Summary
이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
세포 이동은 전통적으로 2D 기판에서 공부하고있다. 그러나, 그것은 더 나은 문제의 생리적 인 과정의 차원과 유사 더 적절한 3D 환경에서 세포의 이동을 연구 할 필요가 있다는 것을 점점 더 분명하게되었다. 철새 세포는 실질적으로 그들이 2D 또는 3D 기판에 이동 여부에 따라 그 형태와 마이그레이션 모드에서 다를 수 있습니다. 대부분의 표준 프로토콜, 3D 매트릭스 내에 포함 된 세포의 구조 및 기능 분석과 기술적 인 문제와 비 호환성으로 인해 여전히 드문 남아있다. 이 문서에서는 단일 세포 또는 상체로 하나, 준비 및 3D 암 세포 배양의 이미징을위한 방법을 설명합니다. 암 세포 이동에 적합한 ECM 기판으로, 우리는 내가 상온에서 중합 찬란 표준 공 촛점 현미경을 사용하여 시각화를 촉진하기 위해 표시 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐을 사용합니다. 이 작품은 protoc를 포함내인성 세포의 세포 뼈대의 3D 면역 형광 라벨링 OL. 우리는 분자 구성, 지역화, 그리고 3 차원 세포 구조의 기능을 잘 설명에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다 이러한 프로토콜을 사용.
Introduction
세포 이주의 필드는 새로운 세 번째 차원의 세계로 용감하게 맞서는되었습니다. 그것은 가장 밀접하게 생리 한 유사하고, (3D) 따라서, 입체 환경에서 세포의 이동을 연구하는 직관적이다. 그러나, 기술적 한계로, 대부분의 세포 이동 연구는 치료 또는 적합한 세포 외 기질 (ECM) 단백질을 코팅하거나, 딱딱한 두 개의 차원 (2D) 기판을 통해 세포의 움직임을 분석 해본 적이있다.
입체 콜라겐 격자에서 세포의 이동에 전념 첫 번째 연구 20 년 1-3에 돌아갑니다. 그러나, 지난 5 년 동안 그것은 철새 세포가 실질적으로 자신의 형태와 기질의 차원에 따라 마이그레이션 모드에서 다를 수있는 것이 분명되고있다. 2D로, 세포에만 넓은 평지 돌출의 형성 (lamellipodia)의 결과로, 초점 유착을 사용하여 복부 표면과 기판 연락자신의 앞 가장자리에 내장 된 손가락 같은 돌기 (filopodia). 이러한 구조는 함께 후행 가장자리 셀 앞을 연결 스트레스 섬유, 2D로 세포 이동에 중요한 것으로 생각된다. 3D 매트릭스에서 세포 형성과 이러한 구조의 많은 기능 관련에 상당한 변화를 일으키는, ECM 문의 전체 세포 표면으로, 일반적으로 더 연장됩니다. 반대로, 다른 세포의 기능은 ECM 개조 4에 관련된 핵 변형 및 구조와 같은 3D 이주 관련을 얻을 수 있습니다.
이러한 알려진 형태 변경뿐만 아니라 ECM과 세포 유형, 3D 매트릭스 내에 포함 된 세포의 구조와 기능 분석에 따라 달라질 수 있습니다 5-7 마이그레이션 모드의 차이에도 불구하고 여전히 드문 남아있다. 두께와 밀도 차원 행렬로 작업 기술 등의 고해상도 현미경 이미징 어려움, 대부분의 역에 호환성을 수행ndard 프로토콜은 내인성 단백질의 면역 형광 라벨처럼, 2D 문화에 최적화. 3D 매트릭스의 사용은 비교적 새로운 접근 방식이기 때문에 또한, 연구자들은 여전히 밀접하게 같은 다른 조직 기관의 정상적인 기질 아키텍처 나 종양 주변의 ECM 조직과 생체 내 상황에서 특정 닮은 최적의 조건을 조사하고 있습니다. 관련된 다른 그룹에 의한 결과 차이는, 예를 들어, 암 세포 이주의 모드 나 초점 유착의 존재는, 약간의 논쟁 8 생성 한. 많은 노력이 최근 ECM 화학적 특성, 기공 크기, 섬유 두께, 매트릭스 강성의 측면에서 합의에 도달하기 위해 최선을 다하고있다. 3D ECMs의 많은 다른 유형은 현재 세포 유래 행렬에서 시판 리겔, pepsinized 소 콜라겐 I, 또는 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐 I.이 행렬의 각 특정 물리적, 화학적 특성을 가지고 있으며, RELA 한 요구에 다양한 사용됩니다TE는 생리적 과정의 선택의 행렬이 연구되고있다. 또한, 기공 크기 및 섬유의 두께는 pH와 온도 9,10 등의 중합 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 유리와 같은 딱딱한 기판에서와 거리 바인딩도 행렬 10,11의 탄성 속성을 변경할 수 있습니다.
이 문서에서는 단일 세포 또는 상체로 하나, 준비 및 3D 암 세포 배양의 이미징을위한 방법을 설명합니다. 암 세포 구형 체를 만들기위한 방법은 이전에 매달려 드롭 방식 12,13와 아가로 오스 코팅 플레이트 방식 14되는 가장 인기있는 것들을 설명하고있다. 암 세포 이동에 적합한 ECM 기판으로, 난 방 온도에서 중합 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐은 2 밀리그램 / ML에서 사용됩니다. Nonpepsinized 산 추출 된 콜라겐 쥐의 꼬리에서 I는 모두 N-및 C-말단 telopeptides, 기본 콜라겐 intermolec에 대한 책임 콜라겐 분자의 nonhelical 부분을 유지ular 가교 fibrilar 안정성 15. 함께, 이러한 조건에 가장 가까운 생체 10에서 관찰 된 것과 유사하는 콜라겐 네트워크를 형성 할 수 있습니다. 고정 및 생활 문화 모두에서 콜라겐 섬유의 시각화를 허용하려면, 자세한 프로토콜은 찬란 5를 사용 관내 10 콜라겐 레이블을 제공 - (및 6) carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), 석신 에스테르. 이 프로토콜은 Baici 등에서 적응되었습니다. 형광 이소 티오 시아 네이트는 수용성 콜라겐 분자의 레이블을 지정하는 데 사용되는 16, 17,. 형광으로, TAMRA는 N-말단에서 무료 아미노 그룹과, 더 중요한 것은, 라이신의 측면 아미노 그룹으로 단백질의 nonprotonated 지방족 아미노 그룹과 반응하여 아미노 반응 형광 염료이다. 라이신 아미노산 그룹 nonprotonated 형태에있을 때이 반응은 기본적인 pH에서 발생합니다. TAMRA가에 형광보다 더 안정되고 이외에시간은 그것의 방출 스펙트럼은 유용 GFP - 태그 단백질의 라이브 셀 이미징 결합 될 수 레드 / 오렌지 범위 (예 / EM = 518분의 555 nm의)에 빠진다. 아미노 반응성 염료와 수용성 콜라겐라는 분자를 사용하여 중합 공정이나 밀도, 기공 크기 및 콜라겐 매트릭스 10,16,18,19의 가교 상태에 영향을주지 않습니다.
이 프로토콜은 또한 더 골격이나 골격 관련된 단백질을 라벨에 최적화 된 내인성 단백질의 3 차원 면역 형광 표시하는 방법을 포함하고 있습니다. 이 프로토콜의 마지막 초점은 콜라겐 매트릭스 장력 경질 유리 커버 슬립의 감소 공헌 공 촛점 현미경을 사용하여 3D 문화의 고해상도 영상을 획득하는 방법입니다.
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Protocol
1. TAMRA - 콜라겐 I 라벨링
- 공급 25 밀리그램 TAMRA 분말에 2.5 ML DMSO를 첨가하여 10 ㎎ / ㎖ TAMRA 솔루션을 준비합니다. 완전 용해 될 때까지 소용돌이로 교반하여 용해. -20 º C에서 보관하고 빛으로부터 보호합니다.
- 라벨 버퍼 (0.25 M NaHCO3를, 0.4 M의 NaCl)의 2 L를 준비합니다. 의 NaOH 10 M 용액을 사용하여 9.5로 산도를 조정합니다. 4 º C.에 보관 별도의 언급과 형광 물질은 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하지 않는 한이 시점에서, 모든 작업은 4 º C에서 수행됩니다.
- 고농도 쥐의 꼬리 콜라겐 I은 용액 1 ㎖와 1 ML 일회용 주사기를 채우십시오. 고농도 콜라겐 솔루션은 일반적으로 10 ㎎ / ㎖ 정도의 농도에서 제공하는 매우 점성 있습니다. 공기 거품의 형성을 피하기 위해 천천히 조작해야합니다.
- 21 G 피하 주사 바늘을 사용하여, MWCO가 끊어 10,000 presoaked 3 ML 투석 카세트에 콜라겐을 주입. DAMA 않도록주의하십시오바늘로 막 끼울. 주사기 피스톤을 당겨 투석 카세트에서 모든 공기를 제거합니다. 라벨 버퍼 1 L에 하룻밤을 Dialyze.
- 라벨 버퍼 900 μL와 10 ㎎ / ㎖ TAMRA 용액 100 μl를 섞는다. 참고 : DMSO 4 º C.에 얼어 때문에 이것은 상온에서 TAMRA 솔루션 및 라벨링 버퍼를 모두 수행해야 혼합 한 후, 희석 TAMRA 솔루션은 4 º C로 다시 가져
- 조심스럽게 21 G 피하 주사 바늘로 2 ㎖ 일회용 주사기를 사용하여 투석 카세트에서 콜라겐을 제거합니다. pipetting하여 희석 TAMRA 용액 1 ㎖와 투석 콜라겐 용액 1 ㎖를 혼합한다.
- 2 ML의 microcentrifuge 튜브에 콜라겐 / TAMRA 믹스를 이동하고 회전 밤새 품어.
- presoaked 3 ML 투석 카세트에 TAMRA - 라벨 콜라겐 2 ㎖를 전송하고 무료 색소의 과잉을 제거하는 버퍼 레이블의 1 L에 하룻밤 dialyze.
- TAMRA-실험실을 복원하려면콜라겐 원래 솔루션으로 모델링 콜라겐, 0.2 %의 1 L (v / v)의 아세트산 용액, pH를 4로 투석 카세트를 넣고 하룻밤 dialyze.
- TAMRA - 라벨 콜라겐의 최종 부피를 측정하여 사용 콜라겐 용액의 초기 볼륨과 집중을 고려하여 최종 농도를 계산한다. 4 º C.에 저장
2. 임베디드 단일 세포와 3D TAMRA-콜라겐 매트릭스
- 실험에 필요한 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스의 볼륨을 계산합니다. 항상 콜라겐 높은 점성으로 인한 손실을 피펫을 고려하여 20 % 이상을 준비합니다.
- 10X PBS 1 N NaOH를 재고 솔루션을 준비합니다. 4 º C.에 필터 소독 및 유지 관리 별도의 언급과 무균 조건 하에서 않는 한이 시점에서, 모든 작업이 얼음에 수행됩니다.
- 원하는 콜라겐 농도와 산도 7.4을 달성하기 위해 적절한 양의 10 배 PBS와 1 N NaOH를 섞는다. 예를 들어, 1 ML의 최종 볼륨pH가 7.4 TAMRA-콜라겐 믹스, 1N NaOH를 5 μL와 배 PBS 100 μl를 결합합니다. 잘 섞는다.
- TAMRA - 라벨 콜라겐과 2 MG / ML의 최종 합계 콜라겐 농도를 달성하기 위해 1:6 비율로 레이블 콜라겐 양의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스 1 ML의 최종 볼륨, 3.68 밀리그램 / ML TAMRA - 라벨 콜라겐과 4.01 ㎎ / 레이블 콜라겐 ML의 415.71 μL의 90.48 μl를 추가합니다. 공기 거품의 형성을 방지 pipetting하여 잘 천천히 섞는다.
- 10 5 세포 / ㎖, 2 MG / ML의 최종 콜라겐 농도의 최종 세포 농도를 얻기 위해 TAMRA-콜라겐 믹스에 FBS하지 않고 냉장 전지 매체의 적절한 볼륨 부유 세포를 추가합니다. 예를 들어, 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스 1 ㎖를 들어, 10 5 세포를 포함하는 미디어 388.81 μl를 추가합니다. 공기 거품의 형성을 방지 pipetting하여 잘 천천히 섞는다. 산도 시험의에 믹스의 10 μl를 테스트하여 산도를 확인여행.
- TAMRA-콜라겐 유리 바닥 요리 위에 혼합하고 30 ~ 45 분 동안 실온에서 중합 할 수 있도록 피펫 100 μL 상품 가격이 할인되었습니다. 100 μL 콜라겐 상품 7 mm의 전형적인 지름 높은 2mm이다. 중합 할 때, 콜라겐 화이트 흉내 젤로 바뀝니다. 참고 : 콜라겐 요리를 닫지 않고 중합하도록 허용하면 유리에서 박리 감소, 콜라겐 드롭 주위에 물 필름의 형성을 방지합니다. 준수를 높이기 위해 유리 접시가 100 ㎍ / ㎖에 폴리-L-라이신 코팅 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 콜라겐 / 셀 방울을 커버하기에 충분한 문화 매체를 추가합니다. 콜라겐 상품을 쉽게 분리 할 수 있기 때문에 미디어 또는 갑작스러운 움직임의 높은 플럭스을 피하십시오. 매트릭스 (일반적으로 1~3일)에서 마이그레이션하는 세포에 충분한 시간 동안 10 %의 CO 2 가습 공기 37 º C에서 보관하십시오.
3. 임베디드 셀 상체와 3D TAMRA-콜라겐 매트릭스
- 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 M의 볼륨을 계산실험에 필요한 IX. 항상 콜라겐 높은 점성으로 인한 손실을 피펫을 고려하여 20 % 이상을 준비합니다.
- 10X PBS 1 N NaOH를 재고 솔루션을 준비합니다. 4 º C.에 필터 소독 및 유지 관리 별도의 언급과 무균 조건 하에서 않는 한이 시점에서, 모든 작업이 얼음에 수행됩니다.
- 10X PBS를 혼합, 적절한 양의 FBS가없는 1 N 수산화 나트륨과 세포 미디어 원하는 콜라겐 농도와 산도 7.4을 달성하기 위해. 예를 들어, 산도 7.4 TAMRA-콜라겐 믹스 1 ML의 최종 볼륨, 10X PBS 100 μL, 1 N NaOH를 5 μL와 미디어의 388.81 μl를 결합합니다. 잘 섞는다.
- TAMRA - 라벨 콜라겐과 2 MG / ML의 최종 합계 콜라겐 농도를 달성하기 위해 1:6 비율로 레이블 콜라겐 양의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스 1 ML의 최종 볼륨, 3.68 밀리그램 / ML TAMRA - 라벨 콜라겐 90.48 μL와 UNLA의 4.01 MG / ML의 415.71 μl를 추가beled 콜라겐. 공기 거품의 형성을 방지 pipetting하여 잘 천천히 섞는다. 산도 테스트 스트립에 믹스의 10 μl를 테스트하여 산도를 확인합니다.
- TAMRA-콜라겐 유리 바닥 요리 위에 혼합하고 2-5 분 동안 중합을 개시 할 수 있도록 피펫 100 μL 상품 가격이 할인되었습니다. 이 약간 겔 점도를 증가시켜 상체의 침몰을 방지하는 데 도움이됩니다. 100 μL 콜라겐 상품 7 mm의 전형적인 지름 높은 2mm이다.
- 셀 회전 타원체를 수집하고 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다. 액체의 초과를 제거하고 TAMRA-콜라겐 믹스 10 μL에 resuspend을. 이 세포 미디어 콜라겐의 희석을 방지하는 것이 중요합니다.
- P20 피펫을 사용하여 콜라겐 회전 타원체 중단 수집하고 100 μL TAMRA-콜라겐 믹스 드롭의 상단 중앙에 놓습니다. 참고 :이 침입 및 / 또는 마이그레이션 서로 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 콜라겐 드롭 당 하나 이상의 회전 타원체를 놓지 마십시오.
- 폴리에 TAMRA-콜라겐 믹스 허용30-45 분 동안 실온에서 merize. 중합 할 때, 콜라겐 화이트 흉내 젤로 바뀝니다. 참고 : 콜라겐 요리를 닫지 않고 중합하도록 허용하면 유리에서 박리 감소, 콜라겐 드롭 주위에 물 필름의 형성을 방지합니다. 준수를 높이기 위해 유리 접시가 100 ㎍ / ㎖에 폴리-L-라이신 코팅 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 콜라겐 / 상체 방울을 커버하기에 충분한 문화 매체를 추가합니다. 콜라겐 상품을 쉽게 분리 할 수 있기 때문에 미디어 또는 갑작스러운 움직임의 높은 플럭스을 피하십시오.
- 셀이 매트릭스 (일반적으로 1~3일)에 침입 / 마이그레이션하려면 충분한 시간 동안 10 %의 CO 2 가습 공기 37 º C에서 보관하십시오.
4. 3D 면역 형광 염색
- 조심스럽게 전지 매체를 제거하고 PBS로 세포 / 상체를 포함하는 콜라겐 매트릭스를 헹구십시오.
- 동시에 수정 및 추출 / 고정 버퍼 (4 % PB의 PFA, 0.3 % 트리톤 X-100, 5 % 자당과 잠복기 세포를 추출5 분 S). 2 μM의 Phalloidin의와 뼈대 또는 골격 관련 단백질의 시각화를위한 탁솔 2 μM로 버퍼를 보충합니다.
- 4 % PFA, 30 분 동안 PBS에서 5 % 자당과 세포를 더 수정합니다. 0.05 % PBS에서 트윈-20와 린스.
- PBS의 기본 항체 솔루션을 준비합니다. 실온에서 또는 하룻밤 º C. 적어도 1 시간 동안 일차 항체와 세포를 배양 전체 콜라겐의 저하를 커버하기에 충분한 솔루션을 추가해야합니다. 35mm 유리 바닥 요리의 경우, 솔루션의 1.5 ML이 필요합니다. 주 : 항체 용액의 부피를 줄이기 위해 같은 실리콘 그리스 나 PDMS 링 써클 라인으로 불용성 장벽, 콜라겐 드롭 주위에 배치 할 수 있습니다.
- 0.05 % PBS에서 트윈-20과 배 30 분 씻으십시오.
- 알렉사 - 복합 이차 항체를 PBS의 알렉사 - 복합 phalloidin의와 DAPI 솔루션을 준비합니다. 실온에서 2 시간 동안 적절한 보조 항체와 세포를 품어.
- 배 3 세척0.05 % PBS에서 트윈-20와 0 분.
- 액체의 과잉을 제거 유리 바닥 접시 바닥 (약 500 μL)를 채우고 밀봉 상단에 24mm의 coverslip에 배치하는 미디어를 마운트만큼 추가 할 수 있습니다. 콜라겐 드롭을 압축하고 3D 조직의 손상을 방지하기 위해 coverslip을 아래로 누르지 마십시오.
5. 샘플 이미지
클래식이나 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용할 수 있습니다. 역 시스템은 우선적으로 유리 바닥에서 몇 군데 세포의 거리를 결정하는 데 사용되어야한다. 이 작품에 사용 된 시스템은 40X/1.3NA 및 60X/1.4NA 기름 침지 목표 (각각 거리가 200 ㎛ 및 130 μm의, 일), 배광 CoolSNAP HQ2 카메라 1392 X 1040 장착 거꾸로 공 촛점 스피닝 디스크입니다 이미지 배열, 6.45 X 6.45 μm의 픽셀 Metamorph 이미징 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 405 nm의 491 nm의 561 nm의 및 633 nm의 레이저는 일반적으로 30 % ~ 50 % 전력에서 사용되는, 1을 획득하고 2 비닝 (binning)X 2 노출 시간을 줄일 수 있습니다. , FITC (당일 478-495, 그들 510-555) 텍사스 레드 (당일 560-580; 현미경은 DAPI (EM 450-465 당일 400-418 nm의)에 대한 수은 램프 및 필터 큐브 장착되어 EM (600) -650) 눈 조각으로 사용할 수 있습니다.
- 형광등 사용, 콜라겐 드롭의 중간에서 40X 목표를 놓습니다. XY 축과 Z 축 모두에서 샘플의 개요를 얻을. 가장자리 효과를 방지하기 위해 이미지를 획득 할 때 XY 축 젤 가장자리에서 100 개 이상의 μm의 이탈하지 않도록합니다. 때 영상 상체, 그들은 목적 작동 거리의 밑에 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 목적을 변경합니다.
- 공 촛점 라이브 영상 모드로 전환합니다. 콜라겐 섬유가 나타나기 시작하는 Z 값을 결정하는 유리 바닥에서 시작, TAMRA - 라벨 콜라겐을 시각화하기 위해 561 nm의 레이저를 사용하여. 이 기판 바닥이며, Z = 0.
- 초점 노브를 사용하여, Z = 0 ~ 100 μm의를 이동합니다. Z = 100 μm의에서 세포만을이상은 경질 유리 바닥에서 긴장 효과를 방지하기 위해 몇 군데해야한다.
- 이미지 셀을 선택합니다. 각 파장에 대한 카메라의 노출 시간과 레이저 파워를 최적화합니다. DAPI와 알렉사 - 488 Phalloidin의에 대한 일반적인 노출 시간은 100 ~ 200 밀리 초 사이입니다. 항체 염색법에 대한 노출 시간이 다를 수 있습니다.
- 염색 초점 노브를 사용하여 Phalloidin의를 시각화하기 위해 적절한 레이저를 이용하여 공 촛점 라이브 모드에서 전류 상단과 하단의 Z 값을 설정하여 Z 시리즈 간격을 정의합니다.
- Z-스텝 크기를 정의합니다. 40X 목적을 위해, 1 ㎛를 사용합니다. 60X의 경우, 0.5 μm의를 사용합니다. 획득을 시작합니다.
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Representative Results
TAMRA와 쥐 꼬리 콜라겐 I에 레이블을 지정하면 3D 콜라겐 네트워크를 쉽게 준비 및 시각화 할 수 있습니다. 생체 내 10에있는 것과 유사한 조직과 콜라겐 네트워크의 형성에 실내 온도 결과에서 느린 중합.
여기에 우리가 상체로 및 단일 세포로 모두 CT26 암 세포의 세포 뼈대의 면역 염색을위한 프로토콜을 제시한다. 더 골격을 유지하려면, 버퍼는 각각 레이블 Phalloidin의 및 택솔 (taxol), F-액틴과 미세 소관을 안정화하는 것으로 알려진 약물로 보충된다. 또한, 세포는 동시에 고정 개별 소관의 시각화를 방해 할 수 nonpolymerized 세포질 tubulin에 풀을 제거하기 위해 추출됩니다. 이 기술은 동일하게 골격과 연관된 단백질을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 3D로, CT26 세포는 길쭉한 특징 전형적인 중간 엽 형태를 제시 할 때세포체는 filopodia 및 lamellipodia (그림 1, 2)과 유사한 F-액틴 풍부한 세포질 돌기로 쳐 냈습니다. 이 길쭉한 형태가 콜라겐 매트릭스 (그림 2)를 침입하여 세포 상체 탈출을 시도 세포에서 더욱 분명하다. 안티 - tubulin에 항체를 사용하여 미세 소관의 염색은 잘 보존하고 조직 미세 소관 네트워크 (그림 1과 2)를 보여줍니다. 이 셀 모양은 크게 그들은 일반적으로 큰 넓은 평면 lamellipodia 여러 선행 가장자리가와 filopodia 10 잘 정의 된 차원 기질에있는 CT26 세포의 하나에서 다릅니다.
이 작품에서 획득 한 이미지를 처리하는 Imaris을 사용 하였다. 이 소프트웨어는 자동으로 모든 평면에서 쉽게 탐색 및 시각화의 3D 프로젝션으로 취득한 큰 Z-스택 (XY, XZ 및 YZ)와 다른 각도 (그림 1, 2, 3, orthogona 변환L보기). "자르기 3D"기능을 사용하여, 위 또는 관심의 영역 아래에 불필요한 Z 평면을 제거 할 수 있습니다. 그림 3에 표시된 것처럼, 그것은 세포의 균일 한 3 차원 분포를 확인하기 위해 뷰의 모든 평면에서 수집 Z 스택을 분석하기 위해 매우 중요합니다. 이 경우, 상체로 성장 CT26 세포는 최대 XY 프로젝션으로 시각화 할 때 광범위하게 3D 콜라겐 매트릭스를 침공하는 것 같습니다. 그러나 XZ보기는 모든 세포가 침략의 우선 영역을 제안, 회전 타원체 부피에 비해 제한된 Z 간격을 침입하는 것을 보여줍니다. 이 타원체는쪽으로와 단단한 차원 기질에 빠른 이동 접시에 세포의 유리 바닥에 너무 가까이 사실입니다.
그림 1. CT26 세포 암 세포의 세포 뼈대는 TAMRA-라벨 콜라겐 I. 골에 포함선암에 CT26 세포는 2 밀리그램 / ML TAMRA - 라벨 콜라겐 I (빨간색)에서 단일 세포로 포함되었다. 라벨 소관에 tubulin에 항체 (파란색), 핵 염색을위한 F-액틴 (녹색) 및 DAPI (시안)을 시각화하는 알렉사 - 488 Phalloidin의 염색 문화의 면역 형광 이미지. 3D 이미지 38 ㎛의 Z-스택의 XY 최대 투사에 해당합니다. 직교 XZ (병합 하단)와 YZ (오른쪽 병합)의 전망을 병합합니다. 스케일 바, 20 μm의가. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 휴대 상체로 성장 TAMRA - 라벨 콜라겐 I. CT26 세포를 침입 CT26 세포 암 세포의 세포 뼈대는 2 밀리그램 / ML TAMRA - 라벨 콜라겐 I (빨간색)에 포함되었다. 문화 2 일 후, 세포에서 시작, 콜라겐 3D 매트릭스를 vading 세포 회전 타원체에서 멀리 이동. 라벨 소관에 tubulin에 항체 (파란색), 핵 염색을위한 F-액틴 (녹색) 및 DAPI (시안)을 시각화하는 알렉사 - 488 Phalloidin의 염색 문화의 면역 형광 이미지. 3D 이미지 66 ㎛의 Z-스택의 XY 최대 투사에 해당합니다. 직교 XZ (병합 하단)와 YZ (오른쪽 병합)의 전망을 병합합니다. 스케일 바, 50 μm의. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 나는 유리 거리에 따라 달라집니다. CT26 세포의 콜라겐 CT26 세포 침윤 세포의 상체로 성장 문화의 2 일 후 2 MG / ML 콜라겐 I.에 포함 된 세포는 크게하지 t 침입하여 세포 회전 타원체에서 멀리 이동그는 3D 콜라겐 매트릭스하지만 2D 경질 유리에 크롤링 있습니다. 문화의 형광 이미지는 F-액틴을 시각화하는 알렉사 - 488 Phalloidin의 염색.) 3D 이미지. B) 직교 XZ보기 200 ㎛의 Z-스택의 XY 최대 투사에 해당합니다. 스케일 바 150 μm의. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
프로토콜은 찬란 나는 561 nm의 레이저가 장착 된 표준 공 촛점 현미경을 사용하여 콜라겐 네트워크 조직을 쉽게 시각화 할 수 있도록하는 훌륭한 방법을 제공 TAMRA를 사용하여 콜라겐 레이블을 여기에 설명. 반사 공 촛점 현미경에 비해이 기술의 장점은 3D 매트릭스에 깊이 이미지 콜라겐 섬유의 기능입니다. 섬유 반사 강도와 대비 레이저 광 흡수와 산란에 의한 깊이를 실질적으로 감소. 섬유는 영상 평면에서 50 º 주위에 정렬 된 이후, 완전히 발견되지 반사율 공 촛점 현미경을하는 사용하는 경우 또한, 콜라겐 섬유의 방향은 큰 핸디캡이 될 수 있습니다. 찬란 - 라벨 섬유는 자신의 취향 20 독립의 밝기로 감지됩니다. 점점 vitro와 in vivo에서 모두 콜라겐 번들을 시각화하는 데 사용되었습니다 또 다른 방법은, 두 번째 고조파 세대 것입니다eration (SHG). 이 과정은 콜라겐 21 등 noncentrosymmetric 구조에 의해 신호를 SHG의 방출 기준으로합니다. 그러나 SHG은 표준 실험실 영상 장비의 일부가 아닌 다중 광자 현미경이 필요합니다.
형광으로 TAMRA의 사용은 독점하지 않습니다. 이러한 단백질 라벨 키트 시판 CY2, Cy5에 또는 알렉사 플 루어 제품군과 같은 다른 형광체는, 사용자에 대한 가장 편리한 색상 레이블 콜라겐을 사용할 수 있습니다. 형광 콜라겐을 사용하는 또 다른 장점은 밀접하게 세포 기질의 상호 작용이나 세포에 의한 매트릭스 변형을 따라 시간 경과 영상에 대한 찬란 - 태그 단백질 형질 세포와 결합 할 수있는 가능성이다. 또한 2D 실험에서 얇은 콜라겐 코팅 coverslips를 사용할 수 있습니다.
그들은 중력에 의한 침몰하는 경향이 있기 때문에 3D 행렬의 셀을 포함하면, 큰 구형 체를 사용하여 특히, 섬세한 절차입니다. 또한,세포는 일반적으로 엄격한 환경에 매료 충분히 근접 유리에 의해 유도 된 긴장의 증가를 느낄 수있는 유리 coverslip에에 3D 매트릭스의 영역에 포함 할 때, 그들은 엄격한 2D 기판으로 이동합니다. 큰 상체의 침몰을 방지하기 위해 기술적 인 트릭은 콜라겐 간단히 행렬 드롭의 상단에 회전 타원체하기 전에 (2-5 분) 중합 할 수 있도록하는 것입니다. 이 약간 가라 앉는 시간을 증가, 젤의 점도를 증가 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 성공의 가능성을 높이기 위해 복제 준비하는 것이 좋습니다. 반면에, 그것은 목적 작동 거리에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다. 낮은 배율 목표는 일반적으로 더 큰 작업 거리를 가지고 회전 타원체에서 다른 세포 유형의 침략을 비교하기 위해, 예를 들어, 전체 필드 이미지를 사용할 수 있습니다. 더 큰 작동 거리와 높은 해상도의 이미지가 필요합니다, 물이 침수 목표는 크게 권장됩니다.
10에서 이러한 paxilin, vinculin와 zyxin으로 초점 접착 마커, 레이블로 사용되었습니다. 우리는 일반적으로 3D 면역 염색 프로토콜을 만들려고 시도하지 마십시오. 2D에서와 마찬가지로, 각 항체는 각각의 항체가 요구 될 수에 대해 다른 고정 절차 및 특정 프로토콜의 설계가 필요할 수 있습니다라. 이 프로토콜은 시작점으로 제공됩니다, 그것은 사용자가 매트릭스 내에서 세포의 형태와 현지화의 아이디어를 제공하기 위해 염색 형광 Phalloidin의를 포함하는 것이 좋습니다.
두꺼운 콜라겐 매트릭스 생리 ECM에서 세포의 이동을 연구하는 생체 시스템의 좋은 단순화합니다. 그것은 살아있는 조직의 화학적 및 물리적 복잡성을 부족하지만,이 시스템은 기공 크기, 탄력과 가교와 같은 특정 ECM의 속성을 조작 할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜 차원에서 분석 수년 동안 분자 구성, 현지화 및 세포 구조의 기능을 잘 설명에 기여할 및 3D에서 세포 행동의 우리의 지식을 향상시킬 수 있도록 노력하겠습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 이미지는 그림 3과 PICT-IBISA 이미징 시설 (연구소 퀴리)에서 수집하고 처리 박사 바실리 Gurchenkov (문화원 퀴리)을 인정합니다. 체외 세포 모델에서 콤플렉스 -이 작품은 ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 및 PIC 3D에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
References
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