Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Avslører cytoskeletal Organisering av invasiv kreft celler i 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Denne artikkelen presenterer en metode for å fluorescently merke kollagen som kan videre brukes for både fiks og levende avbildning av 3D cellekulturer. Vi tilbyr også en optimalisert protokollen til å visualisere endogene cytoskeletal proteiner av celler dyrket i 3D-miljøer.

Abstract

Celle migrasjon har tradisjonelt blitt studert i 2D underlag. Imidlertid har det blitt mer og mer tydelig at det er et behov for å studere cellemigrering i mer hensiktsmessige 3D-omgivelser, noe som bedre ligner den dimensjonalitet de fysiologiske prosessene det gjelder. Trekkende celler kan betydelig ulik morfologi og modus for migrasjon avhengig av om de beveger seg på 2D eller 3D underlag. På grunn av tekniske problemer og kompatibilitetsproblemer med de fleste standard protokoller, strukturell og funksjonell analyse av celler innebygd i 3D-matriser fortsatt uvanlig. Denne artikkelen beskriver metoder for forberedelse og avbildning av 3D kreft cellekulturer, enten som enkeltceller eller sfæroider. Som en passende ECM substrat for kreft celle migrasjon, bruker vi nonpepsinized rotte hale kollagen jeg polymerisert ved rom-temperatur og fluorescensmerkede å lette visualisering ved hjelp av standard confocal mikroskoper. Dette arbeidet inkluderer også en protocol for 3D immunofluorescent merking av endogene celle cytoskeleton. Ved hjelp av disse protokollene vi håper å bidra til en bedre beskrivelse av molekylære sammensetning, lokalisering og funksjoner av cellulære strukturer i 3D.

Introduction

Feltet av celle migrasjon har trosset inn i den splitter nye tredimensjonale verden. Det er intuitivt å studere celle migrasjon i et miljø som ligner mest på det fysiologiske og derfor tredimensjonale (3D). Men på grunn av tekniske begrensninger, har de fleste cellemigrering studier er gjort analysere celle bevegelse over stive to-dimensjonal (2D) substrater, enten ubehandlet eller overtrukket med egnede ekstracellulære matriks (ECM) proteiner.

De første studiene dedikert til celle migrasjon i tredimensjonale kollagen gittere gå tilbake over 20 år 1-3. Men bare i løpet av de siste fem årene har det blitt klart at trekkende cellene kunne vesentlig ulik morfologi og modus for migrasjon avhengig av dimensjonalitet av underlaget. I 2D, celler bare berøre substratet med sin ventrale overflaten ved hjelp av fokal adhesjon, noe som resulterer i dannelsen av brede flate fremspring (lamellipodia) medinnebygde finger-lignende fremspring (filopodia) på sitt forkant. Disse strukturer, sammen med stress-fibrene som forbinder cellen fremre til den bakre kant, antas å være avgjørende for celle bevegelse i 2D. I 3D-matriser, celler er generelt mer langstrakt, med hele celleoverflaten kontakter ECM, forårsaker betydelige endringer i formasjonen og funksjonell relevans av mange av disse strukturer. Omvendt, andre cellulære funksjoner få relevans i 3D migrasjon, for eksempel kjernefysisk deformasjon og strukturer involvert i ECM ombygging fire.

Til tross for disse kjente morfologiske forandringer, så vel som forskjeller i migrasjon modi 5-7, som kan variere avhengig av ECM-og celletyper, strukturell og funksjonell analyse av celler som integrert i 3D matriser gjenstår fremdeles uvanlig. Arbeide med tykke og tette 3D-matriser bærer tekniske problemer, som for eksempel høy oppløsning mikroskopi bildebehandling, og kompatibilitetsproblemer med mest standard protokoller optimalisert for 2D kulturer, som immunofluorescent merking av endogene proteiner. Også, fordi bruken av 3D-matriser er en relativt ny tilnærming, er forskerne fortsatt etterforsker de beste forutsetninger for å ligne spesifikk in vivo situasjoner, for eksempel normal stromal arkitekturen i ulike vev organer eller ECM organisasjonen rundt en svulst. Avvik i resultatene fra ulike grupper om, for eksempel, har kreftcelle moduser av migrasjon eller eksistensen av fokale sammenvoksninger, generert en del kontrovers åtte. Mye arbeid har nylig blitt dedikert til å nå en enighet i form av ECM kjemiske natur, pore størrelse, fiber tykkelse, og matrise stivhet. Mange forskjellige typer 3D ECMS brukes i dag, varierende fra celle avledet matriser til kommersielt tilgjengelig matrigel, pepsinized kollagen I, eller nonpepsinized rotte hale kollagen I. Hver av disse matriser har spesifikke fysiske og kjemiske egenskaper og man trenger til forholdte matrisen av valget til den fysiologiske prosessen som studeres. I tillegg kan porestørrelsen og fibertykkelse avhenge av polymerisasjonsbetingelsene, slik som pH og temperatur 9,10. Binding til og avstand fra stive underlag som glass, kan også endre de elastiske egenskapene til matrisen 10,11.

Denne artikkelen beskriver metoder for forberedelse og avbildning av 3D kreft cellekulturer, enten som enkeltceller eller sfæroider. Fremgangsmåter for fremstilling av kreftcelle sfæroider tidligere har blitt beskrevet, er de mest populære blir den hengende dråpe-metoden 12,13 og agarose-belagt plate-metoden 14.. Som et passende substrat for ECM kreft cellemigrering, er nonpepsinized rottehale collagen I polymeriseres ved rom-temperatur ble brukt ved 2 mg / ml. Nonpepsinized syreekstraherte kollagen jeg fra rotte hale beholder både N-og C-terminal telopeptider, nonhelical deler av kollagen molekylet ansvarlige for native kollagen intermolecular tverrbindingssystem og fibrilar stabilitet 15. Sammen utgjør disse forholdene tillater dannelsen av kollagen nettverk som mest ligner de som er observert in vivo 10. Slik tillater visualisering av kollagenfibre, både i faste og levende kulturer, er en detaljert protokoll gitt til fluorescently merke kollagen in vitro 10 bruker 5 - (and-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimidyl ester. Denne protokollen har blitt tilpasset fra Baici et al. 16,17, hvor fluorescein-isotiocyanat blir brukt til å merke løselige kollagen molekyler. Som fluorescein, TAMRA er en amino-reaktivt fluorescerende fargestoff som reagerer med nonprotonated alifatiske aminogrupper av proteiner, som for eksempel den frie aminogruppen ved N-terminus, og, enda viktigere, siden aminogruppen i lysines. Denne reaksjon forekommer bare ved basisk pH, når lysin aminogruppen er i nonprotonated formen. I tillegg til TAMRA å være mer stabil enn fluorescein løpettid, faller utslippsforpliktelsen spektra på den oransje / røde området (ex / em = 555/518 nm), som kan være nyttig kombinert for live cell imaging av GFP-merket proteiner. Ved hjelp av oppløselig collagen merkede molekyler med amino-reaktive fargestoffer påvirker ikke polymerisasjonsprosessen eller tettheten, porestørrelse og tverrbinding status for kollagenmatriksen 10,16,18,19.

Denne protokollen innbefatter også en fremgangsmåte for 3D immunofluorescerende merking av endogene proteiner, som er ytterligere optimalisert for å merke cytoskjelettet eller cytoskjelett assosierte proteiner. Den endelige fokus for denne protokollen er på metoder for å skaffe høyoppløselige bilder av 3D-kulturer ved hjelp konfokalmikroskopi med redusert bidrag fra stive glass Dekkglass på kollagen matrise spenning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. TAMRA-kollagen I Merking

  1. Forbered en 10 mg / ml TAMRA løsning ved å tilsette 2,5 ml DMSO til det 25 mg TAMRA pulver. Oppløs det ved omrøring inntil fullstendig oppløsning. Oppbevares ved -20 º C og beskytte mot lys.
  2. Forbered 2 l Merking Buffer (0.25 M 3 NaHCO, 0,4 M NaCl). Juster pH til 9,5 ved anvendelse av 10 M oppløsning av NaOH. Lagres ved 4 º C. Fra dette punktet, blir alle operasjoner utført ved 4 º C, med mindre annet er oppgitt og fluoriserende materiale er beskyttet mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
  3. Fyll en 1 ml engangssprøyte med 1 ml av høykonsentrert rottehale collagen I løsning. Høy konsentrasjon kollagen løsninger tilveiebringes typisk ved konsentrasjoner rundt 10 mg / ml og er meget tyktflytende. Pass på å manipulere den sakte for å unngå dannelse av luftbobler.
  4. Ved hjelp av en 21 G kanyle, injisere kollagen i en presoaked 3 ml dialyse kassett på 10.000 MWCO avskåret. Vær forsiktig for å unngå damaging membranen med nålen. Fjern all luft fra dialyse kassetten ved å trekke opp sprøyten stempelet. Dialyser det over natten mot en L av Merking Buffer.
  5. Bland 100 ul av 10 mg / ml TAMRA-løsning med 900 pl av Merking buffer. Merk: Dette bør gjøres med både TAMRA løsning og merking Buffer ved romtemperatur siden DMSO fryser ved 4 º C. Etter blanding bringe den fortynnede TAMRA oppløsningen tilbake til 4 º C.
  6. Fjern forsiktig kollagen fra dialyse kassett med en 2 ml engangssprøyte med en 21 G kanyle. Bland 1 ml av den dialyserte oppløsning kollagen med 1 ml av fortynnet TAMRA løsning ved pipettering.
  7. Overfør kollagen / TAMRA blanding inn i et 2 ml mikrosentrifugerør og inkuberes over natten med rotasjon.
  8. Overfør 2 ml TAMRA-merket kollagen inn i en presoaked 3 ml dialyse kassett og Dialyser over natten mot en L av merking buffer for å fjerne overskudd av gratis fargestoff.
  9. Å gjenopprette TAMRA-labeLED kollagen til kollagen opprinnelige løsningen, plasserer dialyse kassetten i en L av 0,2% (v / v) eddiksyre-løsning, med pH 4, og Dialyser over natten.
  10. Mål sluttvolum på den TAMRA-merket kollagen og beregne dens sluttkonsentrasjon, tatt i betraktning den opprinnelige volum og konsentrasjonen av kollagen-løsning anvendes. Oppbevar ved 4 º C.

2. 3D TAMRA-kollagen matriser med Embedded enkeltceller

  1. Beregn volum på 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix nødvendig for forsøket. Alltid forberede 20% mer å gjøre rede for pipettering av tap på grunn av kollagen med høy viskositet.
  2. Tilbered en stamløsning av 10x PBS og 1 N NaOH. Filter-sterilisere og vedlikeholde ved 4 º C. Fra dette punktet, blir alle operasjoner utført på isen hvis ikke annet er oppgitt og under sterile forhold.
  3. Bland 10x PBS og 1 N NaOH i passende mengder for å oppnå den ønskede konsentrasjon kollagen og pH 7,4. For eksempel, for et sluttvolum på 1 mlav TAMRA-Kollagen Mix ved pH 7,4, kombiner 100 mL av 10x PBS med 5 pl av 1 N NaOH. Bland godt.
  4. Legg til det aktuelle volum av både TAMRA-merket kollagen og ikke-merket kollagen i et 01:06-forhold for å oppnå et endelig samlet kollagen konsentrasjon på 2 mg / ml. For eksempel, for et sluttvolum på 1 ml av 2 mg / ml kollagen TAMRA-Mix, tilsett 90,48 pl av 3,68 mg / ml TAMRA-merket kollagen og 415,71 pl av 4,01 mg / ml ikke-merket kollagen. Bland godt og sakte med pipettering, unngå dannelse av luftbobler.
  5. Legg celler suspendert i passende volum av avkjølt celle medium uten FBS til TAMRA-Collagen blandingen for å oppnå en endelig celletetthet på 10 5 celler / ml og en endelig kollagen konsentrasjon på 2 mg / ml. For eksempel, for en ml 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix, tilsett 388,81 mL av media inneholdende 10 5 celler. Bland godt og sakte med pipettering, unngå dannelse av luftbobler. Kontroller pH-verdien ved å teste 10 pl av blandingen på en pH-test stur.
  6. Pipette 100 mL dråper TAMRA-Collagen Mix på glassbunn retter og la den polymerisere ved romtemperatur i 30-45 min. 100 mL kollagen dråper har en typisk diameter på 7 mm og er 2 mm høy. Når polymerisert, slår kollagen inn i en hvit-ish gel. Merk: Å la kollagen å polymerisere uten å lukke retten vil unngå dannelse av en vann film rundt kollagen dråpe, redusere løsrivelse fra glasset. For å øke tilslutning, kan glass retter være belagt med poly-L-lysin ved 100 ug / ml.
  7. Tilsett forsiktig tilstrekkelig dyrkningsmedium for å dekke kollagen / celle dråper. Unngå høye fluks av media eller brå bevegelser siden kollagen dråper kan lett løsne. Lagres ved 37 º C i 10% CO 2 luftfuktighet for nok tid for cellene å migrere i matrisen (vanligvis 1-3 dager).

