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Medicine

Rivelare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

Abstract

La migrazione cellulare è stato tradizionalmente studiato in substrati 2D. Tuttavia, è diventato sempre più evidente che vi è la necessità di studiare la migrazione delle cellule in più appropriati ambienti 3D, che meglio ricordano la dimensionalità dei processi fisiologici in questione. Cellule migratorie possono sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione a seconda che si stanno muovendo su substrati in 2D o 3D. A causa di difficoltà tecniche e le incompatibilità con i protocolli più standard, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all'interno di matrici 3D rimane ancora raro. Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l'imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Come un substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, usiamo nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzato a temperatura ambiente e fluorescente per facilitare la visualizzazione usando microscopi confocale standard. Questo lavoro include anche un protocolo per l'etichettatura immunofluorescenza 3D del citoscheletro delle cellule endogene. L'utilizzo di questi protocolli speriamo di contribuire ad una migliore descrizione della composizione molecolare, localizzazione e funzioni delle strutture cellulari in 3D.

Introduction

Il campo della migrazione delle cellule è stato sfidando nel nuovo mondo tridimensionale del marchio. È intuitivo studiare la migrazione delle cellule in un ambiente che più assomiglia quelle fisiologiche e, pertanto, tridimensionale (3D). Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, studi di migrazione più cellule sono state fatte analizzando movimento cellulare attraverso substrati bidimensionali (2D) rigidi, sia non trattati o rivestiti con adeguate proteine ​​della matrice extracellulare (ECM).

I primi studi dedicati alla migrazione delle cellule in tre reticoli di collagene tridimensionali risalgono ad oltre 20 anni 1-3. Tuttavia, solo negli ultimi 5 anni è diventato chiaro che cellule migranti potrebbero sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione seconda della dimensionalità del substrato. In 2D, cellule solo contatto il substrato con la loro superficie ventrale utilizzando adesioni focali, causando la formazione di sporgenze piatte larghe (lamellipodi) conincorporati sporgenze simili a dita (filopodia) al loro bordo. Queste strutture, insieme a fibre di stress che collegano la parte anteriore cella al bordo di uscita, sono da ritenersi cruciale per il movimento delle cellule in 2D. In matrici 3D, le cellule sono generalmente più allungata, con l'intera superficie cellulare contattare la ECM, causando notevoli cambiamenti nella formazione e la rilevanza funzionale di molte di queste strutture. Al contrario, le altre caratteristiche cellulari guadagnare rilevanza nella migrazione 3D, come ad esempio la deformazione nucleare e strutture coinvolte nel rimodellamento 4.

Nonostante queste note alterazioni morfologiche, così come le differenze di modalità di migrazione 5-7, che possono variare a seconda della ECM e tipi di cellule, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all'interno di matrici 3D rimane ancora inusuale. Lavorare con spesse e dense matrici 3D trasporta difficoltà tecniche, come ad esempio ad alta risoluzione di immagini di microscopia, e le incompatibilità con la maggior parte staprotocolli ndard ottimizzati per le culture in 2D, come l'etichettatura immunofluorescenza di proteine ​​endogene. Inoltre, poiché l'uso di matrici 3D è un approccio relativamente nuovo, i ricercatori stanno ancora studiando le migliori condizioni per assomigliare specifico in situazioni in vivo, come la normale architettura stromale di organi diversi tessuti o l'organizzazione ECM attorno a un tumore. Discrepanze nei risultati per i diversi gruppi riguardanti, ad esempio, le modalità di cellule di cancro della migrazione o l'esistenza di adesioni focali, hanno generato qualche polemica 8. Un grande sforzo è stato recentemente dedicato a raggiungere un consenso in termini di ECM chimica natura, dimensione dei pori, lo spessore delle fibre, e matrice di rigidezza. Molti diversi tipi di ECM 3D sono attualmente utilizzati, che variano da cellule matrici derivate per disponibile in commercio matrigel, pepsinized collagene bovino io, o nonpepsinized ratto coda di collagene I. Ciascuna di queste matrici ha specifiche proprietà fisiche e chimiche e uno ha bisogno di relate la matrice di scelta per il processo fisiologico in fase di studio. Inoltre, le dimensioni e la fibra spessore pori può dipendere da condizioni di polimerizzazione, quali pH e temperatura 9,10. Legandosi e distanza da supporti rigidi quali vetro, può anche modificare le proprietà elastiche della matrice 10,11.

Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l'imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Metodi per rendere sferoidi di cellule di cancro sono stati precedentemente descritti, i più diffusi sono il metodo della goccia pendente 12,13 e il metodo della piastra di agarosio rivestita 14. Come substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzate a temperatura ambiente viene utilizzato a 2 mg / ml. Nonpepsinized collagene estratte con acido, io dalla coda di ratto mantiene entrambe le C-terminale N-e telopeptide, porzioni nonhelical della molecola di collagene responsabili di collagene nativo intermolecreticolazione lare e stabilità fibrilar 15. Insieme, queste condizioni consentono la formazione di reti di collagene che la maggior parte sono molto simili a quelli osservati in vivo 10. Per permettere la visualizzazione delle fibre collagene, sia in culture fisse e vivente, un protocollo dettagliato è fornito per etichettare fluorescently collagene in vitro 10 usando 5 - (e-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimmidil estere. Questo protocollo è stato adattato da Baici et al. 16,17, dove fluoresceina isotiocianato viene utilizzato per etichettare molecole di collagene solubili. Come fluoresceina, TAMRA è un colorante fluorescente amino-reattivo che reagisce con nonprotonated alifatici gruppi amminici delle proteine, come gruppo ammino libero al terminale N e, soprattutto, il lato gruppo amminico di lisine. Questa reazione si verifica solo a pH basico, quando il gruppo amminico della lisina è in forma nonprotonated. Oltre a TAMRA essere più stabile di fluoresceina sopratempo, il suo spettro di emissione cade sul campo di colore arancione / rosso (ex / em = 555/518 nm), che possono essere utilmente combinati per l'imaging cellulare dal vivo di proteine ​​GFP-tagged. Utilizzando collagene molecole marcate con coloranti solubili ammino-reattivi non influenza il processo di polimerizzazione, né la densità, dimensione dei pori e lo stato reticolazione della matrice di collagene 10,16,18,19.

Questo protocollo include anche un metodo per l'etichettatura immunofluorescenza 3D di proteine ​​endogene, che è stato ulteriormente ottimizzato per etichettare il citoscheletro o proteine ​​associate citoscheletro. L'obiettivo finale di questo protocollo è sui metodi per acquisire immagini ad alta risoluzione delle culture 3D utilizzando la microscopia confocale a ridotto apporto di vetrini rigidi sulla tensione matrice di collagene.

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Protocol

1. TAMRA-collagene I Etichettatura

  1. Preparare a 10 mg / ml soluzione TAMRA con l'aggiunta di 2,5 ml di DMSO a quello in dotazione 25 mg TAMRA polvere. Sciogliere nel vortex fino a completa dissoluzione. Conservare a -20 ° C e al riparo dalla luce.
  2. Preparare 2 L di Labeling Buffer (0,25 M NaHCO3, 0,4 M di NaCl). Regolare il pH a 9,5 con soluzione 10 M di NaOH. Conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate a 4 º C se non diversamente indicato e materiale fluorescente è protetta dalla luce con un foglio di alluminio.
  3. Riempire una siringa monouso 1 ml con 1 ml di altamente concentrato coda di ratto collagene I soluzione. Soluzioni ad alta concentrazione di collagene sono tipicamente forniti a concentrazioni circa 10 mg / ml e sono molto viscoso. Assicurati di manipolarla lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria.
  4. Utilizzando un ago G 21 ipodermico, iniettare il collagene in un ammollo 3 ml cassetta dialisi di 10.000 MWCO tagliata. Usare cautela per evitare damastituito la membrana con l'ago. Rimuovere tutta l'aria dalla cassetta dialisi sollevando il pistone della siringa. Dializzare durante la notte contro 1 L di Labeling Buffer.
  5. Mescolare 100 ml di 10 mg / ml soluzione TAMRA con 900 ml di Labeling Buffer. Nota: Questo dovrebbe essere fatto sia con soluzione TAMRA e Labeling tampone a temperatura ambiente da DMSO congela a 4 ° C. Dopo la miscelazione, portare la soluzione diluita TAMRA torna a 4 ° C.
  6. Rimuovere con attenzione il collagene dalla cassetta dialisi utilizzando una siringa monouso da 2 ml con un ago G 21 ipodermico. Miscelare 1 ml della soluzione di collagene dializzata con 1 ml di soluzione diluita TAMRA pipettando.
  7. Trasferire il collagene / TAMRA miscela in una provetta da 2 ml ed incubare una notte con la rotazione.
  8. Trasferire il 2 ml di collagene TAMRA marcato in un 3 ml cassetta dialisi ammollo e Dializzare overnight contro 1 L di tampone Labeling per rimuovere l'eccesso di colorante libero.
  9. Per ripristinare il TAMRA-labcollagene eLED alla soluzione originale collagene, posizionare la cassetta dialisi in 1 L di 0,2% (v / v) di acido acetico, pH 4, e dializza overnight.
  10. Misurare il volume finale del collagene TAMRA marcato e calcolare la sua concentrazione finale, considerando il volume iniziale e la concentrazione della soluzione utilizzata collagene. Conservare a 4 ° C.

2. 3D Matrici TAMRA-collagene con impliciti singole cellule

  1. Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix necessaria per l'esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene.
  2. Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili.
  3. Mescolare 10x PBS e 1 N NaOH in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 mldi Tamra-Collagene Mix a pH 7,4, unire 100 ml di PBS 10X con 5 ml di NaOH 1N. Mescolare bene.
  4. Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di collagene non marcato. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d'aria.
  5. Aggiungere cellule sospese nel volume appropriato di medie cella refrigerata senza FBS al TAMRA-Collagene Mix per ottenere una densità cellulare finale di 10 5 cellule / ml e una concentrazione finale di collagene di 2 mg / ml. Per esempio, per 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 388,81 ml di supporto contenente 10 5 cellule. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d'aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su un test del pH sviaggio.
  6. Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 30-45 minuti. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d'acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l'aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml.
  7. Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire i collagene / cella gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare. Mantenere a 37 ° C in 10% di CO 2 dell'aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni).

3. 3D Matrici TAMRA-collagene con sferoidi cellulari embedded

  1. Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix necessario per l'esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene.
  2. Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili.
  3. Mescolare 10x PBS, 1 N NaOH e supporti cellulari senza FBS in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di collagene-TAMRA Mix a pH 7,4, 100 pl di combinare 10x PBS, 5 ml di NaOH 1 N e 388,81 ml di media. Mescolare bene.
  4. Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di unlacollagene Beled. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d'aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su una striscia di test del pH.
  5. Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciarlo per iniziare la polimerizzazione per 2-5 min. Questo aiuterà a prevenire affondamento degli sferoidi, aumentando leggermente la viscosità del gel. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm.
  6. Raccogliere uno sferoide cella e metterlo su un piatto pulito Petri. Rimuovere ogni eccesso di liquido e risospendere in 10 ml di Tamra-Collagene Mix. Questo è importante per evitare la diluizione del collagene con supporti cellulari.
  7. Usando una pipetta P20, raccogliere il collagene sospeso sferoide e collocarlo sulla parte superiore centrale di 100 l TAMRA-Collagene goccia del Mix. Nota: Non inserire più di una sferoide per goccia di collagene, dal momento che possono influenzare l'un l'altro la capacità di invadere e / o migrare.
  8. Lasciare che il TAMRA-Collagene Mix di poliMerize a temperatura ambiente per 30-45 min. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d'acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l'aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml.
  9. Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire il collagene / sferoidi gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare.
  10. Conservare a 37 ° C in 10% di CO 2 aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di invadere / migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni).

4. 3D immunofluorescenza

  1. Rimuovere delicatamente il supporto di cellule e lavare le matrici di collagene contenenti cellule / sferoidi con PBS.
  2. Simultaneamente fissare e estrarre cellule mediante incubazione con estrazione / fissaggio tampone (PFA 4%, 0,3% Triton X-100, 5% di saccarosio in PBS) per 5 min. Supplemento il buffer con 2 mM falloidina e 2 mM Taxol per la visualizzazione di citoscheletro o proteine ​​del citoscheletro associati.
  3. Fissare ulteriormente le celle con 4% PFA, 5% di saccarosio in PBS per 30 min. Risciacquare con 0,05% di Tween-20 in PBS.
  4. Preparare le soluzioni di anticorpi primari in PBS. Incubare le cellule con anticorpi primari per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di aggiungere una soluzione sufficiente a coprire l'intera perdita di collagene. Per un piatto fondo di vetro 35 mm, 1,5-2 ml di soluzione sarà necessario. Nota: Per ridurre il volume della soluzione di anticorpo, una barriera insolubile in acqua, come ad esempio una linea circolare di grasso al silicone o un anello PDMS, può essere disposto intorno alla goccia collagene.
  5. Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS.
  6. Preparare anticorpi secondari coniugati con Alexa, soluzioni DAPI Alexa coniugato falloidina e in PBS. Incubare le cellule con gli appropriati anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente.
  7. Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS.
  8. Rimuovere l'eccesso di liquido, aggiungere abbastanza supporti di montaggio per riempire il fondo di vetro piatto fondo (circa 500 ml) e inserire un 24 millimetri coprioggetto sopra per sigillare. Non premere il vetrino per evitare di comprimere la caduta di collagene e di danneggiare l'organizzazione 3D.

5. Imaging campione

Disco microscopi confocale Classic o spinning può essere utilizzato. Un sistema capovolta può preferenzialmente essere usato per determinare la distanza delle cellule imaged dal fondo di vetro. Il sistema utilizzato per questo lavoro è un invertito confocale disco rotante dotato di una 40X/1.3NA e un 60X/1.4NA obiettivi ad immersione in olio (di lavoro distanze di 200 micron e 130 micron, rispettivamente), una fotocamera CoolSNAP fotometrici HQ2, 1392 x 1040 gamma di imaging, 6,45 x 6,45 micron pixel e controllate dal software Metamorph imaging. 405 nm, 491 nm, 561 nm e 633 nm laser sono in genere utilizzati a potenza 30-50%, guadagnare 1 e binning di 2x 2 per ridurre i tempi di esposizione. Il microscopio è inoltre dotato di una lampada a mercurio e cubetti di filtro per DAPI (EXC 400-418 nm; em 450-465), coniugati (exc 478-495; em 510-555) e Texas Red (exc 560-580; em 600 -650), da utilizzare con l'oculare.

  1. Utilizzando la lampada fluorescente, posizionare l'obiettivo 40X al centro della goccia collagene. Ottenere una panoramica del campione, sia nell'asse xy e l'asse z. Assicuratevi di non discostarsi più di 100 micron dal bordo gel sull'asse xy quando l'acquisizione delle immagini per evitare effetti di bordo. Quando sferoidi di imaging, assicurarsi che siano sotto la distanza di lavoro obiettivo. Cambiare obiettivo, se del caso.
  2. Passare alla modalità di imaging dal vivo confocale. Utilizzando il laser 561 nm per visualizzare il collagene TAMRA-etichettato, partendo dal fondo di vetro determinare il valore Z da cui le fibre di collagene cominciano ad apparire. Questo è il fondo substrato e z = 0.
  3. Usando la manopola di messa a fuoco, salire 100 micron da z = 0. Solo le celle a Z = 100 microno sopra dovrebbe essere ripreso per evitare gli effetti di tensione dal fondo di vetro rigida.
  4. Selezionare le celle di immagine. Ottimizzare i tempi di esposizione della fotocamera e la potenza del laser per ogni lunghezza d'onda. Tempi di esposizione tipici per DAPI e Alexa-488 falloidina sono tra i 100-200 msec. I tempi di esposizione per la colorazione degli anticorpi possono variare.
  5. Sulla modalità live confocale utilizzando il laser appropriato per visualizzare il falloidina colorazione e usando la manopola di messa a fuoco, definire l'intervallo di serie z, impostando valori z superiore e inferiore di corrente.
  6. Definire la dimensione z-passo. Per obiettivi 40X, utilizzare 1 micron. Per 60X, utilizzare 0,5 micron. Avvia acquisizione.

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Representative Results

Etichettatura coda di topo collagene I con TAMRA consente una preparazione facile e la visualizzazione delle reti di collagene 3D. Polimerizzazione lenta a pranzo risultati di temperatura nella formazione di reti di collagene con organizzazione paragonabili a quelle presenti in vivo 10.

Qui vi presentiamo un protocollo per immunofluorescenza del citoscheletro delle cellule tumorali CT26, sia come sferoidi e come cellule singole. Per conservare meglio il citoscheletro, i buffer sono integrate con senza etichetta falloidina e taxolo, farmaci noti per stabilizzare F-actina e microtubuli, rispettivamente. Inoltre, le cellule vengono fissate e contemporaneamente estratte per rimuovere nonpolymerized piscine tubulina citosolici che potrebbero interferire con la visualizzazione di microtubuli singoli. Questa tecnica può ugualmente essere utilizzato per visualizzare le proteine ​​citoscheletro-associate. Quando in 3D, CT26 cellule presenti una tipica morfologia mesenchimale caratterizzato da una forma allungatacorpo cellulare, punta con F-actina sporgenze ricche cellulari che assomigliano filopodia e lamellipodia (figure 1 e 2). Questa morfologia allungata è ancora più evidente in cellule che tentano di sfuggire sferoidi cellulari invadendo la matrice di collagene (Figura 2). La colorazione di microtubuli, utilizzando un anticorpo anti-tubulina mostra una rete di microtubuli ben conservato e organizzato (figure 1 e 2). Questa forma delle cellule notevolmente diversa da quella delle cellule CT26 in substrati 2D, dove di solito hanno diversi bordi d'attacco con grande larga lamellipodia pianeggiante e ben definiti filopodia 10.

Per elaborare le immagini acquisite in questo lavoro, Imaris è stato utilizzato. Questo software converte automaticamente il big acquisito z-stack in una proiezione in 3D di facile navigazione e la visualizzazione in tutti i piani (XY, XZ e YZ) e diversi angoli (figure 1, 2 e 3, orthogonavista l). Utilizzando la funzione "3D Crop", inutili piani z al di sopra o al di sotto della regione di interesse possono essere rimossi. Come rappresentato in figura 3, è fondamentale analizzare pile z raccolti da tutti i piani di vista di assicurare una distribuzione uniforme 3D delle cellule. In questo caso, CT26 cellule cresciute come sferoidi sembrano invadere una matrice di collagene 3D estesamente quando visualizzata come proiezione xy massimale. Tuttavia, una vista xz rivela che tutte le cellule sono invadendo un intervallo di z limitato rispetto al volume sferoide, suggerendo una regione preferenziale di invasione. Questo sferoide è infatti troppo vicino al fondo di vetro del piatto e cellule spostato veloce verso e sul substrato rigido 2D.

Figura 1
Figura 1. Citoscheletro delle cellule CT26 cellule tumorali incorporato in TAMRA marcato collagene I. Colsulla adenocarcinoma CT26 cellule sono state incorporate come cellule singole in 2 mg / ml TAMRA marcato collagene I (rosso). Immagini di immunofluorescenza di culture colorati con un anticorpo tubulina ai microtubuli etichette (blu), Alexa-488 falloidina per visualizzare F-actina (verde) e DAPI per la colorazione nucleare (ciano). 3D immagine corrisponde a xy proiezione massima di z-stack di 38 micron. Orthogonal xz (fondo Merge) e yz (diritto di Merge) fondono viste. Barra della scala, 20 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. Citoscheletro delle cellule CT26 cellule tumorali invadono TAMRA-etichettati collagene I. CT26 cellule cresciute come sferoidi cellulari sono stati incorporati in 2 mg / ml TAMRA marcato con collagene I (rosso). Dopo 2 giorni di coltura, le cellule hanno cominciato avading la matrice di collagene 3D, allontanandosi dalla cella sferoide. Immagini di immunofluorescenza di culture colorati con un anticorpo tubulina ai microtubuli etichette (blu), Alexa-488 falloidina per visualizzare F-actina (verde) e DAPI per la colorazione nucleare (ciano). 3D immagine corrisponde a xy proiezione massima di z-stack di 66 micron. Orthogonal xz (fondo Merge) e yz (diritto di Merge) fondono viste. Barra della scala, 50 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3. CT26 cellule invasione di collagene I è dipendente dalla distanza vetro. CT26 cellule sono state coltivate come sferoidi cellulari e incorporato in 2 mg / ml di collagene I. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule significativamente allontanati dalla sferoide cella, non invadendo tegli matrice di collagene 3D ma strisciando sul vetro rigida 2D. Immagini di fluorescenza di culture colorate con Alexa-488 falloidina per visualizzare F-actina. A) immagine 3D corrisponde a xy proiezione massima di z-stack di 200 micron. B) vista XZ ortogonale. Barra della scala, a 150 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Il protocollo qui descritto per etichettare fluorescently collagene I usando TAMRA fornisce un metodo eccellente per consentire una facile visualizzazione della organizzazione rete di collagene, utilizzando un microscopio confocale campione fornito di un laser a 561 nm. Un vantaggio di questa tecnica rispetto al riflettanza microscopia confocale è la capacità di immagine più profonde fibre collagene nella matrice 3D. L'intensità e contrasto della riflessione fibre diminuisce notevolmente con profondità dovuto assorbimento della luce laser e la dispersione. Inoltre, l'orientamento delle fibre collagene può essere un grave svantaggio quando si utilizza riflettanza microscopia confocale, poiché le fibre allineate circa 50 ° dal piano di imaging sono interamente inosservato. Fibre di fluorescenza marcata vengono rilevati con luminosità simile, indipendentemente dal loro orientamento 20. Un altro metodo che è stato sempre più utilizzati per visualizzare fasci di collagene, sia in vitro che in vivo, è di seconda generazione armonicarazione (SHG). Questo processo si basa sulla emissione di segnale SHG da strutture noncentrosymmetric, come il collagene 21. Tuttavia, SHG richiede un microscopio multifotone, che non fa parte dell'attrezzatura standard di imaging laboratorio.

L'uso di TAMRA come fluoroforo non è esclusivo. Altri fluorofori, come Cy2, Cy5 o la famiglia Alexa Fluor, commercialmente disponibile in kit di etichettatura proteine, possono essere utilizzati per etichetta collagene nel colore più conveniente per l'utente. Un altro vantaggio di usare collagene fluorescente è il potenziale per essere combinato con cellule trasfettate con proteine ​​fluorescenti-taggato in time-lapse imaging, per seguire da vicino le interazioni cellula-matrice o deformazioni della matrice cellulare indotte. Può anche essere utilizzato per sottili collagene coprioggetto di rivestimento in esperimenti 2D.

Incorporamento cellule in matrici 3D è una procedura delicata, soprattutto quando si usano grandi sferoidi, poiché hanno la tendenza ad affondare per gravità. Inoltre,cellule sono solitamente attratti da ambienti più rigidi e quando incorporati in regioni della matrice 3D abbastanza vicino al vetrino di vetro per sentire l'aumento di tensione indotto dal vetro, si muovono verso il substrato rigido 2D. Un trucco tecnico per aiutare a prevenire affondamento di grandi sferoidi è consentire il collagene per polimerizzare brevemente (2-5 min) prima di posizionare il sferoide sulla cima della goccia matrice. Questo aumenta leggermente la viscosità del gel, aumentando il tempo di affondamento. Tuttavia, è buona norma preparare diverse repliche per aumentare la probabilità di successo. D'altro canto, è importante mantenere le cellule sotto la distanza di lavoro obiettivo. Obiettivi a basso ingrandimento solito hanno grandi distanze di lavoro e possono essere utilizzati per le immagini di campo complesso, per esempio, di confrontare invasione di tipi cellulari diversi da uno sferoide. Quando sono richieste immagini ad alta risoluzione, acqua obiettivi ad immersione, con grandi distanze di lavoro, sono molto consigliato.

10. Non tentiamo di creare un protocollo generale immunoistochimica 3D. Come in 2D, ciascun anticorpo può richiedere una procedura di sintesi diversa e progettazione di un protocollo specifico per ciascun anticorpo potrebbe richiedered. Questo protocollo è presentato come punto di partenza, e viene suggerito che gli utenti includono un phalloidin colorazione fluorescente per fornire un'idea della forma delle cellule e la localizzazione all'interno della matrice.

Matrice di collagene di spessore sono una buona semplificato di sistema in vitro per studiare la migrazione delle cellule in un ECM fisiologica. Anche se manca la complessità chimica e fisica di un tessuto vivente, questo sistema permette la manipolazione delle proprietà ECM specifici, come dimensione dei pori, elasticità e reticolazione. Ci auguriamo che questi protocolli contribuiranno ad una migliore descrizione della composizione molecolare, localizzazione e funzioni delle strutture cellulari per molti anni analizzati in 2D e di migliorare la nostra conoscenza del comportamento delle cellule in 3D.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dott. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) per un'immagine acquisizione ed elaborazione in Figura 3 e PICT-IBISA Imaging Facility (Istituto Curie). Questo lavoro è stato sostenuto da ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 e PIC 3D - Complesso in modelli cellulari in vitro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
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References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

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Medicina Numero 80 TAMRA collagene matrice 3D sferoidi F-actina microtubuli
Rivelare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D
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Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

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