Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

Abstract

נדידת תאים באופן מסורתי נחקרה במצעי 2D. עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר שיש צורך ללמוד את נדידת תאים בסביבות 3D מתאימות יותר, שדומים יותר טוב הממדיות של התהליכים הפיסיולוגיים בשאלה. תאים נודדים באופן משמעותי יכולים להיות שונה במורפולוגיה ובמצב של הגירה שלהם, תלוי אם הם נעים על מצעי 2D או 3D. בשל קשיים טכניים ותאימויות עם פרוטוקולים הסטנדרטיים ביותר, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין נדיר. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, אנחנו משתמשים בקולגן זנב חולדת nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, ושכותרתו fluorescently כדי להקל הדמיה באמצעות מיקרוסקופים confocal סטנדרטיים. עבודה זו כוללת גם protocol תיוג immunofluorescent 3D של שלד תא תא אנדוגני. שימוש בפרוטוקולים אלה אנו מקווים לתרום לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה, ופונקציות של מבנים הסלולר ב-3D.

Introduction

התחום של נדידת תאים כבר braving אל עולם הממד השלישי החדש. זה אינטואיטיבי ללמוד נדידת תאים בסביבה הדומה ביותר הפיזיולוגי אחת, ולכן, תלת ממדי (3D). עם זאת, בשל מגבלות טכניות, מחקרי נדידת התאים ביותר נעשו ניתוח תנועת תא על פני מצעים דו ממד (2D) נוקשים, או ללא טיפול או מצופה עם מטריקס (ECM) חלבונים תאיים מתאימים.

המחקרים הראשונים המוקדשים לנדידת תאים בשלושה סריגי קולגן ממדיים לחזור מעל 20 שנים 1-3. עם זאת, רק ב -5 השנים האחרונות זה הפך להיות ברור כי תאים נודדים באופן מהותי יכולים שיהיו שונים במורפולוגיה ובמצב של הגירה בהתאם ממדי של המצע שלהם. ב 2D, תאים פנו מצע עם פני השטח הגחון שלהם באמצעות הידבקויות מוקד בלבד, וכתוצאה מכך היווצרות של בליטות שטוחות רחבות (lamellipodia) עםבליטות דמויות אצבע מוטבעות (filopodia) בקצה המוביל שלהם. מבנים אלה, יחד עם סיבי מתח המחברים את התא הקדמי לקצה הנגרר, הם האמינו להיות מכריע עבור תנועת תא ב2D. במטריצות 3D, תאים הם בדרך כלל מוארכים יותר, עם תא השטח כולו יצירת קשר עם ECM, גורמים לשינויים ניכרים במבנה ואת הרלוונטיות של פעילות של רבים ממבנים אלה. לעומת זאת, תכונות סלולריות אחרות להשיג רלוונטיות בהגירת 3D, כגון עיוות גרעינית ומבנים מעורבים בECM שיפוץ 4.

למרות שינויים אלה ידועים מורפולוגיים, כמו גם הבדלים במצבי הגירת 5-7, אשר יכול להשתנות בהתאם לECM וסוגי תאים, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין יוצא דופן. עבודה עם מטריצות 3D עבות וצפופות נושא קשיים טכניים, כגון הדמיה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, וחוסר תאימות עם מרבית staפרוטוקולי ndard מותאמים לתרבויות 2D, כמו תיוג immunofluorescent של חלבונים אנדוגניים. כמו כן, משום שהשימוש במטריצות 3D הוא גישה חדשה יחסית, חוקרים עדיין בודקים את התנאים הטובים ביותר לדומים למצבים ספציפיים בvivo, כגון ארכיטקטורת סטרומה נורמלית של איברים או רקמות שונות בארגון ECM סביב גידול. הבדלים בתוצאות על ידי קבוצות שונות הנוגעות, למשל, מצבי סרטן תאים של הגירה או קיומן של הידבקויות מוקד, יצרו מחלוקת 8. הרבה מאמץ הוקדשה לאחרונה כדי להגיע להסכמה במונחים של ECM אופי כימי, גודל נקבובית, עובי סיבים, ומטריצת קשיחות. סוגים רבים ושונים של ECMS 3D משמשים כיום, שונים ממטריצות נגזרות סלולריים לmatrigel זמין מסחרי, קולגן שור pepsinized אני, או קולגן זנב החולדה nonpepsinized י כל אחד מהמטריצות האלה יש תכונות פיסיקליות וכימיות ספציפיות ואחד צריך רלהte המטריצה ​​של בחירה לתהליך הפיזיולוגי הנלמד. בנוסף, עובי וגודל נקבובית סיבים יכול להיות תלוי בתנאים פילמור, כגון pH וטמפרטורה 9,10. קשירה ולמרחק ממצעים קשיחים כגון זכוכית, ניתן גם לשנות את תכונות האלסטיות של המטריצה ​​10,11.

מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. שיטות להכנת spheroids תאים סרטניים בעבר תאר, את אלה הפופולריים ביותר להיות שיטת טיפה התלויה 12,13 ושיטת צלחת agarose המצופה 14. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, קולגן זנב החולדה nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, הוא משמש ב2 מ"ג / מ"ל. קולגן חומצת החילוץ Nonpepsinized אני מזנב חולדה שומר שני טרמינל C-N-וtelopeptides, חלקי nonhelical של מולקולת הקולגן אחראי להאם של קולגן intermoleccrosslinking תואר בלבד ויציבות fibrilar 15. יחד, בתנאים אלה יאפשר היווצרות של רשתות קולגן שדומים באופן הדוק ביותר את אלה שנצפו בvivo 10. כדי לאפשר הדמיה של סיבי קולגן, הן בתרבויות קבועות וחיים, פרוטוקול מפורט מסופק לתייג הקולגן במבחנה 10 באמצעות 5 fluorescently - (ו- 6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה), אסתר succinimidyl. פרוטוקול זה הותאם מBaici et al. 16,17, בי isothiocyanate ההעמסה משמש לתייג מולקולות מסיסים קולגן. וכהעמסה, טמרה היא צבע פלואורסצנטי אמינו-reactive שמגיב עם קבוצות nonprotonated aliphatic אמינו של חלבונים, כגון קבוצת אמינו החופשית בN-הסופית, וחשוב יותר, קבוצה אמינית הצד של lysines. תגובה זו מתרחשת רק ב-pH הבסיסי, כאשר קבוצת אמינו ליזין היא בצורת nonprotonated. בנוסף לטמרה להיות יציבה יותר מהעמסה עלזמן, ספקטרום הפליטה שלה נופל על מגוון הכתום / אדום (= 555/518 ננומטר לשעבר / EM), אשר יכול להיות משולב מועילה להדמית תא חי של חלבוני ה-GFP-מתויגים. שימוש במולקולות מסיסים קולגן שכותרתו עם צבעי אמינו תגובתי אינו משפיעה על תהליך פילמור ולא הצפיפות, הגודל נקבובית ומעמד crosslinking של מטריצת הקולגן 10,16,18,19.

פרוטוקול זה כולל גם את שיטה לתיוג immunofluorescent 3D של חלבונים אנדוגניים, אשר עבר אופטימיזציה נוספת לתייג את שלד התא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. המיקוד הסופי של פרוטוקול זה הוא על שיטות לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תרבויות 3D באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם תרומה מופחתת מcoverslips הזכוכית הנוקשים על מתח מטריצת הקולגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טמרה-קולגן אני תיוג

  1. הכן פתרון טמרה מ"ל 10 מ"ג / 2.5 מ"ל על ידי הוספת DMSO ל25 מ"ג האבקה סיפקה טמרה. לפזר אותו על ידי vortexing עד לפירוק מוחלט. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, ולהגן מפני אור.
  2. להכין 2 ליטר של הצפת תיוג (0.25 מ '3 NaHCO, 0.4 מ' NaCl). כדי להתאים את pH 9.5 באמצעות פתרון M 10 של NaOH. לשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות ב4 º C, אלא אם כן חומר האמור וניאון אחרת הוא מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
  3. מלא מזרק חד פעמי 1 מ"ל עם 1 מ"ל של קולגן עכברוש זנב המרוכז מאוד פתרון. פתרונות קולגן ריכוז גבוהים ניתנים בדרך כלל בריכוזים סביב 10 מ"ג / מ"ל ​​והם מאוד צמיג. הקפד לתפעל אותו לאט, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
  4. באמצעות מחט 21 G מזרק, להזריק קולגן לקלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה של 10,000 MWCO נותק. השתמש בזהירות כדי להימנע מDamaגינג הקרום עם המחט. הסר את כל האוויר מקלטת הדיאליזה על ידי משיכת הבוכנה המזרק. Dialyze אותו הלילה נגד 1 ליטר של הצפת תיוג.
  5. מערבבים 100 μl של פתרון טמרה מ"ל 10 מ"ג / 900 עם μl של הצפת תיוג. הערה: זה צריך להיעשות עם שני פתרון טמרה והצפת תיוג בטמפרטורת חדר מאז DMSO קופא על 4 מעלות צלסיוס לאחר ערבוב, להביא את פתרון טמרה המדולל בחזרה עד 4 מעלות צלסיוס
  6. מוציא בזהירות את קולגן מקלטת הדיאליזה באמצעות מזרק חד פעמי 2 מ"ל עם מחט 21 G מזרק. מערבבים 1 מ"ל של פתרון קולגן dialyzed עם 1 מ"ל של תמיסה מדוללת טמרה ידי pipetting.
  7. העבר קולגן / תמהיל טמרה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל ו דגירה לילה עם רוטציה.
  8. העבר 2 מ"ל של קולגן טמרה שכותרתו לתוך קלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה וdialyze הלילה נגד 1 ליטר של תיוג הצפת כדי להסיר את העודפים של צבע ללא תשלום.
  9. כדי לשחזר במעבדת טמרהקולגן eLED לפתרון המקורי קולגן, הצב את קלטת הדיאליזה לתוך 1 ליטר של 0.2% (V / V) פתרון חומצה אצטית, pH 4, וdialyze בן לילה.
  10. מדוד את הנפח הסופי של קולגן טמרה שכותרתו ולחשב הריכוז הסופי שלו, בהתחשב בהיקף הראשוני והריכוז של פתרון קולגן בשימוש. חנות ב 4 המעלות צלסיוס

2. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם תאים בודדים משובצים

  1. חישוב הנפח של 2-Mix טמרה קולגן מ"ג / מ"ל ​​ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן.
  2. הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים.
  3. מערבבים PBS 10x ו1 N NaOH בכמויות מתאימות כדי להשיג את הריכוז הרצוי וקולגן pH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"למיקס של טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x עם 5 μl של 1N NaOH. מערבבים היטב.
  4. הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ"ג / מ"ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרת מ"ג / מ"ל ​​3.68 ו415.71 μl של 4.01 מ"ג / מ"ל ​​של קולגן ללא תווית. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
  5. הוסף תאים תלויים בנפח המתאים של מדיום סלולרי צונן ללא FBS לתערובת טמרה-קולגן כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 10 5 תאים / מ"ל וריכוז קולגן סופי של 2 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, עבור 1 מ"ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ"ג / מ"ל, להוסיף 388.81 μl של מדיה המכיל 10 5 תאים. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל במבחן ה-pH שלטיול.
  6. 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו לפלמר בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ"מ והם 2 מ"מ. כאשר polymerized, קולגן הופך לג'ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ"ל.
  7. מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות קולגן / תא. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לנדוד במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים).

3. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם spheroids הסלולרי משובץ

  1. חישוב הנפח של 2 מ"ג / מיליליטר טמרה-M קולגןIX ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן.
  2. הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים.
  3. מערבבים PBS 10x, 1 N NaOH ותקשורת סלולרי ללא FBS בכמויות מתאימות כדי להשיג את ריכוז קולגן הרצוי וpH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"ל של מיקס טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x, 5 μl של 1 N NaOH ו388.81 μl של תקשורת. מערבבים היטב.
  4. הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ"ג / מ"ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרתו 3.68 מ"ג / מ"ל ​​ו 415.71 μl של 4.01 מ"ג / מ"ל ​​של unlaקולגן beled. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל על רצועת בדיקת חומציות.
  5. 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו ליזום פילמור במשך 2-5 דקות. זה יעזור כדי למנוע טביעתה של spheroids ידי מעט מגביר את צמיגות הג'ל. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ"מ והם 2 מ"מ.
  6. לאסוף אליפטית תא ולמקם אותו על צלחת פטרי נקי. הסר את כל עודף של נוזל וresuspend זה ב10 μl של מיקס טמרה-קולגן. זה חשוב כדי למנוע דילול של קולגן עם תקשורת סלולרי.
  7. בעזרת פיפטה P20, לאסוף קולגן המושעה אליפטית ולמקם אותו בחלק העליון של מרכז ירידת מיקס טמרה-קולגן μl 100. הערה: אין יותר ממקום אחד לכל טיפת אליפטית קולגן, כיוון שהם יכולים להשפיע על כל קיבולת אחרת לפלוש ו / או להעביר.
  8. לאפשר מיקס טמרה-קולגן לפוליmerize בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. כאשר polymerized, קולגן הופך לג'ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ"ל.
  9. מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות spheroids קולגן /. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק.
  10. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לפלוש / להעביר במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים).

4. מכתים immunofluorescence 3D

  1. מוציא בזהירות את התקשורת הסלולרי ולשטוף את מטריצות קולגן המכילות תאים / spheroids עם PBS.
  2. במקביל לתקן ולחלץ תאים על ידי דוגרים עם חיץ חילוץ / קיבעון (PFA 4%,, סוכרוז 0.3% טריטון X-100 של 5% בPBS) למשך 5 דקות. להשלים עם חיץ Phalloidin מיקרומטר 2 ו 2 מיקרומטר טקסול להדמיה של שלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton.
  3. יתר על כן לתקן את התאים עם PFA 4%, 5% סוכרוז ב-PBS למשך 30 דקות. לשטוף עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
  4. פתרונות נוגדנים עיקריים להכין PBS. דגירה תאים עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 המעלות צלסיוס הקפד להוסיף מספיק פתרון כדי לכסות את ירידת קולגן כולו. לצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ, 1.5-2 מ"ל של תמיסה יהיה צורך בכך. הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של פתרון נוגדן, מכשול בלתי מסיס מים, כגון קו מעגל גריז סיליקון או טבעת PDMS, ניתן להציב סביב ירידת קולגן.
  5. שטוף 30 דקות 3x עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
  6. הכן את נוגדנים משני אלקסה-מצומדות, phalloidin אלקסה מצומדות ופתרונות DAPI PBS. דגירה תאים עם הנוגדנים משני המתאימים עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
  7. לשטוף 3x 30 דקות עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
  8. להסיר עודפים של נוזל, להוסיף מספיק הרכבה תקשורת כדי למלא את תחתית צלחת תחתית הזכוכית (μl כ 500) ומניח על גבי coverslip 24 מ"מ כדי לאטום. אל תלחץ כלפי מטה את coverslip כדי למנוע דחיסת טיפת קולגן ופגיעה בארגון 3D.

5. הדמיה לדוגמה

ניתן להשתמש במיקרוסקופי confocal דיסק קלאסי או ספינינג. מעדיף מערכת הפוכה יש להשתמש כדי לקבוע את המרחק של התאים צלמו מתחתית הכוס. המערכת המשמשת לעבודה זו היא דיסק מסתובב confocal הפוכה מצויד במטרות נפט הטבילה 60X/1.4NA (עובד מרחקים 200 מיקרומטר ו130 מיקרומטר, בהתאמה) ו40X/1.3NA, מצלמה Photometrics CoolSNAP HQ2, 1392 x 1040 מערך הדמיה, 6.45 6.45 x מיקרומטר פיקסלים ונשלט על ידי תוכנת ההדמיה Metamorph. 405 ננומטר, 491 ננומטר, 561 ננומטר, ו633 ננומטר לייזרים משמשים בדרך כלל 30-50% בצריכת החשמל, ולקבל 1 binning של 2X 2 כדי להפחית את זמני חשיפה. מיקרוסקופ מצויד גם עם מנורה כספית וקוביות לסנן DAPI (400-418 ננומטר EXC; em 450-465), FITC (exc 478-495; 510-555) וטקסס אדומה (exc 560-580; 600 -650) להשתמש בעינית.

  1. באמצעות מנורת הניאון, הצב את מטרת 40X באמצע טיפת קולגן. קבל סקירה כללית של המדגם, הן בציר XY וציר z. הקפד לא לסטות יותר מ -100 מיקרומטר מקצה ג'ל על ציר XY בעת רכישה את התמונות, כדי למנוע השפעות קצה. כאשר spheroids הדמיה, לוודא שהם מתחת למרחק העבודה האובייקטיבי. שינוי אובייקטיבי אם מתאים.
  2. לעבור למצב ההדמיה לחיות confocal. על ידי שימוש בלייזר ננומטר 561 לדמיין קולגן טמרה שכותרתו, החל מתחתית הכוס לקבוע את ערך Z שבו סיבי קולגן להתחיל להופיע. זהו המצע התחתון וZ = 0.
  3. באמצעות כפתור הפוקוס, ללכת עד 100 מיקרומטר מZ = 0. תאים רק ב z = 100 מיקרומטראו לעיל צריך להיות צילמו כדי למנוע תופעות מתח מתחתית הזכוכית הנוקשה.
  4. בחר את התאים לתמונה. לייעל את זמני חשיפת מצלמה וכוח לייזר לכל אורך גל. זמני חשיפה אופייניים עבור DAPI וAlexa-488 Phalloidin הם בין 100-200 אלפיות שני. זמני חשיפה למכתים נוגדן עשויים להשתנות.
  5. במצב חי confocal באמצעות לייזר המתאים כדי להמחיש את phalloidin מכתים ובאמצעות כפתור הפוקוס, להגדיר את מרווח סדרת Z על ידי קביעת ערכי z עליונים ותחתונים לנוכחיים.
  6. הגדר את גודל Z-הצעד. למטרות 40X, השתמש 1 מיקרומטר. ל60x, השתמש 0.5 מיקרומטר. התחל רכישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תיוג עכברוש זנב קולגן אני עם טמרה מאפשר הכנה קלה ויזואליזציה של רשתות קולגן 3D. פילמור איטי בטמפרטורת חדר בתוצאות היווצרות של רשתות קולגן עם ארגון דומה לאלה שנמצאו בvivo 10.

כאן אנו מציגים פרוטוקול למכתים immunofluorescence של cytoskeleton של CT26 תאים סרטניים, והן כspheroids כתאים בודדים. כדי לשמר טוב יותר שלד התא, מאגרים הם השלימו עם phalloidin ללא תווית וטקסול, תרופות ידועות לייצב F-אקטין וmicrotubules, בהתאמה. בנוסף, תאים שתוקנו בו זמנית והוציאו להסיר הבריכות טובולין cytosolic nonpolymerized שיכול להפריע להדמיה של microtubules הבודדות. טכניקה זו יכולה באותה מידה לשמש כדי לחזות חלבוני שלד תא הקשורים. כאשר ב-3D, CT26 תאים להציג מורפולוגיה mesenchymal טיפוסית מתאפיינת מוארכתגוף תא, הטה עם בליטות סלולריות עשירות F-אקטין הדומות filopodia וlamellipodia (איורים 1 ו -2). מורפולוגיה מוארכת זה בולט עוד יותר בתאים המנסים להימלט spheroids הסלולרי על ידי הפולשים מטריצת הקולגן (איור 2). צביעה של microtubules באמצעות נוגדן אנטי טובולין מציגה רשת microtubule השתמר היטב ומאורגנת (איורים 1 ו -2). צורת תא זה שונה מאוד מזו של CT26 תאים במצעי 2D, שבו בדרך כלל יש להם כמה קצוות מובילים עם lamellipodia השטוח הרחב הגדול ומוגדר היטב filopodia 10.

כדי לעבד את התמונות שנרכשו בעבודה זו, Imaris היה בשימוש. תוכנה זו ממירה באופן אוטומטי הגדול רכש Z-ערימות להקרנת 3D של ניווט קל והדמיה בכל המטוסים (XY, XZ וYZ) וזוויות שונות (1 דמויות, 2 ו -3, orthogonaצפיות לליטר). שימוש בפונקציית "חתוך 3D", ניתן להסיר מטוסי z מיותרים מעל או מתחת לאזור של עניין. כפי שהוא מיוצג באיור 3, חשוב לנתח את ערימות z שנאספו מכל המטוסים של תצוגה על מנת להבטיח הפצת 3D אחידה של התאים. במקרה זה, נראים CT26 תאים שגודלו כspheroids לפלוש למטריצת הקולגן 3D בהרחבה כשדמיינו כהשלכה XY מקסימלי. עם זאת, תצוגת XZ מגלה כי כל התאים הם פולשים מרווח z מוגבל בהשוואה לנפח אליפטית, המצביעים על אזור מועדף של פלישה. אליפטית זהו למעשה קרובה מדי לתחתית הזכוכית של הצלחת והתאים עברו מהר לכיוון ועל מצע 2D הנוקשה.

איור 1
איור 1. שלד תא של תאים סרטניים CT26 תאים מוטבע בטמרה שכותרתו קולגן I. Colעל אדנוקרצינומה CT26 תאים היו מוטבעים כתאים בודדים ב2 מ"ג / מיליליטר טמרה שכותרתו קולגן אני (אדום). תמונות immunofluorescence של תרבויות מוכתמות נוגדן טובולין לmicrotubules התווית (כחול), Alexa-488 phalloidin לדמיין F-אקטין (ירוק) וDAPI עבור מכתים גרעיני (ציאן). תמונת 3D מתאימה להקרנה מקסימלי של XY Z-ערימות של 38 מיקרומטר. XZ אורתוגונלי (חלק תחתון של מיזוג) וYZ (זכותו של מיזוג) למזג תצוגות. בר סולם, 20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. Cytoskeleton של CT26 תאי סרטן תאים פולשים תאי CT26 טמרה שכותרת קולגן I. שגודלו כspheroids הסלולרי היו משובץ ב2 מ"ג / מיליליטר טמרה שכותרתו קולגן אני (אדום). לאחר 2 ימים בתרבות, החלו בתאיםvading מטריקס 3D קולגן, מתרחק אליפטית התא. תמונות immunofluorescence של תרבויות מוכתמות נוגדן טובולין לmicrotubules התווית (כחול), Alexa-488 phalloidin לדמיין F-אקטין (ירוק) וDAPI עבור מכתים גרעיני (ציאן). תמונת 3D מתאימה להקרנה מקסימלי של XY Z-ערימות של 66 מיקרומטר. XZ אורתוגונלי (חלק תחתון של מיזוג) וYZ (זכותו של מיזוג) למזג תצוגות. בר סולם, 50 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. פלישת CT26 תאים בקולגן אני תלוי במרחק הזכוכית. CT26 תאים גדל כspheroids סלולרי ומוטבעת ב2 מ"ג / מיליליטר קולגן אני אחרי 2 ימים בתרבות, תאים עברו באופן משמעותי מהתא אליפטית, ולא על ידי פולשים לאהוא 3D קולגן המטריצה ​​אבל בזחילה על הזכוכית הנוקשה 2D. תמונות הקרינה של תרבויות מוכתמות בAlexa-488 phalloidin לדמיין F-אקטין. תמונת 3D) מתאימה להקרנה מקסימלי של XY Z-ערימות של 200 מיקרומטר. ב) צפייה XZ אורתוגונלית. בר סולם, 150 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול מתואר כאן לתייג קולגן fluorescently אני משתמש בטמרה מספקת שיטה מצוינת כדי לאפשר הדמיה קלה של ארגון רשת קולגן, באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי מצוידים בליזר ננומטר 561. יתרון של שיטה זו בהשוואה למיקרוסקופיה confocal ההחזרה הוא יכולת סיבי קולגן תמונה עמוקות יותר לתוך מטריצת 3D. העצמה והחדות של השתקפות הסיבים מפחיתים באופן משמעותי עם עומק בשל ספיגת אור לייזר ופיזור. כמו כן, הכיוון של סיבי קולגן יכול להיות מכשול עיקרי בעת שימוש במיקרוסקופיה confocal החזרה, שכן סיבים מיושרים סביב 50 מעלות מהמטוס מבלי שיבחינו בם ההדמיה לחלוטין. סיבי fluorescently שכותרתו מזוהים עם בהירות דומה, ללא תלות באורינטציה שלהם 20. שיטה נוספת שהיה בשימוש יותר ויותר לדמיין צרורות קולגן, הן במבחנת in vivo, היא על ידי דור ההרמוני שניeration (SHG). תהליך זה מבוסס על הפליטה של SHG אות על ידי מבני noncentrosymmetric, כגון קולגן 21. עם זאת, SHG דורש מיקרוסקופ multiphoton, וזה לא חלק מציוד ההדמיה המעבדה הסטנדרטי.

השימוש בטמרה כfluorophore אינו בלעדית. fluorophores אחר, כגון Cy2, Cy5 או משפחת פלואוריד אלקסה, זמין מסחרי בערכות תיוג חלבון, ניתן להשתמש בו לקולגן התווית בצבע הנוח ביותר למשתמש. יתרון נוסף של שימוש בקולגן ניאון הוא הפוטנציאל להיות משולב עם תאי transfected עם חלבוני fluorescently שמתויגים לזמן לשגות הדמיה, כדי לעקוב מקרוב אינטראקציות תא מטריקס או פגמי מטריקס-Induced תא. זה גם יכול לשמש לcoverslips ציפוי קולגן דקה בניסויים 2D.

הטבעה של תאים במטריצות 3D היא הליך עדין, במיוחד בעת השימוש בspheroids הגדול, שכן יש להם נטייה לשקוע בשל כוח הכבידה. כמו כן, תאים נמשכים בדרך כלל לסביבות נוקשה וכאשר מוטבעים באזורים של מטריקס 3D הקרוב מספיק לcoverslip הזכוכית להרגיש העלייה במתח הנגרמת על ידי הזכוכית, הם עוברים לכיוון מצע 2D הנוקשה. טריק טכני כדי לסייע במניעת טביעתה של spheroids הגדול הוא לאפשר לפלמר קולגן בקצרה (2-5 דקות) לפני ביצוע אליפטית על גבי טיפת המטריצה. זה מעט יגדיל את הצמיגות של ג'ל, הגדלת הזמן השוקע. עם זאת, זה תרגול טוב כדי להכין כמה חזרות כדי להגדיל את סיכויי הצלחה. מצד השני, חשוב לשמור על התאים תחת מרחק העבודה האובייקטיבי. בדרך כלל יש מטרות הגדלה נמוכות מרחקי עבודה גדולים יותר, ויכולות לשמש לתמונות שדה הכוללות, למשל, להשוות את הפלישה של תאים מסוגים שונים מאליפטית. כאשר תמונות ברזולוציה גבוהות יותר נדרשות, מים טבילה מטרות, עם מרחקי עבודה גדולים יותר, הם מאוד מומלץ.

ילדה = "jove_content"> רוב העבודה שפורסמה מסתכלת על חלבונים תאיים של תאים במטריצות 3D נעשה על ידי ביטוי יתר של חלבונים מתויגים fluorescently, ככל הנראה בשל חוסר פרוטוקול מכתים immunofluorescence אמין בקנה האחד עם טבע 3D של התשתית . בעיות כגון נגישות נוגדן לתאים המוטבעים עמוק או מכתים רקע גבוה של מטריקס (מאז נוגדנים רבים unspecifically יכולים לקשט את סיבי קולגן) יכולות להיות סיבה. פרוטוקול זה מתאר גם immunostaining במטריצות קולגן 3D. למרות שפרוטוקול זה כבר מותאם לשלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton, יש לו גם שימש בהצלחה לתייג סמני מוקדי הידבקות, כגון paxilin, vinculin וzyxin, בשורות תאים שונות 10. אנחנו לא מנסים ליצור פרוטוקול immunostaining 3D בכלל. כמו ב2D, כל נוגדן עשוי לדרוש הליך קיבוע שונה ועיצוב של פרוטוקול ספציפי לכל נוגדן יכול להיות דורשד. פרוטוקול זה מוצג כנקודת התחלה, והוא הציע שמשתמשים כולל phalloidin ניאון מכתים כדי לתת מושג על צורת התא והלוקליזציה בתוך המטריצה.

מטריצות קולגן עבות הן פשוט טוב במערכת במבחנה ללמוד נדידת תאים בECM פיסיולוגי. למרות שהיא חסרה את כימית ופיזית מורכבות של רקמת חיה, מערכת זו מאפשרת מניפולציה של נכסי ECM ספציפיים, כגון נקבובית גודל, גמישות וcrosslinking. אנו מקווים פרוטוקולים אלה יתרמו לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה ופונקציות של מבנים הסלולר במשך שנים רבות נותחו ב2D וכדי לשפר את הידע של התנהגות תא ב3D שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים תודה להכיר ד"ר סילי Gurchenkov (מכון קירי) לרכישה ועיבוד תמונה באיור 3 ומתקן ההדמיה PICT-IBISA (מכון קירי). עבודה זו נתמכה על ידי ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 וPIC 3D - קומפלקס בדגמים סלולריים חוץ גופית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

Tags

רפואה גיליון 80 טמרה קולגן 3D מטריקס spheroids ה-F-אקטין microtubules
חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter