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Medicine

Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Este artigo apresenta um método para rotular fluorescência de colagénio que pode ser ainda utilizado para ambos e correcção de imagem ao vivo de culturas de células em 3D. Nós também fornecer um protocolo optimizado para visualizar as proteínas do citoesqueleto endógenos de células cultivadas em ambientes em 3D.

Abstract

A migração celular tem sido tradicionalmente estudado em substratos 2D. No entanto, tornou-se cada vez mais evidente que existe uma necessidade de estudar a migração celular em ambientes 3D mais adequadas, que melhor se assemelham a dimensionalidade dos processos fisiológicos em questão. Células migratórias podem diferir substancialmente em sua morfologia e modo de migração, dependendo se eles estão se movendo em substratos 2D ou 3D. Devido a dificuldades técnicas e incompatibilidades com a maioria dos protocolos padrão, análise estrutural e funcional das células embutidas dentro de matrizes 3D ainda é incomum. Este artigo descreve a preparação e métodos para imagiologia de culturas de células de cancro em 3D, seja como células isoladas ou esferóides. Como substrato de ECM apropriada para a migração de células do cancro, usamos nonpepsinized colagénio de cauda de rato I polimerizada a temperatura ambiente e marcado por fluorescência para facilitar a visualização utilizando microscopia confocal padrão. Este trabalho inclui também um protocolool para a rotulagem 3D imunofluorescência de citoesqueleto endógena. Usando estes protocolos Esperamos contribuir para uma melhor descrição da composição molecular, localização e funções das estruturas celulares em 3D.

Introduction

O campo da migração celular foi enfrentando no novo mundo tridimensional. É intuitivo para estudar a migração de células num ambiente que mais se assemelha a uma fisiológico e, portanto, tridimensional (3D). No entanto, devido às limitações técnicas, estudos de migração celular mais ter sido feito analisando o movimento da pilha em frente de duas dimensões (2D) substratos rígidos, quer não tratadas ou revestidas com proteínas da matriz extracelular (ECM adequados).

Os primeiros estudos dedicados à migração de células em três treliças tridimensionais de colágeno voltar mais de 20 anos 1-3. No entanto, apenas durante os últimos 5 anos, tornou-se evidente que as células migradoras podem diferir substancialmente no seu modo de morfologia e da migração de acordo com a dimensão do substrato. Em 2D, apenas as células contactar o substrato com a sua superfície ventral utilizando adesões focais, resultando na formação de saliências planas grandes (lamellipodia) comembarcados saliências digitiformes (filopodia) em sua ponta. Estas estruturas, em conjunto com fibras de stress que se conectam frente da célula para o bordo de fuga, acredita-se ser crucial para o movimento das células em 2D. Nas matrizes 3D, as células são geralmente mais alongada, com a superfície de contacto da célula inteira de ECM, provocando alterações consideráveis ​​na formação e relevância funcional de muitas destas estruturas. Por outro lado, outras características celulares ganhar relevância na migração 3D, tais como a deformação nuclear e as estruturas envolvidas na remodelação de ECM 4.

Apesar destas alterações morfológicas conhecidas, bem como as diferenças nos modos de migração de 5-7, que pode variar dependendo do ECM e tipos de células, a análise estrutural e funcional das células embutidas dentro de matrizes 3D ainda permanece fora do comum. Trabalhando com matrizes 3D espessa e densa traz dificuldades técnicas, tais como imagens de microscopia de alta resolução, e incompatibilidades com a maioria staprotocolos ndard otimizado para culturas em 2D, como a rotulagem de imunofluorescência de proteínas endógenas. Além disso, porque a utilização de matrizes 3D é uma abordagem relativamente nova, os investigadores continuam a investigar as melhores condições para se assemelham específico de situações in vivo, tais como a arquitectura do estroma normais de diferentes órgãos ou tecidos do organismo ECM em torno de um tumor. Discrepâncias nos resultados por diferentes grupos em relação, por exemplo, os modos de células de câncer de migração ou a existência de adesões focais, têm gerado alguma controvérsia 8. Um grande esforço tem sido recentemente dedicada a um consenso em termos de ECM natureza química, o tamanho dos poros, espessura da fibra, e a rigidez da matriz. Muitos tipos diferentes de ECMs 3D são actualmente utilizados, variando a partir de matrizes derivadas de células de matrigel comercialmente disponível, o colagénio bovino pepsinized I, ou de colagénio de cauda de rato nonpepsinized I. Cada uma destas matrizes tem propriedades físicas e químicas específicas e é preciso relate a matriz de escolha para o processo fisiológico a ser estudado. Além disso, o tamanho e espessura de fibra de poros pode depender das condições de polimerização, tais como pH e temperatura 9,10. Ligação e a distância a partir de substratos rígidos, tais como vidro, podem também alterar as propriedades elásticas da matriz 10,11.

Este artigo descreve a preparação e métodos para imagiologia de culturas de células de cancro em 3D, seja como células isoladas ou esferóides. Os métodos para produzir esferóides de células cancerosas tem sido descrito anteriormente, as mais populares, sendo os pelo método de gota suspensa 12,13 eo método de placa de agarose revestidos 14. Como substrato de ECM apropriada para a migração de células do cancro, nonpepsinized colagénio de cauda de rato I polimerizada a temperatura ambiente é utilizada a 2 mg / ml. Nonpepsinized colágeno extraídas com ácido e eu de cauda de rato mantém ambos os C-terminal e N-telopeptídeos, porções nonhelical da molécula de colágeno responsáveis ​​pela colágeno nativo intermolecular de reticulação e de estabilidade fibrilar 15. Em conjunto, estas condições permitem a formação de redes de colagénio que mais se assemelham às observadas in vivo 10. Para permitir a visualização das fibras de colagénio, tanto em culturas fixadas e de estar, um protocolo detalhado para etiquetar é fornecido por fluorescência de colagénio in vitro 10 utilizando 5 - (e-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), éster de succinimidilo. Este protocolo foi adaptado do Baici et ai. 16,17, onde o isotiocianato de fluoresceína é usado para identificar moléculas de colagénio solúveis. A fluoresceína, TAMRA é um corante fluorescente amino-reactivo que reage com grupos amino alifáticos nonprotonated de proteínas, tais como o grupo amino livre no terminal N e, mais importante ainda, o grupo amino de lisinas lado. Esta reacção só ocorre a um pH básico, em que o grupo amino da lisina está na forma nonprotonated. Além TAMRA ser mais estável do que ao longo de fluoresceínatempo, o seu espectro de emissão cai no intervalo de laranja / vermelho (EX / EM = 555/518 nm), o que pode ser utilmente combinadas para imagiologia de células vivas proteínas de GFP. Usando as moléculas de colagénio marcadas com corantes solúveis amino-reactivas não afecta o processo de polimerização nem a densidade, o tamanho de poro e do estado de reticulação da matriz de colagénio 10,16,18,19.

Este protocolo inclui também um método para rotulagem de imunofluorescência 3D de proteínas endógenas, que foi ainda mais optimizado para rotular o citoesqueleto ou proteínas associadas citoesqueleto. O foco final deste protocolo é sobre os métodos de aquisição de imagens de alta resolução das culturas em 3D usando microscopia confocal com reduzida contribuição de lamínulas rígidas sobre a tensão matriz de colágeno.

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Protocol

1. TAMRA-colágeno I Labeling

  1. Prepara-se uma 10 mg / ml solução TAMRA por adição de 2,5 ml de DMSO a 25 mg fornecida TAMRA pó. Dissolve-lo em vórtice até à dissolução completa. Armazenar a -20 º C e proteger da luz.
  2. Prepare-se 2 L de Labeling Buffer (0,25 M de NaHCO3, 0,4 M NaCl). Ajustar o pH para 9,5 utilizando uma solução de NaOH a 10 M. Conservar a 4 º C. A partir deste ponto, todas as operações são realizadas a 4 º C a menos que o material indicado de outra forma e fluorescentes é protegido da luz usando papel alumínio.
  3. Encher uma seringa descartável de 1 ml com 1 ml de rato altamente concentrada colagénio de cauda de I solução. Soluções de colagénio de elevada concentração são tipicamente fornecidos em concentrações de cerca de 10 mg / ml e é muito viscoso. Certifique-se de manipulá-lo lentamente para evitar a formação de bolhas de ar.
  4. Usando uma agulha hipodérmica 21 G, injetar o colágeno em um 3 ml cassete diálise presoaked de 10.000 MWCO cortada. Tenha cuidado para evitar damaterar sua membrana com a agulha. Retire todo o ar do cassete de diálise, puxando para cima o pistão da seringa. Diálise durante a noite contra 1 L de tampão de rotulagem.
  5. Misturar 100 mL de 10 mg / ml solução TAMRA com 900 ul de Tampão de rotulagem. Nota: Isto deve ser feito tanto com solução TAMRA e amortecedor Labeling à temperatura ambiente desde DMSO congela a 4 º C. Após a mistura, trazer a solução diluída TAMRA volta a 4 º C.
  6. Retire cuidadosamente o colágeno da cassete de diálise utilizando a 2 ml com uma seringa descartável G agulha hipodérmica 21. Mistura-se 1 ml da solução de colagénio dialisada com 1 ml de solução diluída por pipetagem TAMRA.
  7. Transferir o colagénio / mistura TAMRA para um tubo de microcentrifugação de 2 ml e incubar durante a noite, com rotação.
  8. Transferir a 2 ml de colagénio marcado com TAMRA em 3 ml de uma cassete pré-embebidos diálise e diálise durante a noite contra 1 litro de tampão de etiquetagem para remover o excesso de corante livre.
  9. Para restaurar o TAMRA-labELED colagénio para a solução inicial de colagénio, colocar a cassete de diálise em 1 L de 0,2% (v / v) de solução de ácido acético, pH 4, e dializar durante a noite.
  10. Medir o volume final do colagénio marcado com TAMRA e calcular a sua concentração final, considerando-se o volume inicial, e a concentração da solução de colagénio utilizada. Armazenar a 4 º C.

2. Matrizes TAMRA-colágeno 3D com embutidos células individuais

  1. Calcular o volume de 2 mg / ml de mistura de colagénio-TAMRA necessário para o experimento. Sempre preparar 20% a mais para dar conta de pipetagem perdas devido à alta viscosidade do colágeno.
  2. Prepare uma solução estoque de 10x PBS e NaOH 1 N. Filtro de esterilizar e manter a 4 º C. A partir deste ponto, todas as operações são realizadas no gelo salvo indicação em contrário e sob condições estéreis.
  3. Misturar 10x PBS e NaOH 1 N em volumes apropriados para obter a concentração desejada de colagénio e pH 7,4. Por exemplo, para um volume final de 1 ml-TAMRA de colagénio mistura a pH 7,4, 100 ul de combinar 10x PBS com 5 ul de NaOH 1N. Misturar bem.
  4. Adicionar os volumes apropriados de colagénio marcado com TAMRA e colagénio não marcado numa proporção de 1:6 até atingir uma concentração de colagénio total final de 2 mg / ml. Por exemplo, para um volume final de 1 ml de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-mistura, adicionar 90,48 ml de 3,68 mg / ml de colagénio marcado com TAMRA e 415,71 uL de 4,01 mg / ml de colagénio não marcado. Misturar bem e, lentamente, por pipetagem, evitando a formação de bolhas de ar.
  5. Adicionar células em suspensão em um volume apropriado de meio de células sem FBS refrigerados à mistura TAMRA-colagénio para obter uma densidade de 10 5 células / ml e uma concentração de 2 mg / ml de colagénio celular final definitivo. Por exemplo, para 1 ml de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-mistura, adiciona 388,81 ul de meio contendo 10 5 células. Misturar bem e, lentamente, por pipetagem, evitando a formação de bolhas de ar. Confirmar pH testando 10 ul da mistura em um teste de pH sviagem.
  6. Pipetar 100 ul de gotas TAMRA-Colágeno Mix para pratos com fundo de vidro e deixe-a polimerização à temperatura ambiente por 30-45 min. 100 ul de colagénio gotas têm um diâmetro típico de 7 mm e são de 2 mm de altura. Quando polimerizada, o colagénio se transforma em um gel esbranquiçado. Nota: Permitir que o colagénio para polimerizar sem fechar o prato irá evitar a formação de uma película de água em torno do colagénio gota, reduzindo destacamento do vidro. Para aumentar a adesão, os pratos de vidro podem ser revestidas com poli-L-lisina a 100 ug / ml.
  7. Adicione cuidadosamente meio de cultura suficiente para cobrir as colágeno / célula gotas. Evite altas fluxos de mídia ou movimentos bruscos desde gotas de colágeno pode facilmente separar. Manter a 37 º C em 10% de CO 2 em ar humidificado tempo suficiente para as células para migrar na matriz (tipicamente 1-3 dias).

3. Matrizes TAMRA-colágeno 3D com Spheroids celulares embarcados

  1. Calcular o volume de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-Mix necessário para o experimento. Sempre preparar 20% a mais para dar conta de pipetagem perdas devido à alta viscosidade do colágeno.
  2. Prepare uma solução estoque de 10x PBS e NaOH 1 N. Filtro de esterilizar e manter a 4 º C. A partir deste ponto, todas as operações são realizadas no gelo salvo indicação em contrário e sob condições estéreis.
  3. Mistura de PBS 10x, com NaOH 1 N e meio de células sem FBS em volumes apropriados para obter a concentração desejada de colagénio e pH 7,4. Por exemplo, para um volume final de 1 ml de mistura de colagénio-TAMRA, a pH 7,4, 100 ul de combinar 10x PBS, 5 ul de NaOH 1 N e 388,81 ul de meios de comunicação. Misturar bem.
  4. Adicionar os volumes apropriados de colagénio marcado com TAMRA e colagénio não marcado numa proporção de 1:6 até atingir uma concentração de colagénio total final de 2 mg / ml. Por exemplo, para um volume final de 1 ml de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-mistura, adicionar 90,48 ml de 3,68 mg / ml de colagénio marcado com TAMRA e 415,71 uL de 4,01 mg / ml de UNLacolágeno Beled. Misturar bem e, lentamente, por pipetagem, evitando a formação de bolhas de ar. Confirmar pH testando 10 ul da mistura sobre uma tira de teste de pH.
  5. Pipetar 100 ul de gotas TAMRA-Colágeno Mix em placas de vidro de fundo e permitir que ele para iniciar a polimerização por 2-5 min. Isso ajudará a impedir o afundamento de esferóides, aumentando ligeiramente a viscosidade do gel. 100 ul de colagénio gotas têm um diâmetro típico de 7 mm e são de 2 mm de altura.
  6. Colete um esferóide celular e colocá-lo em uma placa de Petri limpa. Remover qualquer excesso de líquido e de re-suspender em 10 ul de mistura de colagénio-TAMRA. Isto é importante para evitar a diluição do colagénio, com meio celular.
  7. Com uma pipeta P20, coletar o colágeno suspenso esferóide e colocá-lo na parte superior central da mL queda Mix 100 TAMRA-colágeno. Nota: Não coloque mais de um esferóide por gota de colágeno, uma vez que elas podem afetar uns aos outros a capacidade de invadir e / ou migrar.
  8. Permitir que o Mix TAMRA-Colágeno para polyMérize à temperatura ambiente durante 30-45 min. Quando polimerizada, o colagénio se transforma em um gel esbranquiçado. Nota: Permitir que o colagénio para polimerizar sem fechar o prato irá evitar a formação de uma película de água em torno do colagénio gota, reduzindo destacamento do vidro. Para aumentar a adesão, os pratos de vidro podem ser revestidas com poli-L-lisina a 100 ug / ml.
  9. Adicione cuidadosamente meio de cultura suficiente para cobrir o colágeno / esferóides gotas. Evite altas fluxos de mídia ou movimentos bruscos desde gotas de colágeno pode facilmente separar.
  10. Manter a 37 º C em 10% de CO 2 em ar humidificado tempo suficiente para as células para invadir / migrar na matriz (tipicamente 1-3 dias).

4. Imunofluorescência 3D

  1. Remova cuidadosamente os meios de comunicação celular e lave as matrizes de colágeno contendo células / esferóides com PBS.
  2. Ao mesmo tempo fixar e extrair células por incubação com tampão de extracção / fixação (4% PFA, 0,3% de Triton X-100, 5% de sacarose em PBS) durante 5 min. Complemente o buffer com 2 mM Faloidina e 2 mM Taxol para a visualização de citoesqueleto ou proteínas associadas citoesqueleto.
  3. Além disso fixar as células com PFA a 4%, 5% de sacarose em PBS durante 30 min. Lavar com 0,05% de Tween-20 em PBS.
  4. Preparar as soluções de anticorpos primários em PBS. Incubar as células com anticorpos primários durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 º C. Certifique-se de adicionar solução suficiente para cobrir a queda de colágeno inteiro. Para vidro de 35 mm de fundo do prato, 1.5-2 ml de solução será necessário. Nota: Para reduzir o volume da solução de anticorpo, uma barreira insolúvel na água, tal como uma linha circular de massa de silicone, ou um anel de PDMS, pode ser colocada ao redor da gota de colagénio.
  5. Lavar 3x 30 min, com 0,05% de Tween-20 em PBS.
  6. Preparar anticorpos secundários conjugados com Alexa, soluções DAPI Alexa-faloidina e conjugado em PBS. Incubar as células com os anticorpos secundários apropriados durante 2 horas à temperatura ambiente.
  7. Lave 3x 30 min, com 0,05% de Tween-20 em PBS.
  8. Retire o excesso de líquido, acrescente o suficiente montagem de mídia para preencher o fundo de vidro prato inferior (cerca de 500 mL) e coloque um 24 milímetros lamela por cima para selar. Não pressione a lamela para evitar comprimir a queda de colágeno e prejudicando a organização em 3D.

5. Exemplo de imagem

Microscopia confocal de disco clássico ou fiação pode ser usado. Um sistema invertido, preferencialmente, deve ser usada para determinar a distância entre as células com imagens do fundo de vidro. O sistema utilizado para este trabalho é um disco giratório invertido confocal equipado com um 40X/1.3NA e um 60X/1.4NA objetivos de imersão em óleo (trabalhando distâncias de 200 mM e 130 mM, respectivamente), uma câmera CoolSnap HQ2 Photometrics, 1392 x 1040 matriz de imagem, 6,45 x 6,45 ^ m e pixels controlados por software Metamorph imagiologia. 405 nm, 491 nm, 561 nm e 633 nm lasers são normalmente utilizados em poder de 30-50%, o ganho de 1 e de 2 binningx 2 para reduzir os tempos de exposição. O microscópio também é equipado com uma lâmpada de Hg e cubos de filtro para DAPI (exc 400-418 nm; in 450-465), FITC (exc 478-495; los 510-555) e Texas Red (exc 560-580; los 600 -650) para usar com a parte do olho.

  1. A utilização da lâmpada fluorescente, colocar um objectiva de 40x no meio da gota de colagénio. Como uma visão geral da amostra, tanto no eixo xy e no eixo z. Certifique-se de que não se desvie mais do que 100 um a partir da borda de gel no eixo xy na aquisição das imagens para evitar os efeitos de borda. Quando esferóides imagem, certifique-se que estão sob a distância de trabalho objetiva. Alterar objetivo se for o caso.
  2. Mude para o modo confocal ao vivo de imagens. Ao utilizar o laser de 561 nm para visualizar o colágeno TAMRA marcado, a partir do fundo de vidro determinar o valor de z em que as fibras de colágeno começam a aparecer. Este é o substrato de fundo e de z = 0.
  3. Usando o botão de foco, ir até 100 mm de z = 0. Apenas as células em z = 100 pmou acima deve ser trabalhada para evitar efeitos da tensão a partir do fundo de vidro rígida.
  4. Selecione as células de imagem. Otimizar os tempos de exposição da câmera e do poder do laser para cada comprimento de onda. Tempos de exposição típicas para DAPI e Alexa-488 Faloidina estão entre 100-200 ms. Os tempos de exposição para coloração de anticorpos podem variar.
  5. No modo confocal vivo usando o laser adequado faloidina para visualizar a coloração e com o botão de focagem, definem o intervalo de série z z definindo valores superior e inferior a corrente.
  6. Definir o tamanho do passo z. Para os objetivos 40X, use 1 mícron. Para 60X, usar 0,5 micron. Comece aquisição.

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Representative Results

Rotulagem rato-cauda colágeno I com TAMRA permite uma fácil preparação e visualização de redes de colágeno 3D. Polimerização lenta em temperatura ambiente resulta na formação de redes de colágeno com organização semelhante às encontradas in vivo 10.

Aqui é apresentado um protocolo para a coloração de imunofluorescência citoesqueleto das células cancerosas CT26, tanto como esferóides e, como células individuais. Para melhor preservar o citoesqueleto, buffers são complementados com e sem rótulo phalloidin taxol, drogas conhecidas para estabilizar F-actina e microtúbulos, respectivamente. Além disso, as células são simultaneamente fixadas e extraída para remover nonpolymerized piscinas tubulina citosólicas que poderiam interferir com a visualização dos microtúbulos individuais. Esta técnica pode igualmente ser usada para visualizar as proteínas associadas ao citoesqueleto. Quando em 3D, CT26 células apresentam uma morfologia mesenquimal típica caracterizada por uma alongadacorpo celular, derrubado com F-actina ricos saliências celulares que lembram filopodia e lamellipodia (Figuras 1 e 2). Esta morfologia alongada é ainda mais evidente nas células que tentam escapar esferóides celular invadindo a matriz de colagénio (Fig. 2). A coloração de microtúbulos com um anticorpo anti-tubulina mostra uma rede de microtúbulos bem preservado e organizado (Figuras 1 e 2). Esta forma da célula muito diferente da de um CT26 células em substratos 2D, onde eles geralmente têm vários bordos de ataque com grande amplo lamellipodia plana e bem definida filopodia 10.

Para processar as imagens obtidas deste trabalho, foi utilizado Imaris. Este software converte automaticamente o grande adquirido z-stacks em uma projeção em 3D de fácil navegação e visualização em todos os planos (xy, xz e yz) e ângulos diferentes (figuras 1, 2 e 3, orthogonal vistas). Usando a função "Crop 3D", os aviões z desnecessários acima ou abaixo da região de interesse pode ser removido. Tal como representado na Figura 3, é essencial analisar as pilhas z recolhidos de todos os planos de vista de assegurar uma distribuição uniforme 3D das células. Neste caso, as células cultivadas como CT26 esferóides parecem invadir uma matriz de colagénio 3D extensivamente quando visualizada como uma projecção máxima xy. No entanto, uma vista xz revela que todas as células estão a invadir um intervalo restrito de z em relação ao volume do esferóide, sugerindo uma região preferencial de invasão. Este esferóide é de facto muito perto do fundo do prato de vidro e movido rapidamente para as células e sobre o substrato 2D rígida.

Figura 1
Figura 1. Citoesqueleto das células de câncer de células CT26 embutido TAMRA marcado colágeno I. Colem células de adenocarcinoma de CT26 foram incorporados como células individuais em 2 mg / ml de marcado com TAMRA colagénio I (vermelho). Imagens de imunofluorescência de culturas coradas com um anticorpo tubulin para rotular os microtúbulos (azul), Alexa-488 phalloidin visualizar F-actina (verde) e DAPI para a coloração nuclear (cyan). 3D imagem corresponde a xy projeção máxima de z-stacks de 38 mM. Ortogonais xz (parte inferior da Fusão) e yz (direito de Fusão) fundir pontos de vista. Barra de escala, 20 mM. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2
Figura 2. Citoesqueleto das células CT26 células cancerosas invasoras TAMRA-rotulados de colagénio I. CT26 células cultivadas como esferóides celulares foram embebidos em 2 mg / ml de marcado com TAMRA colagénio I (vermelho). Após 2 dias em cultura, as células começaram emvading a matriz de colágeno 3D, afastando-se do esferóide celular. Imagens de imunofluorescência de culturas coradas com um anticorpo tubulin para rotular os microtúbulos (azul), Alexa-488 phalloidin visualizar F-actina (verde) e DAPI para a coloração nuclear (cyan). 3D imagem corresponde a xy projeção máxima de z-stacks de 66 mM. Ortogonais xz (parte inferior da Fusão) e yz (direito de Fusão) fundir pontos de vista. Barra de escala, 50 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. Invasão de células CT26 em colagénio I é dependente da distância de vidro. CT26 células foram cultivadas como esferóides celulares e embebidos em 2 mg / ml de colagénio I. Após 2 dias em cultura, as células movido significativamente para longe do esferóide célula, e não por invasão tele matriz de colágeno 3D, mas por meio da indexação no vidro rígida 2D. Imagens de fluorescência de culturas marcadas com Alexa-488 phalloidin visualizar F-actina. A) imagem 3D corresponde a xy projeção máxima de z-stacks de 200 mM. B) vista xz Orthogonal. Barra de escala, a 150 mM. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Discussion

O protocolo descrito aqui para rotular fluorescently colágeno I utilizando TAMRA fornece um excelente método para permitir a fácil visualização da organização da rede de colágeno, por meio de um microscópio confocal padrão equipado com um laser de 561 nm. Uma vantagem desta técnica em comparação com microscopia confocal de reflectância é a capacidade de fibras de colagénio da imagem mais profundos na matriz 3D. A intensidade e contraste da reflexão fibras diminui substancialmente com a profundidade devido à absorção e dispersão de luz laser. Além disso, a orientação das fibras de colagénio pode ser uma grande desvantagem quando se utiliza microscopia confocal de reflectância, uma vez que as fibras alinhadas em torno de 50 ° a partir do plano de imagem são inteiramente sem ser detectado. Fibras marcadas com fluorescência são detectadas com um brilho semelhante, independentemente da sua orientação 20. Outro método que tem sido cada vez mais usado para visualizar feixes de colagénio, tanto in vitro como in vivo, é de segunda harmónica genção (SHG). Este processo baseia-se no sinal de emissão de SHG noncentrosymmetric por estruturas, tais como o colagénio 21. No entanto, necessita de um microscópio de SHG multifóton, que não faz parte do equipamento de imagiologia de laboratório padrão.

O uso de TAMRA como um fluoróforo não é exclusiva. Outros, tais como fluoróforos Cy2, Cy5 ou a família Alexa Fluor, disponível comercialmente em kits de marcação de proteínas, podem ser usados ​​para colagénio rótulo na cor mais conveniente para o utilizador. Outra vantagem da utilização de colagénio fluorescente é o potencial para ser combinado com as células transfectadas com as proteínas marcadas com fluorescência para o lapso de tempo de imagem, para acompanhar de perto as interacções célula-matriz e célula-matriz deformações induzidas. Ele também pode ser usado para revestimento de colagénio finas lamelas em experiências 2D.

A incorporação de células em matrizes 3D é um procedimento delicado, especialmente quando se utiliza grandes esferóides, uma vez que eles têm uma tendência a afundar-se, devido à gravidade. Além disso,As células são normalmente atraídos para ambientes mais duras e quando incorporado em regiões da matriz 3D suficientemente perto da lamela de vidro para sentir o aumento da tensão induzida por vidro, que se movem em direcção ao substrato 2D rígida. Um truque técnica para ajudar a prevenir afundamento de grandes esferóides é para permitir que o colagénio para polimerizar brevemente (2-5 minutos), antes de colocar o esferóide em cima da gota da matriz. Isto irá aumentar ligeiramente a viscosidade do gel, aumentando o tempo de afundamento. No entanto, é uma boa prática para preparar várias repetições, para aumentar a probabilidade de sucesso. Por outro lado, é importante manter as células sob a distância de trabalho objectivo. Objectivos menor ampliação têm geralmente maiores distâncias de trabalho e pode ser utilizado para produzir imagens de campo, por exemplo, para comparar a invasão de diferentes tipos de células a partir de um esferóide. Quando as imagens de alta resolução são necessários, água objetivas de imersão, com maiores distâncias de trabalho, são muito recomendados.

10. Nós não tentar criar um protocolo geral immunostaining 3D. Como em 2D, cada anticorpo pode exigir um procedimento de fixação diferente e desenho de um protocolo específico para cada um dos anticorpos pode ser requeremd. Este protocolo apresenta-se como ponto de partida, e sugere-se que os utilizadores incluem um faloidina fluorescente coloração para proporcionar uma ideia da forma da célula e localização no interior da matriz.

Matrizes de colágeno grossos são uma boa simplificado sistema in vitro para estudar a migração de células em um ECM fisiológica. Embora não tendo a complexidade física e química de um tecido vivo, este sistema permite a manipulação das propriedades específicas de ECM, tais como tamanho do poro, a elasticidade e reticulação. Esperamos que estes protocolos vão contribuir para uma melhor descrição da composição molecular, a localização e as funções das estruturas celulares por muitos anos analisados ​​em 2D e para melhorar nosso conhecimento sobre o comportamento das células em 3D.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores agradecem o Dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) para aquisição e processamento de imagem na Figura 3 e PICT-IBISA imagem Facility (Instituto Curie). Este trabalho foi financiado pela ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 e PIC 3D - Complexo em modelos celulares in vitro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
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References

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Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D
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Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

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