3. 3D TAMRA-kollagen matriser med Embedded Cell Spheroids

  1. Beregn volum på 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix nødvendig for forsøket. Alltid forberede 20% mer å gjøre rede for pipettering av tap på grunn av kollagen med høy viskositet.
  2. Tilbered en stamløsning av 10x PBS og 1 N NaOH. Filter-sterilisere og vedlikeholde ved 4 º C. Fra dette punktet, blir alle operasjoner utført på isen hvis ikke annet er oppgitt og under sterile forhold.
  3. Bland 10x PBS, til en NaOH og celle-media uten FBS i passende volumer oppnå den ønskede konsentrasjon kollagen og pH 7,4. For eksempel, for et sluttvolum på 1 ml TAMRA-Kollagen Mix ved pH 7,4, kombiner 100 ul av 10 x PBS, 5 pl av 1 N NaOH og 388,81 mL av mediet. Bland godt.
  4. Legg til det aktuelle volum av både TAMRA-merket kollagen og ikke-merket kollagen i et 01:06-forhold for å oppnå et endelig samlet kollagen konsentrasjon på 2 mg / ml. For eksempel, for et sluttvolum på 1 ml av 2 mg / ml kollagen TAMRA-Mix, tilsett 90,48 pl av 3,68 mg / ml TAMRA-merket kollagen og 415,71 pl av 4,01 mg / ml unlaBeled kollagen. Bland godt og sakte med pipettering, unngå dannelse av luftbobler. Kontroller pH-verdien ved å teste 10 pl av blandingen på en pH-strimmel.
  5. Pipette 100 mL dråper TAMRA-Collagen Mix på glassbunn retter og la den starte polymerisering for 2-5 min. Dette vil bidra til å hindre senkingen av de sfæroider ved litt økt gel viskositet. 100 mL kollagen dråper har en typisk diameter på 7 mm og er 2 mm høy.
  6. Samle en celle spheroid og plassere den på et rent petriskål. Fjern overflødig væske og resuspender den i 10 ul TAMRA-Collagen Mix. Dette er viktig for å hindre fortynning av kollagen med celle medier.
  7. Ved hjelp av en P20 pipette, samle kollagen suspendert spheroid og plassere den på midten øverst på 100 ul TAMRA-Collagen Mix slipp. Merk: Ikke legg mer enn én spheroid per kollagen drop, siden de kan påvirke hverandre kapasitet til å invadere og / eller migrere.
  8. La TAMRA-Collagen Mix til polymerize ved romtemperatur i 30-45 min. Når polymerisert, slår kollagen inn i en hvit-ish gel. Merk: Å la kollagen å polymerisere uten å lukke retten vil unngå dannelse av en vann film rundt kollagen dråpe, redusere løsrivelse fra glasset. For å øke tilslutning, kan glass retter være belagt med poly-L-lysin ved 100 ug / ml.
  9. Tilsett forsiktig tilstrekkelig kulturmedium for å dekke kollagen / sfæroider dråper. Unngå høye fluks av media eller brå bevegelser siden kollagen dråper kan lett løsne.
  10. Lagres ved 37 º C i 10% CO 2 luftfuktighet for nok tid for celler å invadere / migrere i matrisen (vanligvis 1-3 dager).

4. 3D Immunfluorescens Farging

  1. Fjern forsiktig cellen media og skyll kollagen matriser som inneholder celler / sfæroider med PBS.
  2. Samtidig fikse og trekke ut cellene ved inkubering med ekstraksjon / fiksering buffer (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% sukrose i PBS) i 5 min. Supplere buffer med 2 mikrometer Phalloidin og 2 mM Taxol for visualisering av cytoskjelettet eller cytoskjelettet assosiert proteiner.
  3. Ytterligere feste celler med 4% PFA, 5% sakkarose i PBS i 30 min. Rens med 0,05% Tween-20 i PBS.
  4. Forbered primære antistoffer løsninger i PBS. Inkuber cellene med primære antistoffer i minst 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. Sørg for å legge nok løsning for å dekke hele kollagen slipp. For en 35 mm glassbunn fatet, blir 1,5-2 ml oppløsning være nødvendig. Bemerk: For å redusere volumet av antistoff-løsning, kan et vannuoppløselig barriere, slik som en sirkellinje med silikonfett eller et PDMS ring, plasseres rundt kollagen slipp.
  5. Vask 3 x 30 min med 0,05% Tween-20 i PBS.
  6. Forbered Alexa-konjugert sekundære antistoffer, Alexa-konjugert phalloidin og DAPI løsninger i PBS. Inkuber cellene med passende sekundære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur.
  7. Vask 3x 30 min med 0,05% Tween-20 i PBS.
  8. Fjern overflødig væske, tilsett nok montering media til å fylle glasset bunnen fatet bunnen (ca. 500 mL) og plasser en 24 mm dekkglass på toppen for å forsegle. Ikke trykk ned dekkglass for å unngå å komprimere kollagen fall og skader 3D organisasjonen.

5. Sample Imaging

Klassisk eller spinnende disk konfokale mikroskoper kan brukes. En invertert system bør fortrinnsvis brukes for å bestemme avstanden av de avbildes celler fra glassbunn. Systemet brukes til dette arbeidet er en Inverted Confocal Spinning Disk utstyrt med en 40X/1.3NA og en 60X/1.4NA olje-immersion mål (arbeider avstander 200 mikrometer og 130 mikrometer, henholdsvis), en Fotometri CoolSNAP HQ2 kamera, 1392 x 1040 bildebehandling array, 6,45 x 6,45 mikrometer piksler og styres av Metamorph bildebehandlingsprogrammer. 405 nm, 491 nm, 561 nm og 633 nm lasere brukes vanligvis på 30-50% strøm, får en og binning av 2x 2 for å redusere eksponering ganger. Mikroskopet er også utstyrt med en Hg lampe og filter kuber for DAPI (exc 400-418 nm, em 450-465), FITC (exc 478-495; em 510-555) og Texas Red (exc 560-580; em 600 -650) til bruk med øyet stykke.

  1. Ved hjelp av fluoriserende lampe, plasserer 40X objektiv på midten av kollagen slipp. Få en oversikt over prøven, både i xy-aksen og i z-aksen. Pass på å ikke avvike mer enn 100 mikrometer fra gelen kanten på xy aksen når anskaffe bildene for å unngå kanteffekter. Når bildebehandling sfæroider, sørg for at de er under målet arbeidsavstand. Endre objektiv hvis det er hensiktsmessig.
  2. Bytt til confocal direkte avbildning modus. Som bruker 561 nm laser for å visualisere TAMRA-merket kollagen, fra glassbunn beregne z-verdien som kollagenfibre begynner å vises. Dette er underlaget bunn og z = 0.
  3. Bruke fokusskruen, gå opp 100 mikrometer fra z = 0. Bare celler ved z = 100 mikrometereller ovenfor skal avbildes for å unngå spenning effekter fra den stive glassbunn.
  4. Merk cellene til bilde. Optimalisere kameraets eksponeringstider og laser makt for hver bølgelengde. Typiske eksponeringstider for DAPI og Alexa-488 Phalloidin er mellom 100-200 millisekunder. Eksponeringstider for antistoffarging kan variere.
  5. På confocal live mode ved hjelp av riktig laser for å visualisere phalloidin flekker og bruke fokusskruen, definere z serien intervall ved å sette øvre og nedre z verdiene til strøm.
  6. Definer z-trinns størrelse. For 40X målsettinger, bruke en mikrometer. For 60X, bruker 0,5 mikrometer. Starte oppkjøpet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Merking rotte-hale kollagen jeg med TAMRA gir en enkel forberedelse og visualisering av 3D kollagen nettverk. Slow polymerisasjon ved romtemperatur resulterer i dannelsen av kollagen nettverk med tilsvarende organisasjon til de som finnes i vivo 10.

Her presenterer vi en protokoll for immunfluorescens farging av cytoskjelettet av CT26 kreftceller, både som sfæroider og som enkeltceller. For bedre å bevare cytoskjelettet, er buffere supplert med umerket phalloidin og Noel Coward, legemidler som er kjent for å stabilisere F-aktin og mikrotubuli, henholdsvis. I tillegg er celler samtidig fast og trekkes ut for å fjerne nonpolymerized cytosolic tubulin bassenger som kan forstyrre med visualisering av individuelle mikrotubuli. Denne teknikk kan likeledes anvendes for å visualisere cytoskjelett-assosierte proteiner. Når du er i 3D, CT26 celler presentere en typisk mesenchymal morfologi preget av en langstraktcellen kroppen, tippet med F-aktin rike mobilnettet utstikkere som ligner filopodia og lamellipodia (figur 1 og 2). Denne langstrakte morfologi blir enda mer fremtredende i celler som forsøker å unnslippe cellulære sfæroider ved å invadere den kollagenmatriksen (figur 2). Farging av mikrotubuli ved hjelp av et anti-tubulin-antistoff viser en godt bevart og organisert mikrotubuli-nettverket (figur 1 og 2). Denne cellen form skiller seg mye fra en av CT26 celler i 2D underlag, hvor de vanligvis har flere ledende kanter med stor, bred flat lamellipodia og veldefinerte filopodia 10.

Å behandle de oppkjøpte bilder i dette arbeidet, ble Imaris brukt. Denne programvaren automatisk konverterer den oppkjøpte big z-stabler inn i en 3D-projeksjon av enkel navigering og visualisering i alle plan (xy, xz og yz) og ulike vinkler (figur 1, 2 og 3, orthogonal visninger). Bruke "Crop 3D"-funksjonen, kan unødvendige z fly over eller under regionen interesserte bli fjernet. Som representert i figur 3, er det avgjørende å analysere innsamlede z stabler fra alle plan av visningen for å sikre en ensartet fordeling av 3D-cellene. I dette tilfellet, CT26 celler dyrket som sfæroider synes å invadere en 3D kollagenmatriksen utstrekning når visualisert som maksimaldose xy projeksjon. Imidlertid viser en xz oppfatning at alle cellene invaderer en begrenset z intervall i forhold til spheroid volum, noe som tyder på en fortrinnsrett regionen invasjon. Det sfæriske legemet er faktisk for nær glasset bunnen av skålen og cellene beveget hurtig mot og på den stive 2D substratet.

Figur 1
Figur 1. Cytoskjelett CT26 celler kreftceller innebygd i TAMRA-merket kollagen I. Colpå adenokarsinom CT26 celler ble innebygd som enkeltceller i 2 mg / ml TAMRA-merket kollagen I (red). Immunofluorescence bilder av kulturer farget med en tubulin antistoff til å merke mikrotubuli (blå), Alexa-488 phalloidin å visualisere F-aktin (grønn) og DAPI for nukleær farging (cyan). 3D-bilde tilsvarer xy maksimal projeksjon av z-stabler av 38 mikrometer. Orthogonal xz (nederst på Merge) og yz (til høyre for Merge) fusjonere utsikt. Scale bar, 20 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2
Figur 2. Cytoskjelett CT26 celler kreftceller invaderende TAMRA-merket kollagen I. CT26 celler dyrket som cellulære sfæroider var innebygd i 2 mg / ml TAMRA-merket kollagen I (red). Etter 2 dager i kultur, begynte cellene ivading kollagen 3D matrix, beveger seg bort fra cellen spheroid. Immunofluorescence bilder av kulturer farget med en tubulin antistoff til å merke mikrotubuli (blå), Alexa-488 phalloidin å visualisere F-aktin (grønn) og DAPI for nukleær farging (cyan). 3D-bilde tilsvarer xy maksimal projeksjon av z-stabler av 66 mikrometer. Orthogonal xz (nederst på Merge) og yz (til høyre for Merge) fusjonere utsikt. Scale bar, 50 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3. CT26 celler invasjon i collagen I er avhengig av glass avstand. CT26 celler ble dyrket som cellulære sfæroider og innvikles i 2 mg / ml kollagen I. Etter 2 dager i kultur, celler signifikant beveget bort fra cellen sfæroide, ikke ved å invadere tHan 3D kollagen matrise, men ved å krabbe på 2D stive glass. Fluorescens bilder av kulturer farget med Alexa-488 phalloidin å visualisere F-aktin. A) 3D-bilde tilsvarer xy maksimal projeksjon av z-stabler av 200 mikrometer. B) Orthogonal xz utsikt. Scale bar, 150 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen er beskrevet her for å fluorescently merke kollagen jeg bruker TAMRA gir en utmerket metode for å tillate enkel visualisering av kollagen nettverksorganisasjon, ved hjelp av en standard konfokalmikroskop utstyrt med en 561 nm laser. En fordel med denne teknikken å sammenligne reflektans konfokal mikroskopi er evnen til bildet kollagenfibre dypere inn i 3D matrise. Intensiteten og kontrast i fibrene refleksjon avtar vesentlig med dybden på grunn av laserlys absorpsjon og spredning. Dessuten kan orienteringen av kollagenfibre være et stort handikap når du bruker refleksjon konfokalmikroskopi, er fordi fibrene justert rundt 50 º fra bildebehandling flyet helt usett. Fluorescensmerket-merket fibre blir detektert med lik lysstyrke, uavhengig av deres orientering 20. En annen metode som har blitt stadig mer brukt for å visualisere kollagen bunter, både in vitro og in vivo, er ved andre harmoniske gensjonen (SHG). Denne prosessen er basert på emisjon av SHG signal ved noncentrosymmetric strukturer, slik som kollagen 21.. Imidlertid krever SHG en multiphoton mikroskop, som ikke er en del av standard lab bildeutstyr.

Bruken av TAMRA som en fluorofor er ikke ekskluderende. Andre fluorophores, for eksempel Cy2, Cy5 eller Alexa Fluor familien, kommersielt tilgjengelig i protein merking kits, kan brukes til å merke kollagen i den mest praktiske fargen for brukeren. En annen fordel med å bruke fluoriserende kollagen er potensial til å bli kombinert med celler transfektert med fluorescently-merkede proteiner for time-lapse imaging, å nøye følge celle-matrix interaksjoner eller celle-indusert matrise deformasjoner. Den kan også benyttes for tynne kollagen belegg dekkglass i 2D eksperimenter.

Inkludering celler i 3D-matrikser er en delikat prosess, spesielt ved bruk av store sfæroider, siden de har en tendens til å synke på grunn av tyngdekraften. Ogsåer celler vanligvis tiltrukket stivere miljøer og når innebygd i regioner av 3D matrix nær nok til glass dekkglass å føle økningen i spenning indusert av glass, de beveger seg mot den stive 2D underlaget. En teknisk triks for å hindre sinking av store sfæroider er å tillate kollagen kort skal polymerisere (2-5 min) før plassering av sfæroide på toppen av matrisen slipp. Dette vil lett øke viskositeten av gelen, noe som øker den synkende tid. Likevel er det lurt å forberede flere gjentak å øke sannsynligheten for suksess. På den annen side er det viktig å holde cellene under objektiv arbeidsavstand. Lavere forstørring mål har vanligvis større arbeidsavstander og kan brukes til på åkeren bilder, for eksempel, å sammenligne invasjon av forskjellige celle-typer fra en sfæroide. Når høyere oppløsning er nødvendig, vann nedsenking mål, med større arbeider avstander, er sterkt anbefalt.

10. Vi forsøker ikke å lage en generell 3D farging protokollen. Som i 2D, kan hver antistoff krever en annen fiksering fremgangsmåte og utforming av en bestemt protokoll for hvert antistoff kan kreved. Denne protokollen er presentert som utgangspunkt, og det er foreslått at brukerne omfatter en fluorescerende phalloidin beising for å gi et inntrykk av cellen form og lokalisering inne i matriksen.

Tykke kollagen matriser er et forenklet god in vitro-system for å studere cellemigrering i en fysiologisk ECM. Selv om det mangler de kjemiske og fysiske kompleksitet i et levende vev, gjør dette system manipulering av spesifikke ECM egenskaper, for eksempel porestørrelse, elastisitet og tverrbinding. Vi håper disse protokollene vil bidra til en bedre beskrivelse av molekylære sammensetning, lokalisering og funksjoner av cellulære strukturer i mange år analysert i 2D og å øke kunnskapen om celle atferd i 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) for bilde innhenting og bearbeiding i figur 3 og PICT-IBISA Imaging Facility (Institute Curie). Dette arbeidet ble støttet av ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 og PIC 3D - Complex in vitro mobilnettet modeller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

Tags

Medisin TAMRA kollagen 3D matrix sfæroider F-aktin microtubules
Avslører cytoskeletal Organisering av invasiv kreft celler i 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter