das Kollagen in einem weißen Gel-ish. Anmerkung: Unter Berücksichtigung der Kollagen ohne Schließen der Schale polymerisiert wird die Bildung eines Wasserfilms auf der Kollagen Tropfen vermeiden, reduziert die Loslösung von dem Glas. Um die Einhaltung zu erhöhen, kann Glasschalen mit Poly-L-Lysin bei 100 ug / ml beschichtet werden.
  7. Vorsichtig ausreichend Kulturmedium, um die Kollagen / Zelle Tropfen bedecken. Vermeiden Sie hohe Flüsse von Medien oder abrupte Bewegungen seit Kollagen Tropfen leicht lösen kann. Halten bei 37 ° C in 10% CO 2 befeuchteten Luft genügend Zeit, damit die Zellen in der Matrix (in der Regel 1-3 Tage) migrieren.

3. 3D TAMRA-Kollagen-Matrices mit Embedded Sphäroide

  1. Berechnen Sie das Volumen von 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix notwendig für das Experiment. Immer werden 20% mehr zu berücksichtigen Pipettierverlusten aufgrund der Kollagen hohe Viskosität.
  2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10x PBS und 1 N NaOH. Filtern sterilisieren und bei 4 º C zu halten Von diesem Punkt werden alle Operationen auf Eis durchgeführt, wenn nicht anders angegeben und unter sterilen Bedingungen.
  3. Mix 10x PBS, 1 N NaOH und Zell-Medium ohne FBS in angemessenen Mengen erzielen die gewünschte Kollagen-Konzentration und pH 7,4. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 ml TAMRA-Collagen Mix bei pH 7,4, kombiniert 100 ul 10x PBS, 5 ul 1 N NaOH und 388.81 ul Medien. Gut mischen.
  4. Fügen Sie die entsprechenden Volumina der beiden TAMRA-markiertes Kollagen und unmarkiertem Kollagen in einer im Verhältnis 1:6, um eine endgültige insgesamt Kollagen-Konzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Zum Beispiel für ein Endvolumen von 1 ml von 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix, fügen 90.48 ul von 3,68 mg / ml TAMRA-markiertes Kollagen und 415,71 ul von 4,01 mg / ml UNLABeled Kollagen. Gut mischen und langsam durch Pipettieren und vermeidet die Bildung von Luftbläschen. Bestätigen Sie durch Testen pH 10 ul der Mischung auf einen pH-Teststreifen.
  5. Je 100 ul Tropfen TAMRA-Collagen Mix auf Petrischalen mit Glasboden und lassen Sie es für 2-5 min Polymerisation zu initiieren. Dies wird helfen, Untergang der Sphäroide durch eine geringfügige Erhöhung der Gelviskosität verhindern. 100 ul Kollagen Tropfen haben einen typischen Durchmesser von 7 mm und 2 mm hoch.
  6. Sammle eine Zelle Sphäroid und legen Sie sie auf eine saubere Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges von flüssigen und resuspendieren es in 10 ul TAMRA-Collagen Mix. Dies ist wichtig, um eine Verdünnung des Kollagens mit Zellmedium verhindern.
  7. Mit einer Pipette P20, sammeln das Kollagen suspendiert Sphäroid und legen Sie sie in der Mitte oben auf dem 100 ul TAMRA-Collagen Mix Drop. Hinweis: Legen Sie nicht mehr als eine pro Sphäroid Kollagen Tropfen, da sie sich gegenseitig Kapazität, um einzudringen und / oder Migration beeinflussen kann.
  8. Lassen Sie die TAMRA-Collagen Mix zu PolyMerize bei Raumtemperatur für 30-45 min. Wenn polymerisiert, schaltet sich das Kollagen in einem weißen Gel-ish. Anmerkung: Unter Berücksichtigung der Kollagen ohne Schließen der Schale polymerisiert wird die Bildung eines Wasserfilms auf der Kollagen Tropfen vermeiden, reduziert die Loslösung von dem Glas. Um die Einhaltung zu erhöhen, kann Glasschalen mit Poly-L-Lysin bei 100 ug / ml beschichtet werden.
  9. Vorsichtig ausreichend Kulturmedium, um das Kollagen / Sphäroide Tropfen bedecken. Vermeiden Sie hohe Flüsse von Medien oder abrupte Bewegungen seit Kollagen Tropfen leicht lösen kann.
  10. Halten bei 37 º C in 10% CO 2 befeuchteten Luft genügend Zeit für Zellen einzudringen / in der Matrix (in der Regel 1-3 Tage) zu migrieren.

4. 3D Immunfluoreszenzfärbungen

  1. Entfernen Sie vorsichtig die Zelle Medien und spülen Sie die Kollagen-Matrices mit Zellen / Sphäroide mit PBS.
  2. Gleichzeitig fixieren und zu extrahieren Zellen durch Inkubation mit Extraktion / Fixierung Puffer (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% Saccharose in PBS) für 5 min. Ergänzen Sie die Puffer mit 2 uM Phalloidin und 2 uM Taxol zur Visualisierung von Zytoskeletts oder Zytoskelett assoziierte Proteine.
  3. Weiterhin fixieren die Zellen mit 4% PFA, 5% Saccharose in PBS für 30 min. Spülen mit 0,05% Tween-20 in PBS.
  4. Bereiten Primärantikörper Lösungen in PBS. Inkubieren Zellen mit primären Antikörpern für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, genug, um die gesamte Lösung Kollagen Drop cover. Für eine 35 mm Glasboden Gericht, wird 1,5-2 ml Lösung notwendig sein. Hinweis: Um die Lautstärke der Antikörper-Lösung zu reduzieren, eine wasserunlösliche Barriere, wie eine Ringbahn Silikonfett oder einem PDMS-Ring, können rund um die Kollagen-Drop platziert werden.
  5. Waschen 3x 30 Min. mit 0,05% Tween-20 in PBS.
  6. Bereiten Alexa-konjugierten sekundären Antikörper, Alexa-Phalloidin und DAPI in PBS-Lösungen. Inkubieren Zellen mit den entsprechenden sekundären Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
  7. Waschen 3x 30 min mit 0,05% Tween-20 in PBS.
  8. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, fügen Sie genug Eindeckmitteln den Glasboden Schale unten (ca. 500 ul) füllen und legen Sie eine 24 mm Deckglas oben zu versiegeln. Drücken Sie nicht das Deckglas zu vermeiden Komprimieren des Kollagen Tropfen und Schäden an der 3D-Organisation.

5. Beispiel Imaging

Classic oder Kreiselscheibenapplikators konfokale Mikroskope verwendet werden. Eine invertierte sollte vorzugsweise verwendet, um den Abstand der abgebildeten Zellen aus dem Glasboden bestimmen. Das System für diese Arbeit verwendet wird, ist ein Inverted konfokale Spinning-Disk mit einem 40X/1.3NA und ein 60X/1.4NA Öl-Immersions-Objektive (Arbeitsabstand 200 um und 130 um, respectively), ein Photometrics CoolSNAP HQ2 Kamera, 1392 x 1040 ausgestattet Bildgebungsfeld, 6.45 x 6.45 Pixel um und kontrolliert durch Metamorph Imaging-Software. 405 nm, 491 nm, 561 nm und 633 nm Laser sind in der Regel bei 30-50% Energie, gewinnen 1 und Binning von 2x 2 zu verringern Belichtungszeiten. , FITC (EXC 478-495; em 510-555) und Texas Red (EXC 560-580;; Das Mikroskop ist auch mit einer Hg-Lampe und Filter Würfel für DAPI (em 450-465 exc 400-418 nm) ausgestattet em 600 -650), um mit dem Okular zu verwenden.

  1. Mit der Leuchtstofflampe, legen Sie das 40X-Objektiv in der Mitte des Kollagens Drop. Einen Überblick über die Probe, in der xy-Achse und in der z-Achse. Achten Sie darauf, nicht mehr als 100 um aus dem Gel Kante auf der xy Achse abweichen beim Erwerb der Bilder, um Randeffekte zu vermeiden. Bei der Abbildung Sphäroide, sicherzustellen, dass sie im Rahmen des Ziels Arbeitsabstand. Ändern Sie gegebenenfalls Ziel.
  2. Wechseln Sie in das konfokale Live-Imaging-Modus. Durch die Verwendung der 561 nm-Laser, um die TAMRA-markierten Collagen sichtbar zu machen, ausgehend von der Glasboden Bestimmung der Z-Wert bei der Kollagenfasern beginnen zu erscheinen. Dies ist das Substrat unten und z = 0 ist.
  3. Mit dem Fokusknopf, gehen bis 100 um von z = 0. Nur Zellen, bei z = 100 umoder höher sollte abzubildenden Spannung Effekte aus der starren Glasboden zu vermeiden.
  4. Markieren Sie die Zellen, um Bild. Optimieren Kamera Belichtungszeiten und Laserleistung für jede Wellenlänge. Typische Belichtungszeiten für DAPI und Alexa-488-Phalloidin sind zwischen 100-200 ms. Die Belichtungszeiten für die Antikörper-Färbung kann variieren.
  5. Auf konfokale Live-Modus mit dem entsprechenden Laser, um die Phalloidin Färbung und mit dem Fokusknopf visualisieren, definieren Sie die z-Serie Intervall, indem Sie oben und unten, um aktuelle Werte z.
  6. Definieren Sie die z-Schrittweite. Für 40X Ziele, verwenden 1 um. Für 60X, verwenden 0,5 um. Starten Sie die Erfassung.

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Representative Results

Beschriftung Rattenschwanz Kollagen I mit TAMRA ermöglicht eine einfache Erstellung und Visualisierung von 3D-Kollagen-Netzwerke. Langsame Polymerisation bei Raumtemperatur führt zur Bildung von Kollagen Netzwerke mit vergleichbaren Organisation zu den in vivo 10 vorhanden.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Immunfluoreszenzfärbung des Zytoskeletts von CT26 Krebszellen, sowohl als Sphäroide und als einzelne Zellen. Um eine bessere Erhaltung des Zytoskeletts sind Puffer mit unmarkiertem Phalloidin und Taxol, Drogen bekannt, F-Aktin und Mikrotubuli stabilisieren, bzw. ergänzt. Darüber hinaus werden die Zellen fixiert und gleichzeitig abgesaugt werden, um nicht polymerisierte cytosolischen Tubulin-Pools, die mit der Visualisierung der einzelnen Mikrotubuli können, zu entfernen. Dieses Verfahren kann ebenso verwendet werden, um Zytoskelett-Proteine ​​zu visualisieren. Wenn in 3D präsentieren CT26 Zellen eine typische mesenchymalen Morphologie durch einen langgestreckten gekennzeichnetZellkörper, bestückt mit F-Actin reichen zellulären Vorsprünge, die Filopodien und Lamellipodien (Abbildungen 1 und 2) ähneln. Dieses längliche Morphologie ist noch deutlicher in Zellen versuchen, zelluläre Sphäroide durch Eindringen in die Kollagen-Matrix (Abbildung 2) zu entkommen. Färbung der Mikrotubuli mit Hilfe eines Anti-Tubulin-Antikörper zeigt eine gut erhaltene und organisiert Mikrotubuli-Netzwerk (Abbildungen 1 und 2). Diese Zelle Form unterscheidet sich stark von der der CT26-Zellen in 2D Substrate, wo sie in der Regel mehrere Vorderkanten mit großen breiten flachen Lamellipodien und Filopodien 10 gut definiert.

Um die aufgenommenen Bilder in diesem Werk zu bearbeiten, wurde Imaris verwendet. Diese Software konvertiert die erworbenen großen z-Stacks in ein 3D-Projektion einfache Navigation und Visualisierung in allen Ebenen (xy, xz und yz) und unterschiedliche Winkel (Fig. 1, 2 und 3, orthogonal views). Mit dem "Crop 3D"-Funktion können unnötige z-Ebenen oberhalb oder unterhalb der Region interessierte entfernt werden. Wie in 3 dargestellt, ist es entscheidend, gesammelt z Stapel aus allen Ebenen der Ansicht zu analysieren, um ein einheitliches 3D-Verteilung der Zellen sicherzustellen. In diesem Fall scheint CT26 Zellen Sphäroide gezüchtet, um ein 3D Kollagenmatrix umfassend eindringen, wenn visualisiert als maximal xy-Projektion. Allerdings zeigt ein Blick xz, dass alle Zellen dringen eine eingeschränkte z-Intervall gegenüber dem Sphäroid Volumen, was auf eine bevorzugte Region der Invasion. Diese Sphäroid ist in der Tat zu nahe an dem Glas Boden der Schale und Zellen bewegt schnell auf und auf dem starren Substrat 2D.

Abbildung 1
Abbildung 1. Zytoskelett der Zellen CT26 Krebszellen in TAMRA-markiertes Kollagen I. Col eingebettetauf Adenokarzinom CT26-Zellen wurden als einzelne Zellen in 2 mg / ml TAMRA-markiertes Kollagen I (rot) eingebettet ist. Immunfluoreszenz Bilder von Kulturen mit Tubulin-Antikörper zur Markierung von Mikrotubuli (blau), Alexa-488-Phalloidin auf F-Actin (grün) und DAPI zur Kernfärbung (cyan) sichtbar gefärbt. 3D-Bild entspricht xy maximalen Projektion von z-Stapel von 38 um. Orthogonal xz (unten von Merge) und yz (rechts von Merge) verschmelzen Aussicht. Maßstab bar, 20 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 2
Abbildung 2. Zytoskelett von CT26-Zellen Krebszellen eindringenden TAMRA-markiertes Kollagen I. CT26-Zellen als zelluläre Sphäroide gezüchtet wurden 2 mg / ml TAMRA-markiertes Kollagen I (rot) eingebettet ist. Nach 2 Tagen in Kultur begonnen Zellenvading das Kollagen 3D-Matrix, eine Abkehr von der Zelle Sphäroid. Immunfluoreszenz Bilder von Kulturen mit Tubulin-Antikörper zur Markierung von Mikrotubuli (blau), Alexa-488-Phalloidin auf F-Actin (grün) und DAPI zur Kernfärbung (cyan) sichtbar gefärbt. 3D-Bild entspricht xy maximalen Projektion von z-Stapel von 66 um. Orthogonal xz (unten von Merge) und yz (rechts von Merge) verschmelzen Aussicht. Maßstab bar, 50 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 3
Abbildung 3. CT26 Zellen Invasion in Kollagen I ist abhängig von der Entfernung Glas. CT26-Zellen als zelluläre Sphäroide wurden gezüchtet und eingebettet in 2 mg / ml Kollagen I. Nach 2 Tagen in Kultur, Zellen deutlich entfernte sich von der Zell-Sphäroiden, nicht durch eine Invasion ter 3D-Kollagen-Matrix, sondern durch kriechen auf dem 2D starre Glas. Fluoreszenz-Bilder von Kulturen mit Alexa-488-Phalloidin an F-Actin visualisieren gefärbt. A) 3D-Bild entspricht xy maximalen Projektion von z-Stapel von 200 um. B) Orthogonal xz Aussicht. Maßstab bar, 150 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Das hier beschriebene Protokoll zur Fluoreszenz beschriften Kollagen I mit TAMRA bietet eine hervorragende Methode, um einfache Visualisierung des Kollagens Netzwerk-Organisation zu ermöglichen, durch die Verwendung eines Standard-konfokalen Mikroskop mit einer 561-nm-Laser ausgestattet. Ein Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu Reflexionsvermögen konfokale Mikroskopie ist die Fähigkeit, Bild Kollagenfasern tiefer in die 3D-Matrix. Die Intensität und der Kontrast der Fasern Reflexion deutlich sinkt mit der Tiefe durch Laserlicht Absorption und Streuung. Auch kann die Ausrichtung der Kollagenfasern ein großes Hindernis bei der Verwendung Reflexionsvermögen konfokale Mikroskopie, da Fasern um 50 ° von der Bildebene ausgerichtet völlig unbemerkt sind. Fluoreszenzmarkierten Fasern mit ähnlicher Helligkeit, unabhängig von ihrer Ausrichtung 20 erfasst. Ein weiteres Verfahren, das verwendet wurde, um zunehmend Kollagenbündel, sowohl in vitro als auch in vivo zu visualisieren, ist bei der zweiten Harmonischen genmenarbeit (SHG). Dieses Verfahren ist für die Emission von SHG-Signal durch zentrosymmetrischen Strukturen, wie Kollagen 21 basiert. Jedoch erfordert eine SHG Multiphotonen-Mikroskop, das nicht Teil der Standard-Lab-Bildgebung.

Die Verwendung von TAMRA als Fluorophor ist nicht exklusiv. Andere Fluorophore wie Cy2, Cy5 oder Alexa Fluor Familie, im Handel erhältlich in Protein Labeling Kits können zur Markierung von Kollagen in der bequemsten Farbe für den Benutzer verwendet werden. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von fluoreszierenden Kollagen ist das Potenzial, um mit Zellen mit Fluoreszenz-markierten Proteinen für Zeitraffer-Aufnahmen, transfiziert aufmerksam verfolgen Zell-Matrix-Wechselwirkungen oder Zell-Matrix-induzierte Verformungen kombiniert werden. Es kann auch für dünne Beschichtung Kollagen Deckgläser in 2D Experimente verwendet werden.

Einbetten Zellen in 3D-Matrices ist eine heikle Prozedur, insbesondere bei der Verwendung von großen Kügelchen, da sie eine Tendenz zu sinken aufgrund der Schwerkraft haben. AuchZellen sind in der Regel zu einem verstärkten Umgebungen angezogen und, wenn in den Gebieten der 3D-Matrix nahe genug an der Deckglas um den Anstieg der Spannung im Glas eingebettet induziert fühlen, bewegen sie sich in Richtung der starren 2D Substrat. Ein technischer Trick, um zu verhindern Untergang der großen Kügelchen ist es, dass das Kollagen zu polymerisieren kurz (2-5 min), bevor Sie das Sphäroid auf der Oberseite der Matrix Drop. Dies wird sich leicht erhöhen die Viskosität des Gels, die Erhöhung der Versenkung Zeit. Dennoch ist es ratsam, bereiten mehrere repliziert, um die Wahrscheinlichkeit auf Erfolg erhöhen. Auf der anderen Seite, ist es wichtig, um die Zellen unter dem Objektiv Arbeitsabstand zu halten. Objektive mit geringer Vergrößerung haben in der Regel größere Distanzen arbeiten und kann für die gesamte Gebiet von Bildern verwendet werden, zum Beispiel, um das Eindringen von verschiedenen Zelltypen aus einem Sphäroid vergleichen. Wenn Bilder mit höherer Auflösung benötigt werden, Wasserimmersionsobjektive, bei größeren Distanzen arbeiten, sind sehr zu empfehlen.

10 beschriften. Wir versuchen nicht, eine allgemeine 3D Immunfärbung Protokoll erstellen. Wie in 2D, kann jeder Antikörper erfordern einen anderen Fixierverfahren und Design eines Protokolls für jeden Antikörper könnte erfordernd. Dieses Protokoll wird als Ausgangspunkt vorgestellt, und es wird vorgeschlagen, dass die Nutzer eine fluoreszierende Phalloidin Färbung um eine Vorstellung von der Zelle Form und Lokalisation innerhalb der Matrix bieten beinhalten.

Thick Kollagenmatrices sind eine gute vereinfachten in-vitro-System zur Zellwanderung in einer physiologischen ECM studieren. Obwohl die chemische und physikalische Komplexität eines lebenden Gewebe fehlt, ermöglicht dieses System Manipulation von ECM-Eigenschaften, wie Porengröße, Elastizität und Vernetzung. Wir hoffen, diese Protokolle zu einer besseren Beschreibung der molekularen Zusammensetzung, Lokalisation und Funktion der zellulären Strukturen seit vielen Jahren in 2D und analysiert beitragen, unser Wissen über das Verhalten der Zelle in 3D zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) für Bild-Erfassung und Verarbeitung in Abbildung 3 und PICT-IBISA Imaging Facility (Institut Curie). Komplexe in vitro zellulären Modellen - Diese Arbeit wurde von ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 und PIC 3D unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Enthüllung des Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D
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Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

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