Avslöjar cytoskeletal organisationen av invasiva cancerceller i 3D

Summary

I denna artikel presenteras en metod för att fluorescerande märka kollagen som ytterligare kan användas för både fix och levande avbildning av 3D cellkulturer. Vi erbjuder också ett optimerat protokoll för att visualisera endogena cytoskelettproteiner av celler odlade i 3D-miljöer.

Abstract

Cellmigration har traditionellt studerats i 2D substrat. Däremot har det blivit alltmer uppenbart att det finns ett behov av att studera cell migration i mer lämpliga 3D-miljöer, vilket bättre liknar dimensionerna av de fysiologiska processerna i fråga. Vandrande celler kan skilja sig kraftigt i deras morfologi och läge av migration beroende på om de rör sig på 2D-eller 3D-substrat. På grund av tekniska problem och oförenligheter med de flesta standardprotokoll, strukturell och funktionell analys av celler inbäddade i 3D matriser fortfarande ovanligt. Den här artikeln beskriver metoder för framställning och avbildning av 3D kulturer cancercell, antingen som enskilda celler eller sfäroider. Som en lämplig ECM substrat för cancer cell migration, använder vi nonpepsinized kollagen råttsvans jag polymeriseras vid rumstemperatur och fluorescerande för att underlätta visualisering med vanliga konfokala mikroskop. I detta arbete ingår också ett protokollol för 3D immunofluorescens märkning av endogen cell cytoskeleton. Med hjälp av dessa protokoll vi hoppas kunna bidra till en bättre beskrivning av den molekylära sammansättningen, lokalisering, och funktioner av cellstrukturer i 3D.

Introduction

Området cellflyttning har trotsat in i helt nya tredje dimensionell värld. Det är intuitivt att studera cell migration i en miljö som mest liknar den fysiologiska en och, därför, tredimensionella (3D). På grund av tekniska begränsningar, har mest cellmigrationen studier gjorts analysera cell rörlighet över stela tvådimensionell (2D) substrat, antingen obehandlad eller överdragen med lämpliga extracellulära matrix (ECM) proteiner.

De första studierna tillägnad cell migration i tredimensionella kollagen gitter gå tillbaka över 20 år ^1-3. Men bara under de senaste fem åren har det blivit tydligt att migrerande celler avsevärt kan skilja sig i deras morfologi och läge av migration beroende på dimensionerna av substratet. I 2D, celler kontaktar endast substratet med sin ventrala ytan med fokala kontakter, vilket resulterar i bildandet av breda platta utsprång (lamellipodia) medinbyggda finger-liknande utsprång (filopodia) vid deras framkant. Dessa strukturer, tillsammans med stressen fibrer som ansluter cellens främre till den bakre kanten, tros vara avgörande för cellens rörelse i 2D. I 3D-matriser, celler i allmänhet är mer långsträckt, med hela cellytan i kontakt med ECM, vilket orsakar stora förändringar i bildningen och funktionella betydelsen av många av dessa strukturer. Omvänt, andra cellulära funktioner får relevans i 3D migration, såsom kärnkraft deformation och strukturer involverade i ECM ombyggnad ^4.

Trots dessa kända morfologiska förändringar, samt skillnader i migration lägen ^5-7, vilket kan variera beroende på ECM och celltyper, strukturell och funktionell analys av celler inbäddade i 3D matriser fortfarande ovanligt. Arbeta med tjock och tät 3D matriser bär tekniska svårigheter, t.ex. högupplösande mikroskopi avbildning, och oförenligheter med de flesta standard protokoll optimerat för 2D kulturer, liksom immunofluorescens märkning av endogena proteiner. Också, eftersom användningen av 3D-matriser är en relativt ny metod, är forskare undersöker fortfarande de bästa förutsättningarna för att likna specifik in vivo situationer, såsom den normala stromal arkitekturen olika vävnadstyper organ eller ECM organisationen kring en tumör. Avvikelser i resultaten från olika grupper som gäller exempelvis, har cancercellen former av migration eller förekomst av fokala sammanväxningar, genererat några kontroverser ^8. En stor insats har nyligen tillägnad att nå samförstånd i form av ECM kemiska natur, porstorlek, fibertjocklek och matris stelhet. Många olika typer av 3D ECM närvarande används, varierar från cellhärlett matriser till kommersiellt tillgängliga matrigel, pepsinized bovint kollagen I, eller nonpepsinized råttsvanskollagen I. Alla dessa matriser har specifika fysiska och kemiska egenskaper och man måste relate matrisen av valet till fysiologisk process som studeras. Dessutom kan porstorlek och fibertjocklek beror på polymerisationsbetingelserna, såsom pH och temperatur ^9,10. Bindningen till och avstånd från styva substrat såsom glas, kan också ändra de elastiska egenskaperna hos matrisen ^10,11.

Den här artikeln beskriver metoder för framställning och avbildning av 3D kulturer cancercell, antingen som enskilda celler eller sfäroider. Metoder för att göra spheroids cancercell har tidigare beskrivits, de mest populära är den droppe metoden ^12,13 och agaros-belagda platta ^14. Som en lämplig ECM substrat för cancer cell migration, är nonpepsinized råttsvanskollagen jag polymeriseras vid rumstemperatur användes vid 2 mg / ml. Nonpepsinized syraextraherade kollagen I från råttsvans behåller både N-och C-terminala telopeptider, nonhelical delar av kollagenmolekylen ansvariga för nativt kollagen intermolecular tvärbindning och fibrilar stabilitet ^15. Tillsammans utgör dessa villkor tillåta bildandet av kollagen nätverk som mest liknar de som observerats in vivo ^10. För att möjliggöra visualisering av kollagenfibrer, både i fasta och levande kulturer, är ett detaljerat protokoll tillhandahålls fluorescerande märka kollagen in vitro ¹⁰ med 5 - (och-6)-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimidylester. Detta protokoll har anpassats från Baici et al. ^16,17, där fluoresceinisotiocyanat används för att märka lösligt kollagen molekyler. Eftersom fluorescein, är TAMRA en amino-reaktiv fluorescerande färg som reagerar med icke-protonerat alifatiska aminogrupperna hos proteiner, såsom den fria aminogruppen vid N-terminalen och, ännu viktigare, den sida aminogruppen hos lysiner. Denna reaktion sker endast vid basiskt pH, då lysin aminogrupp är i icke-protonerat formen. Förutom TAMRA vara stabilare än fluorescein övertid, faller dess emissionsspektra på den orange / röda området (ex / em = 555/518 nm), vilket kan med fördel kombineras för levande cell imaging av GFP-märkta proteiner. Använda lösliga kollagen märkta molekyler med amino-reaktiva färgämnen påverkar inte polymerisationsprocessen eller densitet, porstorlek och tvärbindning status kollagenmatrisen ^10,16,18,19.

Detta protokoll omfattar även en metod för 3D immunofluorescens märkning av endogena proteiner, vilket har ytterligare optimerats för att märka cytoskeletonen eller cytoskeleton associerade proteiner. Den sista inriktningen av detta protokoll på metoder att förvärva högupplösta bilder av 3D kulturerna med konfokalmikroskopi med reducerat bidrag från stela täckglas på kollagenmatrisen spänning.

Protocol

Ett. TAMRA-kollagen I Märkning

1. Förbered en 10 mg / ml TAMRA lösning genom att tillsätta 2,5 ml DMSO till den medföljande 25 mg TAMRA pulver. Lös det genom skakning tills fullständig upplösning. Förvara vid -20 º C och skyddas från ljus.
2. Förbered 2 L Märkning buffert (0,25 M NaHCO _3, 0,4 M NaCl). Justera pH till 9,5 under användning av 10 M lösning av NaOH. Håll vid 4 ° C. Från denna punkt, är alla operationer utförs vid 4 º C om inte annat anges och fluorescerande material är skyddat från ljus med aluminiumfolie.
3. Fyll en 1 ml engångsspruta med en ml av högkoncentrerade råttsvanskollagen I-lösning. Hög koncentration kollagenlösningar tillhandahålles typiskt vid koncentrationer omkring 10 mg / ml och är mycket viskös. Var noga med att manipulera det långsamt för att undvika bildandet av luftbubblor.
4. Med hjälp av en 21 G injektionsnål, injicera kollagen i en förindränkta 3 ml dialys kassett av 10.000 MWCO avskurna. Iaktta försiktighet för att undvika damaging membranet med nålen. Ta bort all luft ur dialys kassetten genom att dra upp sprutan kolven. Dialysera det natten mot 1 liter Märkning buffert.
5. Blanda 100 ^ 10 mg / ml TAMRA lösning med 900 pl Märkning buffert. OBS: Detta bör göras med både TAMRA lösning och märkning buffert vid rumstemperatur sedan DMSO fryser vid 4 º C. Efter blandning, föra den utspädda TAMRA lösningen tillbaka till 4 º C.
6. Ta försiktigt bort kollagen från dialys kassett med en 2 ml engångsspruta med en 21 G injektionsnål. Blanda 1 ml av den dialyserade kollagenlösningen med 1 ml utspädd TAMRA lösning genom pipettering.
7. Överför kollagen / TAMRA blanda i en 2 ml mikrocentrifugrör och inkubera över natten med rotation.
8. Överför 2 ml av TAMRA-märkt kollagen i en förindränkta 3 ml dialys kassett och dialysera natten mot 1 liter Märkning buffert för att avlägsna överskott av fritt färgämne.
9. För att återställa TAMRA-labeled kollagen till kollagenet ursprungliga lösningen, placera dialys kassetten i 1 L av 0,2% (v / v) ättiksyra, pH 4, och dialysera över natten.
10. Mät den slutliga volymen av TAMRA-märkt kollagen och beräkna dess slutkoncentration, med tanke på den ursprungliga volymen och koncentrationen av den använda kollagenlösningen. Förvaras vid 4 º C.

2. 3D TAMRA-kollagenmatriser med inbäddade enskilda celler

1. Beräkna volymen av 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix nödvändig för experimentet. Alltid förbereda 20% mer av pipetteringsförlust förluster på grund av kollagen hög viskositet.
2. Bered en förrådslösning av 10x PBS och 1 N NaOH. Filter-sterilisera och underhålla vid 4 º C. Från denna punkt, är alla operationer som utförs på is om inte annat anges och under sterila förhållanden.
3. Blanda 10x PBS och 1 N NaOH i lämpliga volymer för att uppnå den önskade kollagen koncentration och pH 7,4. Till exempel för en slutlig volym av 1 mlav TAMRA-Collagen Mix vid pH 7,4, kombinera 100 pl 10x PBS med 5 pl 1 N NaOH. Blanda väl.
4. Lägg lämpliga volymer av både TAMRA-märkt kollagen och omärkt kollagen på ett 01:06-förhållande för att uppnå en slutlig total kollagenkoncentration av 2 mg / ml. Till exempel för en slutlig volym av 1 ml av 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix, tillsätt 90,48 pl av 3,68 mg / ml TAMRA-märkt kollagen och 415,71 il av 4,01 mg / ml omärkt kollagen. Blanda väl och långsamt genom pipettering, undvika bildandet av luftbubblor.
5. Lägg celler suspenderade i lämplig volym av kylda cell medium utan FBS till TAMRA-Collagen Mix för att erhålla en slutlig celltäthet av 10 ⁵ celler / ml och en slutlig kollagen koncentration av 2 mg / ml. Till exempel för en ml 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix, tillsätt 388,81 | il medium innehållande 10 ⁵ celler. Blanda väl och långsamt genom pipettering, undvika bildandet av luftbubblor. Bekräfta pH genom att testa 10 il av blandningen på ett pH-test sresa.
6. Pipettera 100 l droppar av TAMRA-Kollagen Mix på rätter glas botten och låt den polymeriserar vid rumstemperatur i 30-45 min. 100 | il kollagen droppar har en typisk diameter på 7 mm och är 2 mm höga. När polymeriserad, vänder kollagen till en vit-ish gel. Notera: Att låta kollagen polymerisera utan att stänga skålen kommer att undvika bildandet av en vattenfilm runt kollagen droppe, minska lossnar från glaset. För att öka vidhäftningen kan glas rätter beläggas med poly-L-lysin vid 100 | ig / ml.
7. Tillsätt försiktigt tillräcklig odlingsmedium för att täcka de kollagen / cell droppar. Undvik höga flöden av media eller häftiga rörelser eftersom kollagen droppar kan lätt lossna. Förvara vid 37 º C i 10% _CO2 fuktad luft för tillräckligt med tid för celler att migrera i matrisen (vanligtvis 1-3 dagar).

Tre. 3D TAMRA-kollagenmatriser med Embedded Cell Sfäroider

1. Beräkna volymen av 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix nödvändigt för experimentet. Alltid förbereda 20% mer av pipetteringsförlust förluster på grund av kollagen hög viskositet.
2. Bered en förrådslösning av 10x PBS och 1 N NaOH. Filter-sterilisera och underhålla vid 4 º C. Från denna punkt, är alla operationer som utförs på is om inte annat anges och under sterila förhållanden.
3. Blanda 10x PBS, till 1 N NaOH och media cell utan FBS i lämpliga volymer uppnå önskad kollagen koncentration och pH 7,4. Till exempel för en slutlig volym av 1 ml av TAMRA-Kollagen Mix vid pH 7,4, kombinera 100 ^ il 10 x PBS, 5 | il av 1 N NaOH och 388,81 | il medium. Blanda väl.
4. Lägg lämpliga volymer av både TAMRA-märkt kollagen och omärkt kollagen på ett 01:06-förhållande för att uppnå en slutlig total kollagenkoncentration av 2 mg / ml. Till exempel för en slutlig volym av 1 ml av 2 mg / ml TAMRA-Kollagen Mix, tillsätt 90,48 pl av 3,68 mg / ml TAMRA-märkt kollagen och 415,71 il av 4,01 mg / ml unlaBeled kollagen. Blanda väl och långsamt genom pipettering, undvika bildandet av luftbubblor. Bekräfta pH genom att testa 10 il av blandningen på ett pH-teststickor.
5. Pipettera 100 l droppar av TAMRA-Kollagen Mix på rätter glas botten och låt den initiera polymerisation under 2-5 min. Detta kommer att bidra till att förhindra förlisningen av spheroids genom att något öka gel viskositet. 100 | il kollagen droppar har en typisk diameter på 7 mm och är 2 mm höga.
6. Samla en cell sfäroid och placera den på en ren petriskål. Ta bort eventuellt överskott av vätska och slamma den i 10 ^ TAMRA-Collagen Mix. Detta är viktigt för att förhindra utspädning av kollagenet med cellmedier.
7. Med hjälp av en P20 pipett samla kollagenet suspenderades sfäroiden och placera den i mitten högst upp på 100 ^ TAMRA-Collagen Mix droppe. Obs: Placera inte mer än en sfäroid per kollagen droppe, eftersom de kan påverka varandra förmåga att invadera och / eller migrera.
8. Låt TAMRA-Collagen Mix till polymerize vid rumstemperatur under 30-45 min. När polymeriserad, vänder kollagen till en vit-ish gel. Notera: Att låta kollagen polymerisera utan att stänga skålen kommer att undvika bildandet av en vattenfilm runt kollagen droppe, minska lossnar från glaset. För att öka vidhäftningen kan glas rätter beläggas med poly-L-lysin vid 100 | ig / ml.
9. Tillsätt försiktigt tillräckligt odlingsmedium för att täcka kollagen / sfäroider droppar. Undvik höga flöden av media eller häftiga rörelser eftersom kollagen droppar kan lätt lossna.
10. Förvara vid 37 º C i 10% _CO2 fuktad luft för tillräckligt med tid för celler att invadera / migrera i matrisen (vanligtvis 1-3 dagar).

4. 3D immunofluorescensfärgning

1. Ta försiktigt bort cellmediet och skölj kollagenmatriser innehåller celler / sfäroider med PBS.
2. Samtidigt fixa och extrahera celler genom inkubering med extraktion / fixering buffert (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% sackaros i PBS) i 5 min. Komplettera bufferten med 2 iM Phalloidin och 2 iM Taxol för visualisering av cytoskelettet eller cytoskeleton associerade proteiner.
3. Ytterligare fixera cellerna med 4% PFA, 5% sackaros i PBS under 30 min. Skölj med 0,05% Tween-20 i PBS.
4. Förbered primära antikroppar lösningar i PBS. Inkubera cellerna med primära antikroppar under minst 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Se till att lägga tillräckligt med lösning för att täcka hela kollagen droppe. För ett 35 mm glas nedre skålen, kommer 1,5-2 ml lösning vara nödvändig. Obs: För att minska volymen av antikropp lösning, kan en vattenlöslig barriär, t.ex. en ringlinje silikonfett eller en PDMS ring, placeras runt kollagen droppe.
5. Tvätta 3x 30 min med 0,05% Tween-20 i PBS.
6. Förbered Alexa-konjugerade sekundära antikroppar, Alexa-konjugerad falloidin och DAPI lösningar i PBS. Inkubera cellerna med de lämpliga sekundära antikroppar för 2 h vid rumstemperatur.
7. Tvätta 3x 30 min med 0,05% Tween-20 i PBS.
8. Avlägsna överskott av vätska, tillsätt tillräckligt montering media för att fylla glaset botten nedre skålen (ca. 500 l) och placera en 24 mm täckglas ovanpå för att täta. Tryck inte ner täckglaset för att undvika att komprimera kollagen droppe och skadar 3D organisationen.

Fem. Prov Imaging

Classic eller spinning disk konfokala mikroskop kan användas. En inverterad systemet skall företrädesvis användas för att bestämma avståndet av de avbildade cellerna från glaset botten. Det system som används för detta arbete är en inverterad Confocal Spinning Disk utrustad med en 40X/1.3NA och en 60X/1.4NA oljeimmersionsobjektiv mål (arbetsavstånd 200 | im och 130 pm, respektive), en Photometrics CoolSNAP HQ2 kamera, 1392 x 1040 avbildningsmatris, 6,45 x 6,45 um pixlar och styrs av metamorfa bildbehandlingsprogram. 405 nm, 491 nm, 561 nm och 633 nm lasrar används vanligtvis vid 30-50% effekt, få 1 och binning av 2x 2 för att minska exponeringstider. Mikroskopet är också utrustad med en Hg-lampa och filter kuber för DAPI (EXC 400-418 nm, em 450-465), FITC (exc 478-495; em 510-555) och Texas Red (exc 560-580; em 600 -650) för användning med okularet.

1. Med hjälp av lysrör, placera 40X objektiv vid mitten av kollagen droppe. Få en överblick av provet, både i xy-axeln och i z-axeln. Se till att inte avvika mer än 100 pm från gelén kanten på xy-axeln vid förvärv av bilderna för att undvika kanteffekter. När imaging sfäroider, se till att de är under målet arbetar avståndet. Byt objektiv vid behov.
2. Växla till konfokala Bildproduktion läget. Genom att använda 561 nm laser för att visualisera TAMRA-märkt kollagen, med början från glaset botten bestämma z-värde vid vilket kollagenfibrer börjar dyka upp. Detta är substratet botten och z = 0.
3. Använda fokus ratten, gå upp 100 pm från z = 0. Endast celler vid z = 100 ^ meller högre ska avbildas för att undvika spänningar effekter från stela glasbotten.
4. Markera de celler som bild. Optimera gånger kamerans exponering och laser makt för varje våglängd. Typiska exponeringstider för DAPI och Alexa-488 Phalloidin är mellan 100-200 ms. Exponeringstider för antikroppsfärgning kan variera.
5. På konfokala liveläget med lämplig laser för att visualisera phalloidin färgning och med fokus ratten, definierar Z-serien intervallet genom att sätta övre och undre z-värdena för ström.
6. Definiera z-stegstorleken. För 40X mål, använd 1 mikrometer. För 60X, använd 0,5 um. Starta förvärvet.

Representative Results

Märkning råtta-tail kollagen jag med TAMRA möjliggör en enkel beredning och visualisering av 3D kollagen nätverk. Långsam polymerisation vid resulterar rumstemperaturen i bildandet av kollagen nätverk med jämförbar organisation till de som finns in vivo ^10.

Här presenterar vi ett protokoll för immunofluorescensfärgning av cytoskelettet av CT26 cancerceller, både som sfäroider och som enskilda celler. För att bättre bevara cytoskeletonen är buffertar kompletteras med omärkt phalloidin och taxol, läkemedel som är kända för att stabilisera F-aktin och mikrotubuli, respektive. Dessutom är celler samtidigt fixeras och extraheras för att avlägsna nonpolymerized cytosoliska tubulin pooler som skulle kunna störa visualisering av individuella mikrotubuli. Denna teknik kan likaledes användas för att visualisera cytoskelett-associerade proteiner. När du är i 3D, CT26 celler presenterar en typisk mesenkymal morfologi kännetecknas av en långsträcktcellkroppen, tippas med F-aktin rika cellulära utsprång som liknar filopodia och lamellipodia (figurerna 1 och 2). Denna långsträckta morfologi är ännu tydligare i celler försöker fly cellulära sfaroider genom att invadera kollagenmatrisen (Figur 2). Färgning av mikrotubuli användning av en anti-tubulin-antikropp visar en välbevarad och organiserade mikrotubulära nätverket (figurerna 1 och 2). Denna cell formen skiljer sig mycket från den ena av CT26 celler i 2D substrat, där de brukar ha flera framkanter med stora breda platta lamellipodia och väldefinierade filopodia ^10.

För att bearbeta de förvärvade bilderna i detta arbete, var Imaris användes. Detta program konverterar automatiskt förvärvade stora z-stackar till en 3D-projektion av enkel navigering och visualisering i alla plan (xy, xz och yz) och olika vinklar (figur 1, 2 och 3, orthogonal vyer). Använda "Crop 3D"-funktion, kan onödiga z plan ovanför eller nedanför området för intresserade tas bort. Som visas i figur 3, är det viktigt att analysera insamlade z staplar från alla plan i syfte att säkerställa en enhetlig 3D fördelning av cellerna. I detta fall, CT26-celler odlas som sfäroider tycks invadera en 3D kollagenmatris utsträckning när visualiseras som en maximal xy projektion. Avslöjar emellertid en xz uppfattning att alla celler invaderar en begränsad z-intervall jämfört med spheroid volymen, vilket tyder på en förmånlig region invasion. Denna sfäroid är i själva verket alltför nära glaset botten av skålen och cellerna förflyttas snabbt mot och på den styva 2D underlaget.

Figur 1. Cytoskeleton av CT26 cancerceller celler inbäddade i TAMRA-märkt kollagen I. Colpå adenokarcinom CT26-celler var inbäddade som enskilda celler i 2 mg / ml TAMRA-märkt kollagen I (röd). Immunfluorescensstudier bilder av kulturer färgade med en tubulin antikropp för att märka mikrotubuli (blå), Alexa-488 phalloidin att visualisera F-aktin (grön) och DAPI för nukleär färgning (cyan). 3D-bilden motsvarar xy maximal projektion av z-stackar av 38 um. Ortogonal xz (botten av Merge) och yz (rätt Merge) sammanfoga visningar. Skala bar, 20 um. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Cytoskeleton av CT26-celler cancerceller invaderar TAMRA-märkta kollagen I. CT26 celler odlade som cellulära sfäroider bäddades in i 2 mg / ml TAMRA-märkt kollagen I (röd). Efter två dagar i kultur, började celler ivading kollagen 3D matrix, rör sig bort från cellen sfäroiden. Immunfluorescensstudier bilder av kulturer färgade med en tubulin antikropp för att märka mikrotubuli (blå), Alexa-488 phalloidin att visualisera F-aktin (grön) och DAPI för nukleär färgning (cyan). 3D-bilden motsvarar xy maximal projektion av z-stackar av 66 um. Ortogonal xz (botten av Merge) och yz (rätt Merge) sammanfoga visningar. Skala bar, 50 um. Klicka här för att se större bild .

Figur 3. CT26-celler invasion i kollagen I är beroende på glaset avståndet. CT26-celler odlades som cellulära sfäroider och inbäddade i 2 mg / ml kollagen I. Efter två dagar i kultur, flyttade celler avsevärt bort från cellen sfäroid, inte genom att invadera tHan 3D kollagenmatris men genom att krypa på 2D styva glaset. Fluorescens bilder av kulturer färgas med Alexa-488 phalloidin att visualisera F-aktin. A) 3D-bild motsvarar xy maximal projektion av z-stackar av 200 um. B) Ortogonal xz view. Skala bar, 150 pm. Klicka här för att se större bild .

Discussion

Protokollet som beskrivs här för att fluorescerande märka kollagen I med användning av TAMRA ger en utmärkt metod för att tillåta enkel visualisering av kollagenet nätverksorganisation, genom användning av en standard konfokalt mikroskop utrustat med en 561 nm laser. En fördel med denna teknik jämför med reflektans konfokalmikroskopi är förmågan att fibrerna image kollagen djupare in i 3D-matrisen. Intensiteten och kontrast fibrer reflektion minskar kraftigt med djupet på grund av laserljus absorption och spridning. Dessutom, kan orienteringen av kollagenfibrer vara ett stort handikapp när man använder reflektans konfokalmikroskopi är eftersom fibrerna inriktade omkring 50 º från bildplanet helt oupptäckt. Fluorescensmärkta fibrer detekteras med liknande ljushet, oberoende av deras riktning ^20. En annan metod som har blivit allt vanligare att visualisera kollagen buntar, både in vitro och in vivo, är med andra harmoniska genbete (SHG). Denna process är baserad på utsläpp av SHG signal genom centrosymmetrisk strukturer, såsom kollagen ^21. Dock kräver SHG en multiphoton mikroskop, vilket inte är en del av standarden lab bildutrustning.

Användningen av TAMRA som en fluorofor är inte uteslutande. Andra fluoroforer såsom Cy2, Cy5 eller Alexa Fluor familjen, kommersiellt tillgängliga i kit proteinmärkning, kan användas för att märka kollagen på lämpligaste färgen för användaren. En annan fördel med att använda fluorescerande kollagen är möjligheten att kombineras med celler transfekterade med fluorescerande-märkta proteiner för time-lapse avbildning, att noga följa cell-matrix interaktioner eller cell-inducerade deformationer matris. Det kan också användas för tunna täckglas kollagen beläggning i 2D experiment.

Embedding celler i 3D-matriser är en känslig procedur, speciellt vid användning av stora sfäroider, eftersom de har en tendens att sjunka på grund av tyngdkraften. Också,celler brukar lockas till styvare miljöer och när inbäddade i regioner av 3D-matrisen tillräckligt nära glaset täckglas att känna ökad spänning induceras genom glaset, rör de sig mot den stela 2D underlaget. En teknisk knep för att förhindra Erikas stora spheroids är att låta kollagen kortfattat polymeriserar (2-5 min) innan du placerar sfäroiden ovanpå matrisen droppe. Detta kommer lätt öka viskositeten hos gelén, vilket ökar den sjunkande tid. Ändå är det bra att förbereda flera replikerar att öka sannolikheten för framgång. Å andra sidan är det viktigt att hålla cellerna enligt det mål som arbetsavståndet. Lägre förstoringsgrad har oftast större arbetsavstånd och kan användas för övergripande fältbilder, till exempel, att jämföra invasion av olika celltyper från en sfäroid. När högupplösta bilder krävs, nedsänkning i vatten mål, med större arbetsavstånd, är starkt rekommenderas.

10. Vi försöker inte skapa en generell protokoll 3D immunfärgning. Som i 2D, kan varje antikropp kräva en annan fixering förfarande och utformning av ett specifikt protokoll för varje antikropp kan krävad.. Detta protokoll presenteras som utgångspunkt, och det föreslås att användarna har ett fluorescerande phalloidin färgning för att ge en uppfattning om cellens form och lokalisering inom matrisen.

Tjocka kollagenmatriser är en bra förenklat in vitro-system för att studera cell migration i en fysiologisk ECM. Trots det saknar de kemiska och fysikaliska komplexiteten i en levande vävnad, systemet låter manipulation av specifika ECM-egenskaper, som porstorlek, elasticitet och tvärbindning. Vi hoppas att dessa protokoll kommer att bidra till en bättre beskrivning av den molekylära sammansättningen, lokalisering och funktioner av cellulära strukturer i många år analyseras i 2D och att förbättra vår kunskap om cellens beteende i 3D.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane