Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

Abstract

Hücre göçü geleneksel 2 boyutlu yüzeyler çalışılmıştır. Bununla birlikte, daha iyi bir soru olarak fizyolojik süreçlerin boyutluluk benzer daha uygun 3D ortamlar, hücre göçü incelemek için bir ihtiyaç olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Göçmen hücreleri ölçüde onlar 2D veya 3D yüzeylerde hareket ediyor olmasına bağlı olarak kendi morfolojisi ve göç modunda farklı olabilir. En standart protokoller, 3D matris içinde gömülü hücrelerin yapısal ve fonksiyonel analiz ile teknik zorluklar ve uyumsuzluklar nedeniyle hala yaygın olmaya devam etmektedir. Bu makalede, tek bir hücre ya da sferoidlerinde hazırlanması ve 3D-kanser hücresi kültürlerinin görüntüleme yöntemleri açıklanır. Kanser hücresi göç için uygun bir ECM substrat olarak, I oda sıcaklığında polimerize ve floresan standart konfokal mikroskop kullanarak vizüalizasyon etiketli nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni kullanın. Bu çalışma aynı zamanda bir protoc içerirendojen hücre hücre iskeletinin 3D immunofluorescent etiketleme için ol. Biz moleküler kompozisyon, lokalizasyonu ve 3D hücresel yapıların fonksiyonları daha iyi bir açıklama katkıda bulunmayı umuyoruz bu protokolleri kullanarak.

Introduction

Hücre göçü alanında yepyeni üçüncü boyut dünyasına braving edilmiştir. Bu en yakından andıran bir fizyolojik ve (3 boyutlu) bu nedenle, üç boyutlu bir ortamda hücre göçü çalışma sezgiseldir. Ancak, teknik sınırlamalar nedeniyle, çoğu cep göç çalışmaları işlenmemiş veya uygun hücre dışı matriks (ECM) proteinleri ile kaplanmış ya, sert iki boyutlu (2D) yüzeyler boyunca hücre hareketi analiz yapılmıştır.

Üç boyutlu kollajen kafesler içinde hücre göçü adanmış ilk çalışmalar 20 yıl 1-3 geçirin. Ancak, son 5 yılda bu göçmen hücreler önemli ölçüde kendi morfolojisi ve yüzey boyutluluk bağlı olarak göç modunda farklı olabilir netlik kazandı. 2D, hücreler yalnızca geniş düz çıkıntılar oluşumu (lamellipodia) ile sonuçlanan, fokal yapışıklıklar kullanarak ventral yüzeyi ile yüzeye temasonların öncü gömülü parmak şeklinde çıkıntılar (filopodia). Bu yapılar, bir araya firar kenarı için hücre ön bağlantı stres lifleri ile, 2 hücre hareketi için önemli olduğuna inanılmaktadır. 3D matrisleri olarak, hücre formasyonu ve bu yapıların birçok fonksiyonel önemi önemli değişikliklere yol açan, ECM ile temas eden tüm hücre yüzeyi ile birlikte, genel olarak daha uzun vardır. Tersine, diğer hücresel özellikleri, ECM yeniden 4 dahil nükleer deformasyon ve yapıları gibi 3D göç alaka, kazanmak.

Bu bilinen morfolojik değişiklikler, hem de ECM ve hücre tipleri, 3 boyutlu matris içinde gömülü hücrelerinin yapısal ve fonksiyonel analizi bağlı olarak değişebilir 5-7 geçiş modları farklılıklara rağmen yine de alışılmadık kalır. Kalın ve yoğun 3D matrisler çalışma teknik, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntüleme gibi zorluklar, ve en sta uyumsuzluğa taşırndard protokolleri endojen proteinlerin immunofluorescent etiketleme gibi, 2D kültürler için optimize edilmiş. 3D matris kullanımı nispeten yeni bir yaklaşımdır çünkü Ayrıca, araştırmacılar hala yakından farklı doku organların normal stromal mimarisi veya tümör etrafında ECM örgütü olarak in vivo durumlarda, belirli benzemeye en iyi koşulları araştırıyor. Ilgili farklı gruplar tarafından sonuçlarında farklılıklar, örneğin, kanser hücresi göç modları veya fokal yapışıklıklar varlığı, bazı tartışmalara 8 yarattı. Çaba Bir çok yakın zamanda ECM kimyasal yapısı, gözenek boyutu, lif kalınlığı, ve matris sertlik açısından bir uzlaşma ithaf edilmiştir. 3D ECMlerin birçok farklı türde anda hücre türetilmiş matrislerden ticari olarak temin Matrigel pepsinized sığır kollagen I ya da nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni I. Bu matrislerden her biri belirli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir ve gerçek bir ihtiyaç değişen, kullanılante fizyolojik sürecine tercih matris çalışılmaktadır. Buna ek olarak, gözenek boyutu ve lif kalınlığı, pH ve sıcaklık gibi 9,10 polimerizasyon koşulları, bağlıdır. Cam gibi sert yüzeyler, dan ve mesafe bağlama da matris 10,11 elastik özelliklerini değiştirebilirsiniz.

Bu makalede, tek bir hücre ya da sferoidlerinde hazırlanması ve 3D-kanser hücresi kültürlerinin görüntüleme yöntemleri açıklanır. Kanser hücresi parçacıklarının üretilmesi için yöntemler, daha önce Asılı damla yönteminde, 12,13 ve agaroz kaplı plaka yöntemi 14 olan en popüler olanlar tarif edilmiştir. Kanser hücresi göç için uygun bir ECM substrat olarak, oda-sıcaklığında polimerize nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni 2 mg / ml 'de kullanılmıştır. Nonpepsinized asitle ekstre kollajen sıçan kuyruk her ikisi de N-ve C-terminal telopeptid, doğal kolajen intermolec sorumlu kollajen molekülü nonhelical bölümleri korurular çapraz ve fibriller istikrar 15. Bununla birlikte, bu, in vivo koşullarda en yakın 10 gözlenen benzer olanlar kollajen ağların oluşmasına izin verir. Sabit ve oturma kültürlerde hem kolajen lifleri, görselleştirme izin vermek için, ayrıntılı bir protokol floresan 5 kullanılarak in vitro 10 kolajen etiketlemek için sağlanmaktadır - (and-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), süksinimidil ester. Bu protokol, Baici ark adapte edilmiştir. Floresein izotiosiyanat çözülebilir kolajen molekülü etiketlemek için kullanılır 16,17. Floresein gibi, TAMRA, örneğin N-terminalinde bulunan serbest amino grubu ve daha da önemlisi, lisinlerin yan amino grubu gibi proteinlerin nonprotonated alifatik amino grupları ile reaksiyona giren bir amino-reaktif bir floresan boya. Lisin amino grubu nonprotonated biçiminde olduğunda Bu reaksiyon, sadece temel bir pH değerinde meydana gelir. TAMRA fazla floresein daha kararlı olmasının yanı sıra,zaman, kendi emisyon spektrumları yararlı GFP etiketli proteinlerin canlı hücre görüntüleme için kombine edilebilir kırmızı / turuncu aralığı (ex / em = 555/518 nm), düşüyor. Amino-reaktif boyalar ile çözülebilir kolajen etiketli moleküller kullanılarak polimerizasyon işlemi ya yoğunluğu, gözenek büyüklüğü ve kollajen matris 10,16,18,19 arasında çapraz bağlanma durumunu etkilemez.

Bu protokol aynı zamanda daha iskeleti veya hücre iskeleti ilişkili protein etiketlemek için optimize edilmiştir endojen protein, 3 boyutlu immunofluorescent etiketleme için bir yöntem içerir. Bu protokolün son odak kollajen matriks gerginlik sert cam lamelleri gelen düşük katkı ile konfokal mikroskopi kullanılarak 3D kültürlerin yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için yöntemler üzerinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TAMRA-kollajen I Etiketleme

  1. Verilen 25 mg TAMRA toz halinde 2.5 ml DMSO eklenerek, 10 mg / ml 'TAMRA çözeltisi hazırlayın. Tam çözünme gerçekleşene kadar karıştırın tarafından çözülür. -20 º C'de saklayın ve ışıktan korumak.
  2. Etiketleme Tampon (0.25 M NaHCO3, 0.4 M NaCl) 2 L hazırlayın. 10 M NaOH çözeltisi ile 9.5 'e pH ayarlayın. 4 º C'de tutun Aksi belirtilen ve floresan malzeme alüminyum folyo kullanarak ışıktan korunan sürece bu noktadan sonra, tüm işlemleri 4 º C'de yapılmaktadır.
  3. Yüksek ölçüde konsantre, fare kuyruk kolajeni bir çözeltinin 1 ml'si ile bir 1 ml tek kullanımlık şırınga ile doldurun. Yüksek konsantrasyonlu kollajen çözümler, genellikle 10 mg / ml civarında konsantrasyonlarda sağlanır ve çok viskoz vardır. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaş yavaş işlemek için emin olun.
  4. Bir 21 G derialtı iğne kullanarak, MWCO kesilmiş 10.000 çimlendirilmiş 3 ml diyaliz kaset içine kollajen enjekte. Dama kaçınmak için dikkatli kullanınİğne ile membran dig. Şırınga piston yukarı çekerek diyaliz kaset tüm havayı çıkarın. Etiketleme Tampon 1 L karşı gecede Dialyze.
  5. Etiketleme Tampon 900 ul 10 mg / ml 'TAMRA çözeltisi 100 ul karıştırın. Not: DMSO 4 º C'de donar çünkü bu oda sıcaklığında TAMRA çözüm ve Etiketleme Tampon hem de yapılmalıdır Karıştırma sonra, seyreltilmiş TAMRA çözüm 4 º C geri getirmek
  6. Dikkatli bir şekilde 21 G derialtı iğne ile bir 2 ml tek kullanımlık şırınga kullanarak diyaliz kasetinden kollajen çıkarın. Pipetleme ile seyreltilmiş TAMRA çözeltinin 1 ml'si ile diyaliz kolajen çözeltisi, 1 ml karıştırın.
  7. 2 ml mikrosantrifüj tüp içine kollajen / TAMRA karışımı aktarın ve dönme ile gece inkübe edin.
  8. Bir çimlendirilmiş 3 ml diyaliz kaset içine TAMRA-etiketli kolajen 2 ml aktarın ve ücretsiz boya aşırı kaldırmak için Tampon Etiketleme 1 L karşı gece dialyze.
  9. TAMRA-lab geri yüklemek içinkollajen orijinal çözeltisine eLED kollajen,% 0.2 'nin 1 L' (v / v) asetik asit solüsyonu, pH 4, içine diyaliz kaseti koyun ve bir gece dialyze.
  10. TAMRA etiketli kolajen nihai hacim ölçülür ve kullanılan kolajen çözeltisi başlangıç ​​hacmi ve konsantrasyonu dikkate alındığında, nihai konsantrasyonunu hesaplamak. 4 º C'de saklayın

2. Gömülü Tek Hücreler ile 3D TAMRA-kollajen Matrisler

  1. Deney için gerekli 2 mg / ml TAMRA-Kollajen Mix hacmi hesaplayın. Her zaman kollajen yüksek viskozite nedeniyle ortaya çıkan kayıpların pipetleme için hesap% 20 daha fazla hazırlamak.
  2. 10x PBS ve 1 N NaOH arasında bir stok çözelti hazırlayın. 4 º C'de Filtre sterilize ve bakımı Aksi belirtilmedikçe, ve steril koşullar altında sürece bu noktadan itibaren, tüm operasyonları buz üzerinde yürütülmektedir.
  3. İstenen kollajen konsantrasyonu ve pH 7.4 'elde etmek için uygun hacimleri 10X PBS ve 1 N NaOH karıştırın. Örneğin, 1 ml 'lik bir son hacim itibarıylapH 7.4 'te TAMRA-kollajen karıştırın, 1 N NaOH ile 5 ul 10x 100 ul PBS birleştirir. İyice karıştırın.
  4. TAMRA etiketli kollajen ve 2 mg / ml 'lik bir son toplam kollajen konsantrasyonunu elde etmek için bir 01:06 oranında etiketlenmemiş kolajen hem de uygun hacimleri ekleyin. Örneğin, 2 mg / ml 'TAMRA-kollajen Karışım 1 ml' lik bir son hacim için, 3.68 mg / ml 'TAMRA etiketli kolajen ve 4.01 mg / etiketlenmemiş kollajen ml 415,71 ul 90.48 ul ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşumu kaçınarak, pipetleme iyi ve yavaş yavaş karıştırın.
  5. 10 5 hücre / ml ve 2 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyon kollajen bir nihai hücre yoğunluğu elde etmek için TAMRA-Kollajen Mix soğutulmuş FBS'siz hücre orta uygun hacmi içinde süspansiyon hücreleri ekleyin. Örneğin, 2 mg / ml 'TAMRA-kollajen Karışım, 1 ml, 10 5 hücreleri ihtiva eden ortam 388,81 ul ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşumu kaçınarak, pipetleme iyi ve yavaş yavaş karıştırın. Bir pH test s karışımı 10 ul test ederek pH onaylayıngezi.
  6. TAMRA-Kollajen cam alt yemekleri üzerine Mix ve 30-45 dakika oda sıcaklığında polimerize izin Pipet 100 ul damla. 100 ul kollagen damla 7 mm'lik tipik bir çapa sahiptir ve yüksek 2 mm'dir. Polimerize edildiğinde, kollajen, beyaz bir ish jel haline dönüşür. Not: kollajen çanak kapatmadan polimerize izin camdan dekolmanı azaltarak, kollajen damla etrafında bir su filmi oluşumunu önlemek olacaktır. Yapışma özelliğini arttırmak için, cam tabaklar 100 ug / ml 'de poli-L-lisin ile kaplanmış olabilir.
  7. Dikkatlice kollajen / hücre damla karşılamak için yeterli kültür ortamı ekleyin. Kollajen damla kolayca ayırmak çünkü medya veya ani hareketlerin yüksek akıları kaçının. Matris (genellikle 1-3 gün) göç hücreleri için yeterli zaman için 10% CO 2 nemlendirilmiş havada 37 º C'de tutun.

3. Gömülü Hücre sferoidler ile 3D TAMRA-kollajen Matrisler

  1. 2 mg / ml TAMRA-Kollajen M hacmi hesaplayınDeney için gerekli IX. Her zaman kollajen yüksek viskozite nedeniyle ortaya çıkan kayıpların pipetleme için hesap% 20 daha fazla hazırlamak.
  2. 10x PBS ve 1 N NaOH arasında bir stok çözelti hazırlayın. 4 º C'de Filtre sterilize ve bakımı Aksi belirtilmedikçe, ve steril koşullar altında sürece bu noktadan itibaren, tüm operasyonları buz üzerinde yürütülmektedir.
  3. 10x PBS karıştırın, uygun hacimleri olarak FBS'siz, 1 N NaOH ve hücre ortamı istenilen kollajen konsantrasyonu ve pH 7.4 'elde etmek. Örneğin, pH değeri 7.4 'de TAMRA-kollajen Karışım 1 ml' lik bir son hacim için, 10x 100 ul PBS, 1 N NaOH ve 5 ul medya 388,81 ul birleştirir. İyice karıştırın.
  4. TAMRA etiketli kollajen ve 2 mg / ml 'lik bir son toplam kollajen konsantrasyonunu elde etmek için bir 01:06 oranında etiketlenmemiş kolajen hem de uygun hacimleri ekleyin. Örneğin, 2 mg / ml 'TAMRA-kollajen Karışım 1 ml' lik bir son hacim için, 3.68 mg / ml 'TAMRA etiketli kollajen 90.48 ul ve unla içinde 4.01 mg / ml' 415,71 uldiği kollajen. Hava kabarcıklarının oluşumu kaçınarak, pipetleme iyi ve yavaş yavaş karıştırın. PH test şeridi üzerindeki karışımı 10 ul test ederek pH onaylayın.
  5. TAMRA-Kollajen cam alt yemekleri üzerine Mix ve 2-5 dakika polimerizasyon başlatmak için izin Pipet 100 ul damla. Bu biraz jel viskozite artırarak parçacıklarının batan önlemek için yardımcı olacaktır. 100 ul kollagen damla 7 mm'lik tipik bir çapa sahiptir ve yüksek 2 mm'dir.
  6. Bir hücre sfero toplayın ve temiz bir Petri kabı üzerine yerleştirin. Sıvı herhangi bir aşırı çıkarın ve TAMRA-Kollajen Mix 10 ul içinde tekrar süspansiyon. Bu, hücre ortamı ile kollajen seyreltme önlemek için önemlidir.
  7. Bir P20 pipet kullanarak, kollajen sfero askıya toplamak ve 100 ul TAMRA-Kollajen Mix damla ortasına üzerine yerleştirin. Not: işgal ve / veya göç birbirlerine kapasitesini etkileyebilir çünkü, kollajen damla başına birden fazla sfero koymayın.
  8. Poli için TAMRA-Kollajen Mix izin ver30-45 dakika boyunca oda sıcaklığında Merize. Polimerize edildiğinde, kollajen, beyaz bir ish jel haline dönüşür. Not: kollajen çanak kapatmadan polimerize izin camdan dekolmanı azaltarak, kollajen damla etrafında bir su filmi oluşumunu önlemek olacaktır. Yapışma özelliğini arttırmak için, cam tabaklar 100 ug / ml 'de poli-L-lisin ile kaplanmış olabilir.
  9. Dikkatlice kollajen / parçacıklarının damla karşılamak için yeterli kültür ortamı ekleyin. Kollajen damla kolayca ayırmak çünkü medya veya ani hareketlerin yüksek akıları kaçının.
  10. Hücreleri matrisi (genellikle 1-3 gün) işgal / göç için yeterli zaman için 10% CO 2 nemlendirilmiş havada 37 º C'de tutun.

4. 3D İmmünofloresan Boyama

  1. Dikkatlice hücre ortamı çıkarın ve PBS ile hücre / parçacıklarının içeren kollajen matris durulayın.
  2. Eş zamanlı olarak gidermek ve çıkarma / sabitleme tamponu (% 4 PFA PB,% 0.3 Triton X-100,% 5 sukroz ile inkübe hücreleri ayıklamak5 dakika boyunca s). 2 mcM Phalloidin ve hücre iskeleti veya hücre iskeleti ilişkili proteinlerin görselleştirme için Taxol 2 mcM ile tampon Ek.
  3. % 4 PFA, 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 sükroz ile hücreleri daha düzeltin. PBS içinde% 0.05 Tween-20 ile durulayın.
  4. PBS içinde birincil antikor çözüm hazırlayın. Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de en az 1 saat boyunca birincil antikor ile inkübe hücreleri Tüm kollajen damla karşılamak için yeterli çözüm eklemek için emin olun. 35 mm cam alt çanak için, çözüm 1.5-2 ml gerekli olacaktır. Not: antikor çözeltisinin hacmi azaltmak için, örneğin silikon yağı ya da bir PDMS halkanın daire hattı gibi suda çözünmeyen bir bariyer, kollajen damla etrafına yerleştirilebilir.
  5. PBS içinde% 0.05 Tween-20 ile 3 kez 30 dakika yıkayınız.
  6. Alexa-konjuge sekonder antikorlar, PBS içinde Alexa-konjuge Phalloidin ve DAPI çözümler hazırlayın. Oda sıcaklığında 2 saat için uygun sekonder antikor ile inkübe hücreleri.
  7. 3x 3 yıkayınPBS içinde% 0.05 Tween-20 ile 0 dak.
  8. , Sıvı aşan çıkarın cam alt çanak alt (yaklaşık 500 ul) doldurmak ve mühür üstüne bir 24 mm lamel yerleştirmek için medya montaj kadar ekleyin. Kollajen damla sıkıştırmak ve 3D organizasyon zarar vermemek için lamel aşağı bastırmayın.

5. Örnek Görüntüleme

Klasik ya da dönen bir disk konfokal mikroskoplar kullanılabilir. Bir ters sistemi tercihen cam alt görüntülü hücrelerin mesafeyi belirlemek için kullanılmalıdır. Bu iş için kullanılan sistem bir 40X/1.3NA ve 60X/1.4NA yağ daldırma hedefleri (sırasıyla mesafeleri 200 mikron ve 130 mikron, çalışma), bir Fotometrik CoolSnap HQ2 kamera 1392 x 1040 ile donatılmış bir Ters Konfokal İplik Disk olan görüntüleme dizi, 6.45 x 6.45 mikron piksel ve Metamorph görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir. 405 nm, 491 nm, 561 nm ve 633 nm lazerler genellikle% 30-50 güçte kullanılır, 1 kazanmak ve 2 binningx 2 pozlama süreleri azaltmak. , FITC (hariç 478-495; em 510-555) ve Texas Kırmızı (hariç 560-580,, mikroskop da DAPI (em 450-465 hariç 400-418 nm) için Hg lamba ve filtre küpler ile donatılmıştır em 600 -650) göz parça ile kullanmak için.

  1. Floresan lamba kullanarak, kollajen damla ortasında 40X objektif yerleştirin. Xy ekseni ve z-ekseni hem de örnek bir bakış, alın. Kenar etkileri önlemek için görüntüleri satın alırken xy ekseni üzerinde jel kenarından fazla 100 mikron sapma değil emin olun. Ne zaman görüntüleme parçacıklarının, onlar objektif çalışma mesafesi altında olduğundan emin olun. Uygunsa hedefi değiştirin.
  2. Konfokal canlı görüntüleme moduna geçin. Kollajen lifleri görünmeye başlar hangi z değerini belirlemek cam alt başlayarak, TAMRA-etiketli kollajen görselleştirmek için 561 nm lazer kullanarak. Bu alt tabaka ve z = 0 dır.
  3. Odak düğmesini kullanarak, z = 0 ile 100 mikron kadar gidin. Z = 100 mikron ancak hücreleriveya üzeri sert cam alt gerilim etkileri önlemek için görüntülü olmalıdır.
  4. Görüntü hücreleri seçin. Her dalga boyu için kamera pozlama süreleri ve lazer güç optimize edin. DAPI ve Alexa-488 Phalloidin için tipik pozlama süreleri 100-200 milisaniye arasındadır. Antikor boyama için pozlama süreleri değişebilir.
  5. Boyama ve odak düğmesini kullanarak Phalloidin görselleştirmek için uygun lazer kullanarak konfokal canlı modu, mevcut üst ve alt z değerleri ayarlayarak z serisi aralığı tanımlar.
  6. Z adım boyutunu tanımlayın. 40X hedefleri için, 1 mikron kullanın. 60X için, 0.5 mikron kullanın. Satın alma başlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TAMRA ile fare kuyruğu kollajen I Etiketleme 3D kollajen ağları kolay hazırlanması ve görselleştirme sağlar. In vivo 10 bulunan olanlarla karşılaştırılabilir organizasyon ile kollajen ağların oluşması ile, oda sıcaklığında sonuçlar yavaş polimerizasyonu.

Burada sferoidler olarak ve tek bir hücre olarak, hem CT26 kanser hücrelerinin hücre iskeletinin immünofloresan boyama için bir protokol mevcut. Daha iyi hücre iskeleti korumak için, tamponlar sırasıyla etiketsiz Phalloidin ve taksol, F-aktin ve mikrotübül stabilize bilinen ilaçlar ile eklenmiştir. Buna ek olarak, hücreler aynı anda sabit ve bireysel mikrotübül görselleştirme engelleyebilir nonpolymerized sitozolik tubulin havuzları kaldırmak için ayıklanır. Bu teknik, eşit iskeleti-ilişkili proteinlerin görselleştirmek için kullanılabilir. 3D, CT26 hücreleri bir ince uzun ile karakterize tipik mezenkimal morfolojisi mevcut olduğundahücre gövdesi, filopodia ve lamellipodia (Şekil 1 ve 2) benzer F-aktin zengin hücresel çıkıntılar uçlu. Bu uzun morfolojisi kollajen matriks (Şekil 2) işgal ederek hücre parçacıklarının kaçmaya çalışırken hücrelerde daha da belirgindir. Bir anti-tubulin antikoru kullanılarak mikrotübül boyanması iyi korunmuş ve düzenlenmiş mikrotübül ağı (Şekiller 1 ve 2) gösterilmektedir. Bu hücre şekli büyük ölçüde genellikle büyük geniş düz lamellipodia ile birçok lider kenarları ve filopodia 10 iyi tanımlanmış 2D yüzeylerde CT26 hücreleri, biri farklıdır.

Bu çalışmada elde edilen görüntüleri işlemek için, Imaris kullanılmıştır. Bu yazılım otomatik olarak tüm düzlemlerde kolay gezinme ve görüntüleme bir 3D projeksiyon içine alınan büyük z-yığınlarının (xy, xz ve yz) ve farklı açılardan (Şekil 1, 2 ve 3, orthogona dönüştürürl Defa Görüntülendi). "Kes 3D" fonksiyonunu kullanarak, yukarıda veya ilgili bölgenin altında gereksiz z uçaklar kaldırılabilir. Şekil 3 'de temsil edildiği gibi, bu tip bir hücre 3D dağılım sağlamak için, tüm bakış düzlemleri toplanan z yığınları analiz için çok önemlidir. Bu durumda, sferoidler olarak büyüdü CT26 hücreleri, maksimal XY projeksiyon olarak görselleştirilebilir zaman yoğun bir 3D kollajen matris istila gibi görünüyor. Ancak, xz görünüm tüm hücreleri işgali bir tercihli bölge düşündüren, sfero hacmi ile karşılaştırıldığında kısıtlı bir z aralığı istila olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sfero doğru ve sert 2B yüzeye hızlı hareket çanak ve hücrelerin cam alt çok yakın aslında.

Şekil 1
Şekil 1. CT26 hücrelerin kanser hücrelerinin hücre iskeletinin TAMRA etiketli kollajen I Col gömülüadenokarsinoma hücreleri üzerinde CT26 2 mg / ml TAMRA etiketli kollajen I (kırmızı) tek bir hücre olarak yerleştirilmiştir. Etiket mikrotübüle bir tubulin antikor (mavi), nükleer boyama F-aktin (yeşil) ve DAPI (mavi) görselleştirmek için Alexa-488 Phalloidin ile boyanmış kültürlerin İmmünofloresan görüntüleri. 3D görüntü 38 mikron z-yığınlarının xy maksimum projeksiyon karşılık gelir. Ortogonal xz (Birleştirme alt) ve yz (sağ Birleştirme) Görüntüleme birleştirme. Ölçek çubuğu, 20 mikron. Daha büyük resim için tıklayınız .

Şekil 2,
Şekil 2. Hücresel sferoidler olarak büyüdü TAMRA etiketli kollajen I CT26 hücreleri istila CT26 hücrelerin kanser hücrelerinin hücre iskeletinin 2 mg / ml TAMRA etiketli kollajen I (kırmızı) gömüldü. Kültür içinde 2 gün sonra, hücrelerin başladı, kollajen 3D matris vading hücre sfero uzaklaşıyor. Etiket mikrotübüle bir tubulin antikor (mavi), nükleer boyama F-aktin (yeşil) ve DAPI (mavi) görselleştirmek için Alexa-488 Phalloidin ile boyanmış kültürlerin İmmünofloresan görüntüleri. 3D görüntü 66 mikron z-yığınlarının xy maksimum projeksiyon karşılık gelir. Ortogonal xz (Birleştirme alt) ve yz (sağ Birleştirme) Görüntüleme birleştirme. Ölçek çubuğu, 50 mm. büyük resim görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Ben cam mesafeye bağlıdır. CT26 hücreler kolajen CT26 hücreleri işgal hücresel sferoidler olarak büyüdü ve kültür içinde 2 gün sonra 2 mg / ml kolajen I gömülü olan, belirgin bir T hücreleri istila, hücre küremsi uzaklaşmıştıro 3D kollajen matriks ama 2D sert camına sürünerek. Kültürlerin floresan görüntüleri F-aktin görselleştirmek için Alexa-488 Phalloidin ile boyanmış. A) 3D görüntü. B) Ortogonal xz görünümü 200 mikron z-yığınlarının xy maksimum projeksiyon karşılık gelir. Ölçek çubuğu, 150 mikron. Daha büyük resim için tıklayınız .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol floresan bir 561 nm lazer ile donatılmış bir standart konfokal mikroskop kullanarak, kollajen ağ organizasyonu kolay görselleştirme izin için mükemmel bir yöntem sağlar TAMRA kullanarak kollajen etiketlemek için burada açıklanan. Yansıma konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu tekniğin bir avantajı, 3D matris derinliklerine dosyasını kolajen lifleri yeteneğidir. Liflerin yansıma yoğunluğuna ve kontrast lazer ışığı emme ve saçılma bağlı derinliği ile esas olarak azalır. Lifleri görüntüleme uçaktan 50 º yaklaşık uyumlu yana, tamamen tespit edilmemiş yansıma konfokal mikroskopi edilir kullanırken Ayrıca, kollajen lifleri yönünü büyük bir handikap olabilir. Floresan etiketli lifleri kendi yönelim 20 bağımsız benzer parlaklık ile tespit edilir. Artan bir in vitro ve in vivo olarak kollajen lifleri, görselleştirmek için kullanılan başka bir yöntem olup, ikinci harmonik gen gereğidirl İşlemler (SHG). Bu süreç, kollajen 21 gibi noncentrosymmetric yapıları ile sinyal SHG emisyon dayanmaktadır. Ancak, SHG standart laboratuvar görüntüleme cihazları bir parçası olmayan bir multiphoton mikroskop, gerektirir.

Bir fluorofor olarak TAMRA n kullan özel değildir. Böyle bir protein etiketleme kitler ticari olarak mevcut bulunan Cy2, Cy5, Alexa Fluor veya ailesi gibi diğer florofor, kullanıcı için en uygun renkte etiket kolajen için kullanılabilir. Floresan kollajen kullanmanın diğer bir avantajı yakın hücre-matris etkileşimlerinin ya da hücre-matriks kaynaklı şekil takip zaman atlamalı görüntüleme için, floresan-etiketli proteinleri ile transfekte edilmiş bir hücreler ile kombine edilebilir potansiyelidir. Ayrıca, 2B deneylerinde kolajen ince kaplama lamelleri için kullanılabilir.

Onlar yerçekimi nedeniyle batmaya bir eğilim var çünkü 3D matris hücreleri gömülmesi, büyük parçacıklarının kullanarak, özellikle hassas bir işlemdir. Ayrıca,hücreler genellikle sert ortamlara çekti ve yeterince yakın cam ile oluşturulan gerilim artış hissetmek cam lamel 3D matris bölgelerinde gömülü zaman, onlar sert 2D yüzey doğru hareket. Büyük parçacıklarının batan önlemek için bir teknik hile kollajen kısaca matris damla üstüne sfero yerleştirmeden önce (2-5 dk) polimerize sağlamaktır. Bu hafif batan zaman artan, jel viskozitesi artar. Bununla birlikte, birkaç başarı olasılığını artırmak için çoğaltır hazırlamak için iyi bir uygulamadır. Öte yandan, bu amaç çalışma mesafesi altında hücre tutmak için önemlidir. Daha düşük bir büyütme amaçları genellikle daha büyük bir çalışma mesafesi ve bir küremsi farklı hücre tipleri işgali karşılaştırma örneğin, kaba bir alan görüntüler için de kullanılabilir. büyük çalışma mesafeleri ile yüksek çözünürlüklü görüntüler gereklidir, suya daldırma hedefleri, büyük ölçüde tavsiye edilir.

10 böyle paxilin, vinculin ve zyxin gibi fokal yapışma işaretleri, etiketlemek için kullanılmıştır. Biz genel bir 3D immün protokol oluşturmak için çalışmayın. 2B'de olduğu gibi, her bir antikor her bir antikor gerektirebilir olabilir için farklı bir sabitleme işlemi ve belirli bir protokol tasarım gerektirebilird. Bu protokol başlangıç ​​noktası olarak sunulur ve kullanıcıların matris içinde hücre şekli ve lokalizasyonu hakkında bir fikir sağlamak için boyama bir floresan Phalloidin dahil önerilmektedir.

Kalın kollagen matrisleri fizyolojik bir ECM'de hücre göçü incelemek için in vitro sistemde iyi basitleştirilmiştir. Bir canlı doku kimyasal ve fiziksel karmaşıklığı yoksun olmasına rağmen, bu sistem, gözenek boyutu, elastikiyet ve çapraz bağlama gibi özel ECM'nin özellikleri, manipülasyon sağlar. Biz bu protokolleri 2D analiz uzun yıllar moleküler kompozisyon, lokalizasyonu ve hücresel yapılarının fonksiyonları daha iyi bir açıklama katkıda bulunacak ve 3D hücre davranış bilgilerimizi geliştirmek istiyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar minnetle görüntü Şekil 3 ve PICT Ibisa Görüntüleme Tesisi (Institute Curie) olarak edinme ve işleme için Dr Vasily Gurchenkov (Institut Curie) kabul. In vitro hücre modellerinde Kompleksi - Bu çalışma ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 ve PIC 3D tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

Tags

Tıp Sayı 80 TAMRA kollajen 3D matris parçacıklarının F-aktin mikrotübül
3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter