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Medicine

3 डी में आक्रामक कैंसर कोशिकाओं के Cytoskeletal संगठन खुलासा

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

यह लेख fluorescently आगे तय करने और 3 डी सेल संस्कृतियों का जीना इमेजिंग दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कोलेजन लेबल करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. हम भी 3 डी वातावरण में संवर्धित कोशिकाओं की अंतर्जात cytoskeletal प्रोटीन कल्पना करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Abstract

सेल प्रवास पारंपरिक रूप से 2 डी substrates में अध्ययन किया गया है. हालांकि, यह बेहतर सवाल में शारीरिक प्रक्रियाओं के dimensionality के समान है जो अधिक उपयुक्त 3 डी वातावरण में सेल प्रवास का अध्ययन करने की आवश्यकता है कि तेजी से स्पष्ट हो गया है. प्रवासी कोशिकाओं को काफी हद तक वे 2 डी या 3 डी substrates पर आगे बढ़ रहे हैं, इस पर निर्भर करता है कि उनकी आकारिकी और प्रवास के मोड में अलग कर सकते हैं. सबसे मानक प्रोटोकॉल, 3 डी matrices के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं के संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के साथ तकनीकी कठिनाइयों और असंगति के कारण अभी भी असामान्य बनी हुई है. यह लेख एकल कक्षों या spheroids के रूप में या तो, तैयारी और 3 डी कैंसर सेल संस्कृतियों की इमेजिंग के लिए तरीके का वर्णन है. कैंसर सेल प्रवास के लिए एक उपयुक्त ईसीएम सब्सट्रेट के रूप में, हम मैं कमरे के तापमान पर polymerized और fluorescently मानक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए दृश्य की सुविधा के लिए लेबल nonpepsinized चूहे की पूंछ कोलेजन का उपयोग करें. यह काम भी एक protoc शामिलअंतर्जात सेल cytoskeleton की 3 डी immunofluorescent लेबलिंग के लिए राजभाषा. हम आणविक संरचना, स्थानीयकरण, और 3 डी में सेलुलर संरचनाओं के कार्य को बेहतर ढंग से वर्णन करने के लिए योगदान करने की उम्मीद है इन प्रोटोकॉल का उपयोग करना.

Introduction

सेल प्रवास के क्षेत्र ब्रांड नए तीसरे आयामी दुनिया में बहादुरी से किया गया है. यह सबसे निकट शारीरिक एक जैसा होता है और, (3 डी) इसलिए, तीन आयामी है कि एक वातावरण में सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए सहज है. हालांकि, तकनीकी सीमाओं के कारण, सबसे सेल प्रवास पढ़ाई अनुपचारित या उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ लेपित, या तो कठोर दो आयाम (2 डी) substrates के पार सेल आंदोलन का विश्लेषण किया गया है.

तीन आयामी कोलेजन lattices में सेल प्रवास को समर्पित पहला अध्ययन 20 साल 1-3 से वापस जाओ. हालांकि, केवल पिछले 5 वर्षों में यह प्रवासी कोशिकाओं को काफी हद तक उनकी आकारिकी और सब्सट्रेट के dimensionality के आधार पर प्रवास के मोड में मतभेद हो सकता है कि स्पष्ट हो गया है. 2 डी में, कोशिकाओं के साथ ही व्यापक फ्लैट protrusions के गठन (lamellipodia) में जिसके परिणामस्वरूप, फोकल adhesions का उपयोग कर अपने उदर की सतह के साथ सब्सट्रेट संपर्कउनके अग्रणी धार पर एम्बेडेड उंगली की तरह उभार (filopodia). इन संरचनाओं, एक साथ अनुगामी किनारे करने के लिए सेल सामने कनेक्ट कि तनाव फाइबर के साथ 2 डी में सेल आंदोलन के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है. 3 डी matrices में, कोशिकाओं के गठन और इन संरचनाओं के कई के कार्यात्मक प्रासंगिकता में काफी परिवर्तन के कारण, ईसीएम से संपर्क पूरे कोशिका की सतह के साथ, आम तौर पर अधिक लम्बी हैं. इसके विपरीत, अन्य सेलुलर सुविधाओं ऐसी ईसीएम remodeling के 4 में शामिल परमाणु विरूपण और संरचनाओं के रूप में 3 डी प्रवास में प्रासंगिकता, लाभ.

इन ज्ञात रूपात्मक परिवर्तन, साथ ही ईसीएम और सेल प्रकार, 3 डी matrices के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं के संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के आधार पर भिन्न हो सकते हैं जो 5-7 प्रवास मोड में मतभेद होने के बावजूद अभी भी असामान्य बनी हुई है. मोटी और घने 3 डी matrices के साथ काम कर रहे तकनीकी जैसे उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के रूप में कठिनाइयों, और सबसे स्टेशन के साथ असंगतियां किया जाता हैndard प्रोटोकॉल अंतर्जात प्रोटीन की immunofluorescent लेबलिंग की तरह, 2D संस्कृतियों के लिए अनुकूलित. 3 डी matrices का उपयोग एक अपेक्षाकृत नया तरीका है, क्योंकि इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने अभी भी बारीकी से इस तरह के विभिन्न ऊतकों अंगों के सामान्य स्ट्रोमल वास्तुकला या एक ट्यूमर के आसपास ईसीएम संगठन के रूप में इन विवो स्थितियों में विशिष्ट सदृश करने के लिए सबसे अच्छी स्थिति की जांच कर रहे हैं. के विषय में विभिन्न समूहों से परिणामों में विसंगतियां, उदाहरण के लिए, कैंसर सेल प्रवास के तरीके या फोकल adhesions के अस्तित्व, कुछ विवाद 8 उत्पन्न किया है. प्रयास का एक बहुत हाल ही में ईसीएम रासायनिक प्रकृति, ताकना आकार, फाइबर की मोटाई, और मैट्रिक्स कठोरता के मामले में एक आम सहमति तक पहुँचने के लिए समर्पित किया गया है. 3 डी ECMS के कई अलग अलग प्रकार वर्तमान में सेल व्युत्पन्न मेट्रिसेस से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Matrigel, pepsinized गोजातीय कोलेजन मैं, या nonpepsinized चूहे की पूंछ कोलेजन मैं इन matrices के प्रत्येक विशिष्ट भौतिक और रासायनिक गुण है और असली के लिए एक की जरूरत के लिए अलग, उपयोग किया जाता हैते शारीरिक प्रक्रिया के लिए चुनाव की मैट्रिक्स का अध्ययन किया जा रहा है. इसके अलावा, ध्यान में लीन होना आकार और फाइबर की मोटाई ऐसे पीएच और तापमान 9,10 रूप polymerization की शर्तों पर निर्भर कर सकते हैं. कांच जैसे कठोर substrates, से करने के लिए और दूरी बाध्यकारी भी मैट्रिक्स 10,11 की लोचदार संपत्तियों को बदल सकते हैं.

यह लेख एकल कक्षों या spheroids के रूप में या तो, तैयारी और 3 डी कैंसर सेल संस्कृतियों की इमेजिंग के लिए तरीके का वर्णन है. कैंसर सेल spheroids बनाने के लिए तरीके पहले, फांसी ड्रॉप विधि 12,13 और agarose में लिपटे प्लेट विधि 14 किया जा रहा है सबसे लोकप्रिय लोगों में वर्णित किया गया है. कैंसर सेल प्रवास के लिए एक उपयुक्त ईसीएम सब्सट्रेट के रूप में, मुझे लगता है कि कमरे के तापमान पर polymerized nonpepsinized चूहे की पूंछ कोलेजन 2 मिलीग्राम / एमएल में प्रयोग किया जाता है. Nonpepsinized एसिड निकाले कोलेजन चूहे की पूंछ से मैं दोनों एन और सी टर्मिनल telopeptides, देशी कोलेजन intermolec के लिए जिम्मेदार कोलेजन अणु की nonhelical भागों को बरकरार रखती हैular तिर्यक और fibrilar स्थिरता 15. साथ में, इन शर्तों के सबसे निकट विवो 10 में मनाया लोगों सदृश कि कोलेजन नेटवर्क के गठन के लिए अनुमति देते हैं. निश्चित और रहने संस्कृतियों में दोनों कोलेजन फाइबर, के दृश्य की अनुमति देने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल fluorescently 5 का उपयोग इन विट्रो 10 में कोलेजन लेबल करने के लिए प्रदान की जाती है - (और -6) carboxytetramethylrhodamine (Tamra), succinimidyl एस्टर. इस प्रोटोकॉल Baici एट अल से अनुकूलित किया गया है. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट घुलनशील कोलेजन अणुओं लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है जहां 16,17,. Fluorescein के रूप में, Tamra ऐसी एन टर्मिनस पर मुक्त अमीनो समूह और अधिक महत्वपूर्ण बात, lysines की ओर एमिनो समूह के रूप में प्रोटीन की nonprotonated स्निग्ध एमिनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एक एमिनो प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई है. लाइसिन अमीनो समूह nonprotonated रूप में है जब यह प्रतिक्रिया ही, बुनियादी पीएच पर होता है. Tamra अधिक fluorescein तुलना में स्थिर होने के अलावासमय, अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रा उपयोगी GFP टैग प्रोटीन का जीना सेल इमेजिंग के लिए जोड़ा जा सकता है जो लाल / नारंगी रेंज (पूर्व / उन्हें = 555/518 एनएम), पर गिर जाता है. अमीनो प्रतिक्रियाशील रंजक के साथ घुलनशील कोलेजन लेबल अणुओं का उपयोग polymerization की प्रक्रिया न ही घनत्व, ताकना आकार और कोलेजन मैट्रिक्स 10,16,18,19 का तिर्यक स्थिति को प्रभावित नहीं करता.

इस प्रोटोकॉल भी आगे cytoskeleton है या cytoskeleton जुड़े प्रोटीन लेबल करने के लिए अनुकूलित किया गया है जो अंतर्जात प्रोटीन, के 3 डी immunofluorescent लेबलिंग के लिए एक विधि शामिल है. इस प्रोटोकॉल का अंतिम फोकस कोलेजन मैट्रिक्स तनाव पर कठोर कांच coverslips से कम योगदान साथ confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग 3 डी संस्कृतियों के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के तरीकों पर है.

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Protocol

1. Tamra-कोलेजन मैं लेबल

  1. आपूर्ति 25 मिलीग्राम Tamra पाउडर में 2.5 मिलीलीटर DMSO जोड़कर एक 10 मिलीग्राम / एमएल Tamra समाधान तैयार है. पूरा विघटन तक vortexing द्वारा इसे भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और प्रकाश से बचाने के लिए.
  2. लेबल बफर (0.25 एम 3 NaHCO, 0.4 एम NaCl) के 2 एल तैयार. NaOH के 10 एम समाधान का उपयोग कर 9.5 पीएच को समायोजित करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें अन्यथा कहा और फ्लोरोसेंट सामग्री एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से सुरक्षित है जब तक इस बिंदु से, सभी आपरेशनों 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाता है.
  3. अत्यधिक ध्यान केंद्रित चूहे की पूंछ कोलेजन मैं समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज भरें. उच्च एकाग्रता कोलेजन समाधान आम तौर पर 10 मिलीग्राम / एमएल के आसपास सांद्रता में प्रदान की है और बहुत चिपचिपा रहे हैं. हवाई बुलबुले के गठन से बचने के लिए धीरे धीरे यह हेरफेर करने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. एक 21 जी चमड़े के नीचे सुई का प्रयोग, MWCO काट 10,000 के एक presoaked 3 मिलीग्राम डायलिसिस कैसेट में कोलेजन इंजेक्षन. दामा से बचने के लिए सावधानी बरतेंसुई के साथ झिल्ली ging. सिरिंज पिस्टन ऊपर खींच कर डायलिसिस कैसेट से सब हवा निकालें. लेबल बफर के 1 एल के खिलाफ यह रातोरात Dialyze.
  5. लेबल बफर के 900 μl के साथ 10 मिलीग्राम / एमएल Tamra समाधान के 100 μl मिलाएं. नोट: DMSO के 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा देता है के बाद से यह कमरे के तापमान पर Tamra समाधान और लेबल बफर दोनों के साथ किया जाना चाहिए मिश्रण के बाद, पतला Tamra समाधान 4 डिग्री सेल्सियस को वापस लाने के लिए
  6. ध्यान से एक 21 जी चमड़े के नीचे सुई के साथ एक 2 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग डायलिसिस कैसेट से कोलेजन को हटा दें. Pipetting द्वारा पतला Tamra समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ dialyzed कोलेजन समाधान के 1 मिलीलीटर मिलाएं.
  7. एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कोलेजन / Tamra मिश्रण स्थानांतरण और रोटेशन के साथ रातोंरात सेते हैं.
  8. एक presoaked 3 मिलीग्राम डायलिसिस कैसेट में Tamra लेबल कोलेजन के 2 मिलीलीटर स्थानांतरण और मुक्त डाई से अधिक दूर करने के लिए बफर लेबल का 1 एल के खिलाफ रातोंरात dialyze.
  9. Tamra-प्रयोगशाला को बहाल करने के लिएकोलेजन मूल समाधान करने eled कोलेजन, 0.2% से 1 एल (v / v) एसिटिक एसिड समाधान, पीएच 4, में डायलिसिस कैसेट जगह है और रात भर dialyze.
  10. Tamra लेबल कोलेजन की अंतिम मात्रा को मापने और इस्तेमाल कोलेजन समाधान की आरंभिक मात्रा और एकाग्रता पर विचार, अपनी अंतिम एकाग्रता की गणना. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

2. एंबेडेड एकल कक्ष के साथ 3 डी Tamra-कोलेजन मत्रिसस

  1. प्रयोग के लिए आवश्यक 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra-कोलेजन मिश्रण की मात्रा की गणना. हमेशा कोलेजन उच्च चिपचिपाहट की वजह से नुकसान pipetting के लिए खाते में 20% अधिक तैयार करते हैं.
  2. 10x पीबीएस और 1 एन NaOH के एक शेयर समाधान तैयार है. 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर बाँझ और बनाए रखने के अन्यथा कहा और बाँझ शर्तों के तहत जब तक इस बिंदु से, सभी आपरेशनों बर्फ पर बाहर किया जाता है.
  3. वांछित कोलेजन एकाग्रता और पीएच 7.4 प्राप्त करने के लिए उचित मात्रा में 10x पीबीएस और 1 एन NaOH मिलाएं. उदाहरण के लिए, 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए7.4 पीएच पर Tamra-कोलेजन मिक्स, 1N NaOH के 5 μl के साथ 10x पीबीएस के 100 μl गठबंधन. अच्छी तरह से मिलाएं.
  4. Tamra लेबल कोलेजन और 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम कुल कोलेजन एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एक 01:06 अनुपात में unlabeled कोलेजन दोनों की उचित मात्रा में जोड़ें. उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra-कोलेजन मिक्स के 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए, 3.68 मिलीग्राम / एमएल Tamra लेबल कोलेजन और 4.01 मिलीग्राम / unlabeled कोलेजन की मिलीलीटर के 415.71 μl के 90.48 μl जोड़ें. हवा के बुलबुले के गठन से बचने, pipetting द्वारा अच्छी तरह से और धीरे धीरे मिलाएं.
  5. 10 5 कोशिकाओं / एमएल और 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम कोलेजन एकाग्रता के अंतिम सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए Tamra-कोलेजन मिक्स करने FBS के बिना ठंडा सेल के माध्यम से उचित मात्रा में निलंबित कोशिकाओं जोड़ें. उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra-कोलेजन मिक्स के 1 मिलीलीटर के लिए, 10 5 कोशिकाओं से युक्त मीडिया की 388.81 μl जोड़ें. हवा के बुलबुले के गठन से बचने, pipetting द्वारा अच्छी तरह से और धीरे धीरे मिलाएं. एक पीएच परीक्षण है पर मिश्रण की 10 μl के परीक्षण से पीएच की पुष्टियात्रा.
  6. Tamra-कोलेजन गिलास नीचे व्यंजन पर मिक्स और यह 30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर भाजन करने की अनुमति के पिपेट 100 μl बूँदें. 100 μl कोलेजन बूंदों 7 मिमी की एक ठेठ व्यास और उच्च 2 मिमी हैं. Polymerized करते हैं, कोलेजन एक सफेद ish के जेल में बदल जाता है. नोट: कोलेजन पकवान बंद किए बिना भाजन करने की अनुमति दे कांच से सेना की टुकड़ी को कम करने, कोलेजन बूंद के चारों ओर एक पानी फिल्म के गठन से बचना होगा. पालन ​​बढ़ाने के लिए, कांच के बर्तन में 100 ग्राम / एमएल पाली एल lysine के साथ लेपित किया जा सकता है.
  7. ध्यान से कोलेजन / सेल बूंदों को कवर करने के लिए पर्याप्त संस्कृति के माध्यम जोड़ें. कोलेजन बूँदें आसानी से अलग कर सकते हैं के बाद से मीडिया या अचानक आंदोलनों के उच्च अपशिष्टों से बचें. मैट्रिक्स (आमतौर पर 1-3 दिन) में विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय के लिए 10% सीओ 2 humidified हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें.

3. एंबेडेड सेल Spheroids के साथ 3 डी Tamra-कोलेजन मत्रिसस

  1. 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra-कोलेजन एम की मात्रा की गणनाप्रयोग के लिए आवश्यक नौ. हमेशा कोलेजन उच्च चिपचिपाहट की वजह से नुकसान pipetting के लिए खाते में 20% अधिक तैयार करते हैं.
  2. 10x पीबीएस और 1 एन NaOH के एक शेयर समाधान तैयार है. 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर बाँझ और बनाए रखने के अन्यथा कहा और बाँझ शर्तों के तहत जब तक इस बिंदु से, सभी आपरेशनों बर्फ पर बाहर किया जाता है.
  3. 10x पीबीएस मिक्स, उचित मात्रा में एफबीएस के बिना 1 एन NaOH और सेल मीडिया वांछित कोलेजन एकाग्रता और पीएच 7.4 प्राप्त करने के लिए. उदाहरण के लिए, 7.4 पीएच पर Tamra-कोलेजन मिक्स के 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए, 10x पीबीएस के 100 μl, 1 एन NaOH के 5 μl और मीडिया के 388.81 μl गठबंधन. अच्छी तरह से मिलाएं.
  4. Tamra लेबल कोलेजन और 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम कुल कोलेजन एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एक 01:06 अनुपात में unlabeled कोलेजन दोनों की उचित मात्रा में जोड़ें. उदाहरण के लिए, 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra-कोलेजन मिक्स के 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए, 3.68 मिलीग्राम / एमएल Tamra लेबल कोलेजन के 90.48 μl और unla की 4.01 मिलीग्राम / एमएल के 415.71 μl जोड़नेbeled कोलेजन. हवा के बुलबुले के गठन से बचने, pipetting द्वारा अच्छी तरह से और धीरे धीरे मिलाएं. एक पीएच परीक्षण पट्टी पर मिश्रण की 10 μl के परीक्षण से पीएच की पुष्टि करें.
  5. Tamra-कोलेजन गिलास नीचे व्यंजन पर मिक्स और यह 2-5 मिनट के लिए polymerization के आरंभ करने की अनुमति के पिपेट 100 μl बूँदें. यह थोड़ा जेल चिपचिपापन में वृद्धि से spheroids के डूबने को रोकने में मदद मिलेगी. 100 μl कोलेजन बूंदों 7 मिमी की एक ठेठ व्यास और उच्च 2 मिमी हैं.
  6. एक सेल उपगोल लीजिए और एक साफ पेट्री डिश पर जगह है. तरल के किसी भी अतिरिक्त निकालें और Tamra-कोलेजन मिक्स के 10 μl में resuspend. यह सेल मीडिया के साथ कोलेजन के कमजोर पड़ने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है.
  7. एक P20 विंदुक का प्रयोग, कोलेजन अंडाकार आकृति निलंबित इकट्ठा करने और 100 μl Tamra-कोलेजन मिक्स बूंद के केंद्र के शीर्ष पर जगह है. नोट: वे आक्रमण और / या विस्थापित करने के लिए एक दूसरे की क्षमता को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि कोलेजन ड्रॉप प्रति एक से अधिक अंडाकार आकृति जगह नहीं है.
  8. पाली को Tamra-कोलेजन मिश्रण की अनुमति दें30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर merize. Polymerized करते हैं, कोलेजन एक सफेद ish के जेल में बदल जाता है. नोट: कोलेजन पकवान बंद किए बिना भाजन करने की अनुमति दे कांच से सेना की टुकड़ी को कम करने, कोलेजन बूंद के चारों ओर एक पानी फिल्म के गठन से बचना होगा. पालन ​​बढ़ाने के लिए, कांच के बर्तन में 100 ग्राम / एमएल पाली एल lysine के साथ लेपित किया जा सकता है.
  9. ध्यान से कोलेजन / spheroids बूंदों को कवर करने के लिए पर्याप्त संस्कृति के माध्यम जोड़ें. कोलेजन बूँदें आसानी से अलग कर सकते हैं के बाद से मीडिया या अचानक आंदोलनों के उच्च अपशिष्टों से बचें.
  10. कोशिकाओं मैट्रिक्स (आमतौर पर 1-3 दिन) में आक्रमण / विस्थापित करने के लिए पर्याप्त समय के लिए 10% सीओ 2 humidified हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें.

4. 3 डी immunofluorescence धुंधला

  1. ध्यान से सेल मीडिया को हटाने और पीबीएस के साथ कोशिकाओं / spheroids युक्त कोलेजन मेट्रिसेस कुल्ला.
  2. इसके साथ ही तय है और निकासी / निर्धारण बफर (4% पंजाब में पीएफए, 0.3% ट्राइटन X-100, 5% sucrose के साथ incubating द्वारा सेल निकालने5 मिनट के लिए एस). 2 माइक्रोन Phalloidin और cytoskeleton या cytoskeleton जुड़े प्रोटीन के दृश्य के लिए Taxol 2 माइक्रोन से बफर अनुपूरक.
  3. 4% पीएफए, 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% sucrose के साथ कोशिकाओं को आगे तय कर लो. 0.05% पीबीएस में बीच 20 से कुल्ला.
  4. पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है. कमरे के तापमान पर या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते पूरे कोलेजन बूंद को कवर करने के लिए पर्याप्त समाधान जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें. एक 35 मिमी गिलास नीचे पकवान के लिए, समाधान की 1.5-2 मिलीग्राम जरूरी होगा. नोट: एंटीबॉडी समाधान की मात्रा को कम करने के लिए, ऐसे सिलिकॉन तेल या एक PDMS अंगूठी की एक सर्कल लाइन के रूप में एक पानी अघुलनशील बाधा,, कोलेजन बूंद के आसपास रखा जा सकता है.
  5. 0.05% पीबीएस में बीच 20 के साथ 3 एक्स 30 मिनट धो लें.
  6. एलेक्सा संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, पीबीएस एलेक्सा संयुग्मित phalloidin और DAPI समाधान तैयार है. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  7. 3 x 3 धो0.05% पीबीएस में बीच 20 से 0 मिनट.
  8. , तरल से अधिक निकालें गिलास नीचे पकवान नीचे (लगभग 500 μl) को भरने और सील करने के लिए शीर्ष पर एक 24 मिमी coverslip जगह को मीडिया के बढ़ते पर्याप्त जोड़ें. कोलेजन बूंद compressing और 3 डी संगठन को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए coverslip के नीचे प्रेस न करें.

5. नमूना इमेजिंग

क्लासिक या कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक औंधा प्रणाली को प्राथमिकता गिलास नीचे से छवि कोशिकाओं की दूरी तय करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस काम के लिए इस्तेमाल प्रणाली एक 40X/1.3NA और एक 60X/1.4NA तेल विसर्जन उद्देश्यों (क्रमशः दूरी 200 मीटर और 130 मीटर, काम कर रहे), एक Photometrics CoolSNAP HQ2 कैमरा, 1392 एक्स 1040 से सुसज्जित एक उल्टे Confocal स्पिनिंग डिस्क है इमेजिंग सरणी, 6.45 x 6.45 माइक्रोन पिक्सल और Metamorph इमेजिंग सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया. 405 एनएम, 491 एनएम, 561 एनएम और 633 एनएम लेज़रों आमतौर पर 30-50% बिजली में इस्तेमाल किया जाता है, 1 हासिल करने और 2 की binningएक्स 2 जोखिम के समय को कम करने के लिए. , FITC (exc के 478-495, उन्हें 510-555) और टेक्सास लाल (exc के 560-580, माइक्रोस्कोप भी DAPI (उन्हें 450-465 exc के 400-418 एनएम) के लिए एक पारा दीपक और फिल्टर घन के साथ सुसज्जित है, उन्हें 600 -650) आंख टुकड़ा के साथ उपयोग करने के लिए.

  1. फ्लोरोसेंट लैंप का प्रयोग, कोलेजन बूंद के मध्य में 40x उद्देश्य जगह है. Xy अक्ष में और z-अक्ष में दोनों नमूने के एक सिंहावलोकन, जाओ. बढ़त के प्रभाव से बचने के लिए छवियों को प्राप्त करने जब xy अक्ष पर जेल किनारे से 100 से अधिक माइक्रोन विचलित नहीं सुनिश्चित करें. जब इमेजिंग spheroids, वे उद्देश्य काम दूरी के तहत कर रहे हैं सुनिश्चित करें. अगर उचित उद्देश्य बदलें.
  2. Confocal रहते इमेजिंग मोड में स्विच करें. कोलेजन फाइबर प्रदर्शित होने लगते हैं, जिस पर z मान निर्धारित गिलास नीचे से शुरू करने, Tamra लेबल कोलेजन कल्पना करने के लिए 561 एनएम लेजर का उपयोग करके. इस सब्सट्रेट नीचे है और z = 0.
  3. ध्यान केंद्रित घुंडी का प्रयोग, जेड = 0 से 100 मीटर ऊपर जाना. Z = 100 माइक्रोन से कम केवल कोशिकाओंया ऊपर कठोर गिलास नीचे से तनाव प्रभाव से बचने के लिए imaged किया जाना चाहिए.
  4. छवि के लिए कक्षों का चयन करें. प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए कैमरे का जोखिम बार और लेजर शक्ति का अनुकूलन. DAPI और एलेक्सा-488 Phalloidin के लिए विशिष्ट जोखिम बार 100-200 मिसे के बीच हैं. एंटीबॉडी धुंधला के लिए जोखिम बार भिन्न हो सकते हैं.
  5. धुंधला और ध्यान केंद्रित घुंडी का उपयोग phalloidin कल्पना करने के लिए उपयुक्त लेजर का उपयोग कोंफोकल जीना मोड पर, वर्तमान को ऊपर और नीचे z मान भरकर जेड श्रृंखला अंतराल को परिभाषित.
  6. Z कदम आकार को परिभाषित करें. 40X उद्देश्यों के लिए, 1 माइक्रोन का उपयोग करें. 60X के लिए, 0.5 माइक्रोन का उपयोग करें. अधिग्रहण शुरू करो.

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Representative Results

Tamra साथ चूहे की पूंछ कोलेजन मैं लेबल 3 डी कोलेजन नेटवर्क का एक आसान तैयारी और दृश्य की अनुमति देता है. विवो 10 में पाए जाने वाले के लिए तुलनीय संगठन के साथ कोलेजन नेटवर्क के गठन में कमरे के तापमान परिणामों पर धीरे polymerization की.

यहाँ हम spheroids के रूप में और एकल कक्षों के रूप में दोनों, CT26 कैंसर कोशिकाओं की cytoskeleton की immunofluorescence धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. बेहतर cytoskeleton को संरक्षित करने के लिए, बफ़र्स क्रमशः unlabeled phalloidin और taxol, एफ actin और सूक्ष्मनलिकाएं स्थिर करने के लिए जाना जाता दवाओं के साथ पूरक हैं. इसके अलावा, कोशिकाओं को एक साथ तय हो गई है और व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं के दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि nonpolymerized साइटोसोलिक ट्यूबिलिन पूल हटाने के लिए निकाले जाते हैं. इस तकनीक को भी उतना ही cytoskeleton से जुड़े प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 डी में, CT26 कोशिकाओं एक लम्बी की विशेषता एक ठेठ mesenchymal आकारिकी मौजूद हैसेल शरीर, filopodia और lamellipodia (आंकड़े 1 और 2) के समान है कि एफ actin अमीर सेलुलर protrusions के साथ इत्तला दे दी. यह लम्बी आकारिकी कोलेजन मैट्रिक्स (चित्रा 2) हमलावर द्वारा सेलुलर spheroids से बचने की कोशिश की कोशिकाओं में और भी अधिक स्पष्ट है. एक विरोधी ट्यूबिलिन एंटीबॉडी का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं धुंधला एक अच्छी तरह से संरक्षित और संगठित सूक्ष्मनलिका नेटवर्क (आंकड़े 1 और 2) से पता चलता है. यह सेल आकार बहुत वे आमतौर पर बड़ी व्यापक फ्लैट lamellipodia साथ कई प्रमुख किनारों है और filopodia 10 अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, जहां 2 डी substrates में CT26 कोशिकाओं में से एक से अलग है.

इस काम में अधिग्रहण प्रक्रिया छवियों, Imaris इस्तेमाल किया गया था. यह सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सभी विमानों में आसान नेविगेशन और दृश्य के एक 3D प्रक्षेपण में अधिग्रहीत बड़ा z-ढेर (xy, xz और yz) और विभिन्न कोणों (आंकड़े 1, 2 और 3, orthogona धर्मान्तरितएल विचारों). "फसल 3D" समारोह का उपयोग करना, ऊपर या रुचि के क्षेत्र नीचे अनावश्यक जेड विमानों हटाया जा सकता है. चित्रा 3 में प्रतिनिधित्व के रूप में, यह कोशिकाओं के एक समान 3 डी वितरण सुनिश्चित करने की दृष्टि से सभी विमानों से एकत्र जेड के ढेर का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस मामले में, spheroids के रूप में हो CT26 कोशिकाओं एक अधिकतम xy प्रक्षेपण के रूप में कल्पना की है जब बड़े पैमाने पर एक 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन आक्रमण करने लगते हैं. हालांकि, एक xz दृश्य सभी कोशिकाओं आक्रमण का एक तरजीही क्षेत्र, सुझाव अंडाकार आकृति मात्रा की तुलना में एक प्रतिबंधित जेड अंतराल पर हमला कर रहे हैं कि पता चलता है. इस अंडाकार आकृति के प्रति और कठोर 2D सब्सट्रेट पर तेजी से चले गए पकवान और कोशिकाओं के गिलास नीचे के करीब वास्तव में है.

चित्रा 1
चित्रा 1. CT26 कोशिकाओं को कैंसर कोशिकाओं की cytoskeleton Tamra लेबल कोलेजन मैं कर्नल में एम्बेडेडग्रंथिकर्कटता पर CT26 कोशिकाओं 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra लेबल कोलेजन मैं (लाल) में एकल कक्षों के रूप में एम्बेडेड थे. लेबल सूक्ष्मनलिकाएं को एक ट्यूबिलिन एंटीबॉडी (नीला), परमाणु धुंधला के लिए एफ actin (हरा) और DAPI (सियान) कल्पना करने के लिए एलेक्सा-488 phalloidin साथ दाग संस्कृतियों की immunofluorescence छवियों. 3 डी छवि 38 माइक्रोन के z-ढेर के xy अधिकतम प्रक्षेपण से मेल खाती है. विषयेतर xz (मर्ज के नीचे) और yz (सही मर्ज की) दृश्यों विलय. स्केल बार, 20 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. सेलुलर spheroids के रूप में हो Tamra लेबल कोलेजन मैं CT26 कोशिकाओं पर हमला CT26 कोशिकाओं को कैंसर कोशिकाओं की cytoskeleton 2 मिलीग्राम / एमएल Tamra लेबल कोलेजन मैं (लाल) में एम्बेडेड थे. संस्कृति में 2 दिनों के बाद, कोशिकाओं में शुरू, कोलेजन 3 डी मैट्रिक्स vading सेल उपगोल से दूर जा रहा है. लेबल सूक्ष्मनलिकाएं को एक ट्यूबिलिन एंटीबॉडी (नीला), परमाणु धुंधला के लिए एफ actin (हरा) और DAPI (सियान) कल्पना करने के लिए एलेक्सा-488 phalloidin साथ दाग संस्कृतियों की immunofluorescence छवियों. 3 डी छवि 66 माइक्रोन के z-ढेर के xy अधिकतम प्रक्षेपण से मेल खाती है. विषयेतर xz (मर्ज के नीचे) और yz (सही मर्ज की) दृश्यों विलय. स्केल बार, 50 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. मैं गिलास दूरी पर निर्भर है. CT26 कोशिकाओं कोलेजन में CT26 कोशिकाओं आक्रमण सेलुलर spheroids के रूप में हो और संस्कृति में 2 दिनों के बाद 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन मैं में एम्बेडेड थे, सेल काफी नहीं टी हमलावर द्वारा, सेल अंडाकार आकृति से दूर ले जाया गयावह 3 डी मैट्रिक्स कोलेजन लेकिन 2 डी कठोर कांच पर रेंगने द्वारा. संस्कृतियों के प्रतिदीप्ति छवियों एफ actin कल्पना करने के लिए एलेक्सा-488 phalloidin के साथ दाग. एक) 3 डी छवि. ख) विषयेतर xz दृश्य 200 माइक्रोन के z-ढेर के xy अधिकतम प्रक्षेपण से मेल खाती है. स्केल बार, 150 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

प्रोटोकॉल fluorescently मैं एक 561 एनएम लेजर के साथ सुसज्जित एक मानक confocal खुर्दबीन का उपयोग करके, कोलेजन नेटवर्क संगठन की आसान दृश्य की अनुमति के लिए एक शानदार तरीका प्रदान करता है Tamra उपयोग कर कोलेजन लेबल करने के लिए यहाँ वर्णित है. Reflectance confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना करने के लिए इस तकनीक का एक लाभ यह 3 डी मैट्रिक्स में गहरी छवि कोलेजन फाइबर करने की क्षमता है. फाइबर प्रतिबिंब की तीव्रता और विपरीत लेजर प्रकाश अवशोषण और बिखरने की वजह से गहराई के साथ काफी हद तक कम हो. फाइबर इमेजिंग विमान से 50 डिग्री के आसपास के गठबंधन के बाद से, पूरी तरह से नहीं चल पाता reflectance confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जब भी, कोलेजन फाइबर के उन्मुखीकरण एक बड़ी बाधा हो सकती है. Fluorescently लेबल फाइबर उनके अभिविन्यास 20 की स्वतंत्र समान चमक के साथ पाया जाता है. तेजी से इन विट्रो और इन विवो दोनों में कोलेजन बंडलों, कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक अन्य विधि, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी से हैeration (एसएचजी). यह प्रक्रिया ऐसी कोलेजन 21 के रूप में noncentrosymmetric संरचनाओं, से संकेत एसएचजी के उत्सर्जन पर आधारित है. हालांकि, एसएचजी मानक प्रयोगशाला इमेजिंग उपकरण का हिस्सा नहीं है जो एक multiphoton खुर्दबीन, की आवश्यकता है.

एक fluorophore रूप Tamra के उपयोग के अनन्य नहीं है. ऐसे प्रोटीन लेबलिंग किट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Cy2, Cy5 या एलेक्सा Fluor परिवार के रूप में अन्य fluorophores, उपयोगकर्ता के लिए सबसे सुविधाजनक रंग में लेबल कोलेजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फ्लोरोसेंट कोलेजन का उपयोग करने का एक और लाभ यह बारीकी सेल मैट्रिक्स बातचीत या सेल प्रेरित मैट्रिक्स विकृतियों का पालन करने के लिए समय चूक इमेजिंग, के लिए fluorescently टैग प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ जोड़ा जा करने की क्षमता है. यह भी 2 डी प्रयोगों में पतली कोलेजन कोटिंग coverslips के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

वे गुरुत्वाकर्षण के कारण सिंक करने की प्रवृत्ति है, क्योंकि 3 डी matrices में कोशिकाओं एम्बेड, बड़ा spheroids का उपयोग कर रहा है, खासकर जब एक नाजुक प्रक्रिया है. इसके अलावा,कोशिकाओं को आमतौर पर कठोर वातावरण के लिए आकर्षित किया है और काफी करीब गिलास से प्रेरित तनाव में वृद्धि महसूस करने के लिए गिलास coverslip के लिए 3 डी मैट्रिक्स के क्षेत्रों में एम्बेडेड जब कर रहे हैं, वे कठोर 2D सब्सट्रेट की ओर ले जाएँ. बड़ा spheroids के डूबने को रोकने में मदद करने के लिए एक तकनीकी चाल कोलेजन संक्षेप मैट्रिक्स बूंद के शीर्ष पर अंडाकार आकृति रखने से पहले (2-5 मिनट) भाजन करने की अनुमति है. यह थोड़ा डूब समय बढ़ रही है, जेल की चिपचिपाहट बढ़ जाएगा. फिर भी, यह कई सफलता की संभावना बढ़ाने के लिए replicates तैयार करने के लिए अच्छा अभ्यास है. दूसरी ओर, यह उद्देश्य काम दूरी के तहत कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है. लोअर बढ़ाई उद्देश्यों को आमतौर पर बड़े काम दूरी है और एक अंडाकार आकृति से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के आक्रमण की तुलना करने के लिए, उदाहरण के लिए, समग्र क्षेत्र छवियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बड़ा काम दूरी के साथ उच्च संकल्प छवियों की आवश्यकता होती है, जब पानी विसर्जन उद्देश्यों,, बहुत सिफारिश की है.

10 में ऐसे paxilin, vinculin और zyxin रूप में फोकल आसंजन मार्कर, लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम एक सामान्य 3 डी immunostaining के प्रोटोकॉल बनाने के लिए प्रयास नहीं करते. 2 डी के रूप में, प्रत्येक एंटीबॉडी प्रत्येक एंटीबॉडी की आवश्यकता हो सकती है के लिए एक अलग निर्धारण प्रक्रिया और एक विशिष्ट प्रोटोकॉल के डिजाइन की आवश्यकता हो सकतीघ. इस प्रोटोकॉल प्रारंभ बिंदु के रूप में प्रस्तुत किया है, और यह उपयोगकर्ताओं को मैट्रिक्स के भीतर सेल आकार और स्थानीयकरण की एक विचार प्रदान करने के लिए धुंधला हो जाना एक फ्लोरोसेंट phalloidin शामिल हैं का सुझाव दिया है.

मोटी कोलेजन matrices एक शारीरिक ईसीएम में सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक अच्छा सरल हैं. यह एक जीवित ऊतक की रासायनिक और भौतिक जटिलता का अभाव है, इस प्रणाली को इस तरह के छेद के आकार, लोच और तिर्यक रूप में विशिष्ट ईसीएम गुण, के हेरफेर की अनुमति देता है. हम इन प्रोटोकॉल 2 डी में विश्लेषण कई वर्षों के लिए आणविक संरचना, स्थानीयकरण और सेलुलर संरचनाओं के कार्यों का एक बेहतर विवरण के लिए योगदान देगा और 3 डी में सेल व्यवहार के हमारे ज्ञान में सुधार की उम्मीद है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों का आभार छवि चित्रा 3 और PICT-IBISA इमेजिंग सुविधा (संस्थान क्यूरी) में प्राप्त करने और प्रसंस्करण के लिए डॉ. वसीली Gurchenkov (Institut क्यूरी) स्वीकार करते हैं. इन विट्रो सेलुलर मॉडल में परिसर - इस काम ANR-09-JCJC0023-01, एआरसी SFI20111203863 और तस्वीर 3 डी द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

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References

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चिकित्सा अंक 80 Tamra कोलेजन 3 डी मैट्रिक्स spheroids एफ actin सूक्ष्मनलिकाएं
3 डी में आक्रामक कैंसर कोशिकाओं के Cytoskeletal संगठन खुलासा
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Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

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