En struktureret protokol præsenteres for en celle-baserede assay som en funktionel test til at forudsige prognosen for idiopatisk skoliose hjælp cellulær dielektrisk spektroskopi (CDS). Assayet kan udføres med friske eller frosne perifere mononukleære blodceller (PBMC'er), og proceduren er afsluttet inden for 4 dage.
Denne protokol beskriver den eksperimentelle og analytiske procedure for en celle-baserede assay udviklet i vores laboratorium som en funktionel test til at forudsige prognosen for idiopatisk skoliose hos asymptomatiske og berørte børn. Analysen består af evalueringen af den funktionelle status af Gi og Gs proteiner i perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) ved cellulær dielektrisk spektroskopi (CDS), ved hjælp af en automatiseret CDS-instrument, og klassificeringen af børn i tre funktionelle grupper (FG1 , FG2, FG3) med hensyn til profilen af ubalance mellem graden af respons på Gi og Gs-proteiner stimulation. Klassificeringen bekræftes yderligere af den differentierede virkning af osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blandt grupper og den alvorlige progression af sygdommen er refereres af FG2. Cirka, er et volumen på 10 ml blod der kræves for at udtrække PBMC'er ved Ficoll-gradient og celler bliver derefter opbevaret i flydende nitrogen. Det passende antal PBMC'er at udføre analysen opnås efter to dage med cellekultur. Grundlæggende er celler først inkuberet med phytohemmaglutinin (PHA). Efter 24 timers inkubation udskiftes mediet med et PHA-dyrkningsmedium i yderligere 24 timer før cellepodning og OPN behandling. Celler bliver derefter spektroskopisk screenet for deres svar på somatostatin og isoproterenol, som henholdsvis aktiverer Gi og Gs proteiner gennem deres beslægtede receptorer. Både somatostatin og isoproterenol samtidigt indsprøjtes med en integreret fluidik, og cellernes respons overvåges i 15 min. Assayet kan udføres med friske eller frosne PBMC'er, og proceduren er afsluttet inden for 4 dage.
Idiopatisk skoliose er en rygrad deformitet af ukendt årsag generelt defineret som en lateral krumning større end 10 grader, ledsaget af en vertebral rotation 1. Betingelsen påvirker 4% af den pædiatriske befolkning, og er mest almindeligt diagnosticeret i alderen af 9 til 13 år 2,3,4. Diagnosen er primært for udstødelse og er lavet efter at udelukke andre årsager til spinal deformitet, såsom vertebral misdannelse, neuromuskulære eller syndromiske lidelser. Traditionelt er trunkal asymmetri afsløret af Adams fremad bøjning test og måles med scoliometer under fysisk undersøgelse 5.. Diagnosen kan derefter bekræftes ved radiografisk observation af kurven og den vinkel måling ved hjælp af Cobb-metoden 6.
Når diagnosticeret, er den primære bekymring for læger i forvaltningen scoliosis børn om kurven vil fremskridt. Faktisk kurveprogressionen er ofte uforudsigelig oger observeret hyppigere blandt piger end hos drenge 7. Hvis ubehandlet, kan kurven fremskridt dramatisk, hvilket skaber en betydelig fysisk deformitet og endda kardiopulmonale problemer. Disse manifestationer blive livstruende, når kurven overstiger 70 ° 8,9. De nuværende behandlingsmuligheder for at forhindre eller standse kurveprogression omfatter skinner og kirurgi. Generelt afstivningselementer anbefales til kurver mellem 25-40 °, mens operationen er forbeholdt kurver mere end 45 ° eller ikke reagerer på afstivning.
Ca. 10% af børn diagnosticeret med idiopatisk skoliose har kurveprogression kræver korrigerende kirurgi 10. I øjeblikket er der ingen dokumenteret metode eller test til rådighed til at identificere denne gruppe patienter. Derfor er alle diagnosticerede børn udsættes for flere røntgenbilleder over flere år, som regel indtil de når skelet modenhed. Det anslås, at de typiske patienter med skoliose vil havecirka 22 radiologiske undersøgelser over en 3-årig periode 11. På grund af den potentielle risiko for flere radiografiske undersøgelser, de alternative tilgange, der kan tillade udførelse af prognosen for idiopatisk skoliose uden at udsætte børn for ioniserende stråling er stærkt ønskelig. Med den hensigt at opfylde dette behov har vi tidligere udviklet en celle-baseret screening assay som en prognostisk test til hurtigere at identificere de asymptomatiske børn med risiko for at udvikle idiopatisk skoliose. Testen forudsiger det kliniske resultat i både asymptomatiske og ramte børn ved at undersøge den funktionelle status Gi proteiner og klassificere børn i tre funktionelle grupper (FG1, FG2 og FG3), i henhold til graden af den maksimale respons på Gi protein stimulation 12 målt ved CDS -baseret system. Dette system er i vid udstrækning anvendes til at vurdere signaltransduktion gennem G-proteiner i forskellige celletyper 13,14,15,16. Det giver oplysninger omsamlet integreret cellernes reaktion på eksterne stimuli ved at måle ændringer i impedans som følge af aktiveringen af celleoverfladereceptorer. Cellerne podes i mikrotiterplader, der indeholder elektroder i bunden af brøndene, og systemet anvender en lille spænding, der inducerer ekstracellulære og transcellulær strømme. Følgende forbindelse indsprøjtning i brønden, er celleoverfladereceptorer stimuleres og signaltransduktionsbegivenheder forekomme, hvilket fører til cellulære ændringer, der påvirker strømmen af ekstracellulære og transcellulær strømme og derved påvirke den målte størrelse. Med denne fremgangsmåde, de scoliosis patienter og børn større risiko for at udvikle skoliose er mindre lydhøre over for Gi protein stimulation sammenlignet med raske kontrolpersoner, og klassificeringen er baseret på procentdelen af graden af reduktion i forhold til kontrolgruppen. Klassifikationstrinene intervaller er fastgjort mellem 10 og 40% for FG3, 40 og 60% for FG2, og 60 og 90% for FG1 12.
<p class = "jove_content"> På det seneste har vi ændret denne tilgang ved at demonstrere, at de tre funktionelle grupper tydeligt kan skelnes ifølge profilen af ubalance mellem respons på Gi og Gs stimulation. Faktisk fandt vi, at reaktion på Gi stimulering dominerede i FG3, mens ingen tilsyneladende ubalance blev observeret i FG2. I modsætning hertil FG1 udstillede overvægt af respons på Gs stimulering. Desuden har vi givet beviser for, at patienter, der tilhører FG2 er mere udsatte for forløber til det punkt, at behøve kirurgi 17. Præcisionen af denne klassifikation test er yderligere blevet forbedret ved at demonstrere en differentieret effekt af osteopontin (OPN) på respons på Gi stimulering blandt funktionelle grupper.Her dokumenterer vi detaljerede trin eksperimentelle og analytiske procedurer i dette funktionelle test som i øjeblikket varetages i vores laboratorium.
Vi har beskrevet en detaljeret procedure af en celle-baserede prognostiske test for idiopatisk skoliose, der gælder for perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) frisk isolerede eller bevares nedfrosset i op til et år i flydende nitrogen. Da brug frisk isolerede PBMC'er er besværlig, når du tester stort antal individer, blev proceduren præsenteret med frosne PBMC'er, der tilbyder en mere praktisk alternativ i kliniske omgivelser. Men problemer med celle sammenklumpning ved optøning opstod, da frosne PBMC'er blev oprindeligt brugt, fører undertiden til inter-analyse variation. For at maksimere assay reproducerbarhed, anbefaler vi at undgå fryse-tø cyklus, og kun én gang ved hjælp af den frosne prøve. Fremgangsmåden er meget enkel, giver mulighed for nøjagtig påvisning af defekte Gi proteinfunktion i en kort tid. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, kan asymptomatiske og scoliosis børn let klassificeret til bedre at forudsige deres kliniske resultat uden fare for deres helbred. HoWever, når du udfører klassificering i henhold til graden af den maksimale respons på Gi stimulation i forhold til raske kontrolpersoner 12 flere krav til kontrolpersoner bør opfyldes. Faktisk, for at have en ordentlig sammenligning kohorte, skal kontrolpersoner være alder og matches køn, ikke være på nogen form for medicin, og give private oplysninger, så som tidligere individ / familiær sygehistorie. Disse krav kan udgøre en vigtig hindring for rekruttering af kontrolpersoner. Derfor udfører klassifikation ved at undersøge graden af ubalance mellem respons på Gi og Gs protein stimulation i samme individ er ideel til at fjerne nødvendigheden af at bruge kontrolpersoner.
Brugen af CDS-baseret system til at udføre denne prognostisk test er signifikant i forhold til samtidig give Gi-og Gs-medierede cellulære reaktioner i det samme assay. Selv om mange patienter kan klassificeres med nogen ambiguity hjælp dynamikområdet er fastsat for dette assay, vil et lille antal patienter udviser værdier på grænsen af intervaller, som illustreret ved resultaterne af denne rapport. At skelne disse individer har vi indført evaluering af virkningen af OPN på respons på Gi stimulering ved at påvise, at OPN inducerer en differential virkning på Gi-cellulær respons blandt de tre funktionelle grupper. Faktisk fandt vi, at i nærværelse af OPN, reaktion på Gi stimulation stigninger i FG1, mens den falder i FG2 og FG3 i højere grad i FG2. På trods af den høje pris på OPN, er af afgørende betydning at anvende dette chemokin at skelne tvivlstilfælde og derfor forbedre nøjagtigheden af vores klassificering assay. Men dette assay har den ulempe, at et minimum på 1,5 x 10 5 celler pr skal overholde cellulære respons med CDS-baseret system under vore eksperimentelle betingelser. Visse patientprøver vil ikke have et tilstrækkeligt antalceller, der skal testes. I dette tilfælde er det nødvendigt at minde patienterne om yderligere blodtapning, som kan være bekymrende for familier og frustrerende for de medicinske og laboratorie personale. Prospektive undersøgelser er planlagt i vores laboratorium for at løse dette problem.
Ikke desto mindre er den nuværende protokol bygger på enkle og gennemprøvede metoder til at forberede celler, mens testen er automatiseret ved hjælp af en valideret etiket-fri-system 13, 14 for at overvåge cellernes svar. The test platform er relativt billigt sammenlignet med genetisk platform til rådighed for prognosen for andre sygdomme. Også udgifterne til alle de disponible materialer, herunder blodopsamlingsrør, tips, den særlige elektrode mikroplader, og koniske og Eppendorf-rør, er ikke meget dyrt og er anslået til mindre end $ 3.000 til at fuldføre en test for cirka tusind patienter. Selvom dette skøn ikke omfatter lønomkostninger til forberedelse af prøverog udførelsen af de test, denne test fortsat betydeligt mere overkommelig end næste generation sekventering platforme. Bemærkelsesværdige er ikke kun udgifterne sammenlignet med genetiske platforme, men mere specifikt relateret til området for AIS, er de omkostninger, der er forbundet med radiologisk billeddannelse. I dag er mere end en million børn i USA og omkring 100.000 børn i Canada diagnosticeret med idiopatisk skoliose, og de samlede udgifter til diagnose og overvågning af de scoliosis børn ved røntgen-eksponering er over 2,5 milliarder dollars årligt i Nordamerika. Således vil vores celle-baserede assay procedure forventes at være egnet til rutinemæssig screening og overvågning af børn med idiopatisk skoliose uden sundhedsrisiko og til lavere omkostninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, Frankrig (Dr. Moreau) Den canadiske Institutes of Health Research (indrømme PP2-99466 til Dr. Moreau), og fra fjerde dimension Spine LLC , New York, USA (Research tilskud til Dr. Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |