Summary
פרוטוקול מובנה מוצג לassay מבוסס תאים כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית באמצעות ספקטרוסקופיית סלולרית דיאלקטרי (CDS). Assay ניתן לבצע עם תאים טריים או קפוא היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) וההליך יושלם בתוך 4 ימים.
Abstract
פרוטוקול זה מפרט את ההליך ניסיוני ואנליטיים לassay מבוסס תאים שפותח במעבדה שלנו כמבחן פונקציונלי לנבא את הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית בילדים אסימפטומטיים ומושפעים. Assay מורכב מההערכה של המצב התפקודי של חלבוני Gi ו-G בתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על ידי ספקטרוסקופיה הסלולרית דיאלקטרי (CDS), תוך שימוש במכשיר אוטומטי המבוסס על ה-CDS, וסיווגם של ילדים לשלוש קבוצות פונקציונליות (FG1 , FG2, FG3) ביחס לפרופיל של חוסר איזון בין מידת התגובה לGi וגירוי חלבוני GS. הסיווג הוא אושר עוד יותר על ידי אפקט ההפרש של osteopontin (OPN) בתגובה לגירוי Gi בין קבוצות ואת ההתקדמות החמורה של מחלה הפניה FG2. כ, בהיקף של 10 מיליליטר של דם נדרש כדי לחלץ PBMCs ידי Ficoll-שיפוע ותאים אז מאוחסן בחנקן נוזלי. המספר מספיק של PBMCs לבצע assay מתקבל לאחר יומיים של תרבית תאים. בעיקרו של דבר, תאים מודגרת ראשון עם phytohemmaglutinin (PHA). לאחר 24 דגירה שעות, בינוני הוא הוחלף על ידי תרבות בינונית ללא PHA ל24 שעות נוספות לפני זריעת תאים וטיפול OPN. לאחר מכן תאים מוקרנים spectroscopically לתגובות שלהם לסומטוסטטין וisoproterenol, אשר בהתאמה להפעיל חלבוני Gi וGs באמצעות קולטנים מאותו המקור שלהם. סומטוסטטין וisoproterenol שניהם הזריקו בו זמנית עם מערכת fluidics משולבת והתגובות של התאים נמצאות תחת פיקוח במשך 15 דקות. Assay ניתן לבצע עם PBMCs טריות או קפוא וההליך יושלם בתוך 4 ימים.
Introduction
עקמת אידיופטית היא עיוות בעמוד השדרה של גורמים לא ידועים בדרך כלל מוגדרת כעקמומיות לרוחב גדולה יותר מ10 מעלות מלוות בסיבוב בחוליות 1. המצב משפיע על 4% מאוכלוסיית הילדים, והוא בדרך כלל מאובחן בגילאי 9 עד 13 2,3,4. האבחנה היא בעיקר של הדרה ונעשתה רק לאחר שלילת גורמים אחרים של עיוות בעמוד השדרה, כגון מום בעמוד השדרה, התוקפת או הפרעות syndromic. באופן מסורתי, הסימטריה trunkal מתגלה על ידי מבחן קדימה כיפוף אדמס ונמדדה עם scoliometer במהלך בדיקה גופנית 5. האבחון ואז יכול להיות מאושר על ידי תצפית רדיוגרפי של העקומה ומדידת הזווית תוך שימוש בשיטת קוב 6.
לאחר שאובחן, הדאגה העיקרית עבור רופאים בניהול ילדי scoliotic היא האם העקומה תהיה התקדמות. ואכן, את ההתקדמות העקומה היא לעתים קרובות בלתי צפויה והוא נצפה בקרב בנות בתדירות גבוהה יותר מאשר אצל בני 7. אם לא מטפלים, העקומה יכולה להתקדם באופן דרמטי, ויוצרת עיוות פיזית משמעותית ובעיות אפילו cardiopulmonary. גילויים אלה הופכים סכנת חיים כאשר העקומה עולה 70 ° 8,9. אפשרויות הטיפול הנוכחיות כדי למנוע או לעצור את ההתקדמות עקומה כוללות מרעננות וניתוח. באופן כללי, המרענן מומלץ לעקומות בין 25-40 °, ואילו ניתוח שמור לעקומות גדולות מ45 ° או להגיב למרענן.
כ, 10% מילדים שאובחנו עם עקמת אידיופטית יש התקדמות עקומה הדורשת ניתוח מתקן 10. נכון לעכשיו, לא קיימת שיטה או בדיקה זמינה לזהות קטגוריה זו של חולים מוכחים. כתוצאה מכך, כל הילדים שאובחנו חשופים לצילומי רנטגן המרובים על פני מספר שנים, בדרך כלל עד שהם מגיעים לבגרות שלד. הערכה היא כי החולים הטיפוסיים עם עקמת יהיו ליכ 22 בדיקות רדיולוגיות על פני תקופה של 3 שנות 11. בגלל הסיכון הפוטנציאלי של בדיקות רדיוגרפי מרובות, הגישות חלופיות, שעלול לאפשר ביצוע הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית בלי לחשוף ילדים לקרינה מייננת הן מאוד רצויות. במטרה לענות על צורך זה, פיתחנו בעבר assay הקרנה מבוסס תאים כמבחן פרוגנוסטיים לזהות מוקדם את הילדים אסימפטומטיים בסיכון לפתח עקמת אידיופטית. המבחן מנבא את התוצאה הקלינית בשני ילדים אסימפטומטיים ומושפעים על ידי בחינת המצב התפקודי של חלבוני Gi וסיווג ילדים לשלוש קבוצות פונקציונליות (FG1, FG2 וFG3) בהתאם למידת תגובה לגירוי מקסימלי חלבון Gi 12 כפי שהיא נמדדת על ידי CDS מערכת מבוססת. מערכת זו משמשת בעיקר כדי להעריך את העברת אותות באמצעות חלבוני G בסוגי תאים שונים 13,14,15,16. זה מניב מידע לגבי תגובה כוללת משולבת של התאים לגירויים החיצוניים על ידי מדידת שינויים בעכבה בעקבות ההפעלה של הקולטנים בתא שטח. תאים הם זורעים לתוך microplates המכילים אלקטרודות בתחתית הבארות והמערכת חלה מתח קטן שיוצר זרמים תאיים וtranscellular. לאחר הזרקת תרכובת לתוך הבאר, קולטני תא שטח הם גירוי ואירועים הולכים אותות להתרחש, מה שמוביל לשינויים תאיים המשפיעים על הזרימה של זרמים תאיים וtranscellular, ובכך להשפיע על הגודל הנמדד. עם גישה זו, חולי scoliotic וילדים בסיכון גבוהים יותר לפתח עקמת מגיבים פחות לגירוי חלבון Gi בהשוואה לנבדקים בריאים, והסיווג מבוסס על אחוז ממידת הפחתה ביחס לקבוצת ביקורת. טווחי הסיווג קבועים בין 10 40% לFG3, 40 ו60% לFG2, ו60 ו90% לFG1 12.
ss = "jove_content"> לאחרונה, יש לנו שונה בגישה זו על ידי הוכחת כי באופן ברור ניתן להבחין בשלוש הקבוצות פונקציונליות בהתאם לפרופיל של חוסר איזון בין התגובה לGi וגירוי GS. ואכן, מצאה שתגובה לגירוי Gi שלטה בFG3, בעוד שאין חוסר איזון לכאורה נצפה בFG2. לעומת זאת, FG1 הציג דומיננטיות לתגובה לגירוי GS. בנוסף, יש לנו סיפקנו את הראיות לכך שחולים השייכים לFG2 נמצאים בסיכון גבוה יותר של התקדמות עד לנקודה של צורך ניתוח 17. הדיוק של בדיקת סיווג זה עוד יותר שופר על ידי הוכחת השפעת ההפרש של osteopontin (OPN) בתגובה לגירוי Gi בין קבוצות פונקציונליות.
כאן אנו לתעד את הצעדים מפורטים של הפרוצדורות ואנליטי של בדיקה פונקציונלית זו הופיעה ככרגע במעבדה שלנו.
Protocol
התהליך כולו מתבצע מתחת למכסת המנוע הביולוגי סטרילי וכל הפתרונות והציוד הבאים במגע עם תאים חייבים להיות סטרילי.
1. הכנה של פתרונות חיוניים
- הכן את הפתרונות לפי טבלת 1.
- שמור על פתרון מאוזן מלח (BSS) בטמפרטורת חדר וכל פתרונות האחרים על 4 מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.
- מדיה חמה קרה ל37 מעלות צלזיוס באמבט המים במשך כמה דקות לפני השימוש.
2. הכנה ואחסון של PBMCs
- לאסוף 10 מיליליטר של דם מלא בצינורות איסוף שטופלה EDTA להכין שני aliquots של PBMCs באמצעות 5 מ"ל לכל aliquot.
- העברה 5 מיליליטר של דם מלא מצינור האיסוף שטופלה EDTA לצינור 50 מיליליטר.
- הוסף נפח שווה של BSS ומערבבים מדגם על ידי pipetting העדין מעלה ומטה.
- מניחים 3 מיליליטר של Ficoll בשני 15 צינורות מיליליטר פלקון.
- שכבת זהירות 4.5 מיליליטרשל דילול תערובת דם מעל Ficoll בצינור אחד.
- בואו הצינורות לנוח לתקופה של עד 5 דקות לטובת הפרדה ברורה של הדם וFicoll.
- צנטריפוגה הצינורות ב XG 400 ל30 דקות בטמפרטורת חדר עם בלם לא.
- מוציאים בזהירות את הצינורות מצנטריפוגות כדי לא להפריע את השכבות. PBMCs גלויות בממשק BSS / Ficoll.
- לקצור את השכבה מעוננת של PBMCs בממשק של שני הצינורות עם טפטפת ולהעביר לצינור מיליליטר 50 חדש.
- הוסף 20 מיליליטר של מדיה מלאה.
- צנטריפוגות הצינור ב288 XG במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה.
- Resuspend התא גלולה ב μl 500 של מדיה משלימה.
- הוסף נפח שווה של תקשורת הקפאה.
- מעביר את ההשעיה התא לcryovial.
- הנח את cryovial לתוך מיכל cryofreezing עם isopropanol.
- אחסן את מיכל ההקפאה ב -80 ° C במשך הלילה.
- Transfer PBMCs הקפואה aliquot לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
3. Assay פונקציונלי
1. יום 1
- הנח aliquot מחנקן נוזלי באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקה או עד שהופשר.
- מעביר את ההשעיה תא צינור 50 מיליליטר עם פיפטה סטרילית.
- הוסף 15 מיליליטר של מדיה מלאה ולסובב את התאים למטה XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה.
- בעדינות להשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר של תקשורת PHA.
- השלם את הנפח עד 20 מיליליטר עם אותה התקשורת.
- שווי הצינור באופן רופף, כדי לאפשר לאוויר להיכנס.
- השאר את צינור הלילה ב 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 כדי לאפשר לימפוציטים שקטים להפוך לlymphoblasts מהירות-מתרבים.
2. יום 2
- קח את הצינור אל מחוץ לחממה, לדפוק את כובעים לחלוטין ולסובב את התאים למטה XG 200 במשך 5 דקותבטמפרטורת חדר.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה.
- בעדינות להשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיה מלאה.
- השלם את הנפח עד 20 מיליליטר עם אותה התקשורת.
- שווי הצינור באופן רופף, כדי לאפשר לאוויר להיכנס.
- השאר את צינור הלילה ב 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 להרחיב את המספרים סלולריים.
3. יום 3
- קבל את הצינור אל מחוץ לחממה, לדפוק את כובעים לחלוטין ולסובב את התאים למטה XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה.
- שטוף תאים פעמיים עם 10 מיליליטר של RPMI-1640 ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- בעדינות resuspend התא גלולה ב μl 600 של RPMI-1640.
- למדוד את ריכוז תאים ואת הכדאיות, באמצעות מונה תא אוטומטי ומנתח כדאיות.
- הוספת נפח מתאים של RPMI-1640 להסתגל לריכוז תא של 1.5 x 10 5 cells/20 μl. טיפול בתאים עם OPN רקומביננטי (rOPN) או רכב (PBS) ב1.5 מיליליטר של צינורות Eppendorf.
- העבר את ההשעיה תא 100 μl לשני 1.5 מיליליטר Eppendorf צינורות סטרילי.
- הוספת rOPN בצינור אחד לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר.
- הוסף נפח שווה של PBS בצינור השני.
- לערבב בעדינות כל תנאי על ידי pipetting למעלה ולמטה פעמיים באמצעות סט פיפטה סטרילית ב100 μl.
- הכן את המדגם הקטן microplate 96 היטב.
- הוסף 5 μl של RPMI-1640 היטב כל אחד.
- צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 במשך 3 דקות כדי להסיר כל בועות אוויר.
- זרעי תאים שלא טופלו, כמו גם תאים שטופלו בrOPN או PBS.
- לפני העברת תאים מצינור לmicroplate, פיפטה בעדינות מעלה ומטה פעם אחת כדי להבטיח השעיה אחידה של תאים.
- הוסף 40 μl של תא השעיה לכל גם בארבעה לתאים שלא טופלו, בשני עותקים לrOPN או PBS תאים שטופל. ReFER איור 1 לעיצוב. עיצוב זה מאפשר 12 חולים להיבדק באותו microplate.
- השאר את צלחת התא מתחת למכסת מנוע סטרילי במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים לנוח וליישב באופן שווה לתחתית הבאר לפני הצבת בחממה.
- דגירה את הצלחת ל18 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 כדי לייעל את ההשפעה של OPN.
4. יום 4
- הפעל את הצלחת עם תרכובות.
- קח את הצלחת מחוץ לחממה ולהשאיר אותה ב RT עבור סביב 30 דקות.
- הכן 1 מיליליטר של של סומטוסטטין וisoproterenol RPMI-1640 100 מיקרומטר על ידי הוספת 10 μl של פתרון מניות (10 מ"מ) ב990 μl של RPMI-1640.
- מלא את הצלחת במתחם על ידי מחלק 20 μl בבארות מתאימות כפי שמצוין באיור 2.
- מכסה את צלחת המתחם עם חותם לנקבה חתוכה מראש, כדי למנוע שינוי בריכוז מתחם בשל התאדות לפניאו במהלך דגירה במערכת מבוססת ה-CDS.
- צלחת טען תא, טיפים פיפטה, וצלחת מתחם לתוך המערכת מבוססת ה-CDS.
- תן שם לצלחת בתוכנה במכשיר המבוססת על ה-CDS.
- בחר את הפרוטוקול המתאים. הפרוטוקול נערך לסיווג עם PBMCs נקרא "תאי אגוניסט אינו חסיד פלייט מדגם הקטן RT 15 דקות". עבור לתיבת הפרוטוקול ובחר בפרוטוקול זה ברשימה של פרוטוקולים
- ליזום את הפרוטוקול על ידי לחיצה על "התחל".
- מערכת fluidics המשולבת בו זמנית מוסיפה תרכובות לכל הבארות על ידי הזרקת 5 μl לכל טוב כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר בנפח כולל של 50 μl.
- המערכת מבוססת ה-CDS באופן אוטומטי אוספת את הנתונים עבור 15 דקות אחרי תוספת מתחם.
- ניתוח נתונים
- בחר טווחים נמוכים וגבוהים של תדרים לשימוש בעת חישוב ערכים שחולצו לאיתאים חסיד.
- בחר תיקון להיסחף כדי לתקן את השינוי ליניארי במדידות עכבה בסיסיות לאורך זמן.
- בחר סינון נתונים כדי להפחית וריאציות במדידת התגובה קינטית עקב רעש אלקטרוני ובנוסף מתחם.
- בחר את שיטת Max-Min בפעם הניתוח מלא.
- יצוא נתונים ל-Excel באפשרות פורמט צלחת.
- חישוב הדלתא G (ΔG) על ידי הפחתה הממוצעת של עוצמת תגובה לגירוי Gi (RmGi) מהממוצע של גודל תגובה לגירוי Gs (RmGs) תוך שימוש בנוסחה הבאה:
ΔG = RmGi - RmGs - לחשב את אחוז ההשפעה של פי (Fe) של OPN בתגובה בתיווך-Gi על ידי חלוקת הממוצע של גודל תגובה לגירוי Gi בנוכחות OPN (RmGiOPN) עם הממוצע של עוצמת תגובה לגירוי במערכת העיכול בנוכחות של PBS ( RmGiPBS) תוך שימוש בנוסחה הבאה:
פה = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) - עיין Tתוכל 2 לסווג חולים.
Representative Results
כדאיות תא היו דומות בין כל הדגימות עם ערכים עקביות בטווח של 86 ו96%. לעומת זאת, וריאציות גבוהות נרשמו במספרים סלולריים בין דגימות (לוח 3). של דגימות 32 משמשות, שתיים היו מספר מספיק של תאים ולא סווגו. דוגמא לתוצאות של הסיווג הפונקציונלי בהתאם למידה של חוסר איזון בין Gi ואיתות GS היא הראתה באיור 3. הציר האנכי של נתון זה הוא מחולק לשלושה חלקים המגדיר את הקבוצות פונקציונליות עם טווחים דינמיים הוקמו כ> +10 לFG3, בין +10 ו-10 לFG2, ולבסוף <ל-10 FG1. בקרב 30 חולים שנבדקו כאן, 14, 6, ו -5 חולים סווגו באופן ברור לFG3, FG2, וFG1, בהתאמה, ואילו חמישה חולים, בעיקר 345, 353, 370, 371, ו382, היו בקו הגבול של טווחים. ההערכה של השפעת OPN בתגובה לגירוי Gi גילתה כי OPN הגדיל את התגובה ברשותtients 353 ו371. לעומת זאת, התגובה הופחתה על ידי יותר מ 50% בחולים 345 ו382 ועל ידי פחות מ 50% במטופל 370 לאחר טיפול rOPN. אז, על פי הקריטריונים לסיווג שלנו (טבלה 2), היינו יכולים לסווג את חולי 353 ו371 בFG1, חולי 345 ו382 בFG2, ו370 מטופל בFG3. במקביל, כל המטופלים הוקרנו על תגובתם לגירוי חלבון Gi ולעומת השליטה נושאים. כצפוי, כל החולים היו מגיבים פחות מאשר לנבדקי ביקורת, וחולים סווגו באותה הקבוצה פונקציונלית על ידי הנוהל החדש שלנו הציגו רמות דומות של התגובה המרבית (איור 5). יתר על כן, פער בין המטופלים של כל קבוצה תפקודית היה עולה בקנה אחד עם מגוון הקלאסי שלנו של סיווג 12, המאמת את הנוהל החדש שלנו. הסיווג של עוקבה גדולה של חולי scoliotic אחרי באופן קבוע במרפאת המיוחדת שלנו בSainte-Justine החולים גילה כי שלושתקבוצות פונקציונליות חולקו באופן דומה בין מקרים מתונים, בעוד FG2 היה דומיננטי בקרב מקרים חמורים (איור 6), זיהוי חולים מסווגים לקבוצה פונקציונלית זה כמו יותר בסיכון להתקדמות מחלה חמורה של המחלה ומצביע על כך שבדיקת סיווג זה יכול להיות שימושית ב הפרוגנוזה של עקמת אידיופטית.
| פתרון | D-גלוקוז נטול מים | 0.1% |
| CaCl 2 2H 2 O | 0.05 מ"מ | |
| MgCl 2 | 0.98 מ"מ | |
| KCl | 5.4 מ"מ | |
| טריס | 145 מ"מ | |
| פתרון ב ' | NaCl | 140 מ"מ |
| תמיסת מלח מאוזנת (BSS) | פתרון | 1 נפח |
| פתרון ב ' | 9 נפח | |
| RPMI-1640 | 500 מיליליטר | |
| אנטיביוטיקה antimycotic | 1% | |
| FBS | 10% | |
| תקשורת משלימה | RPMI-1640 | 50 מיליליטר |
| אנטיביוטיקה antimycotic | 1% | |
| FBS | 40% | |
| תקשורת הקפאה | RPMI-1640 | 50 מיליליטר |
| אנטיביוטיקה antimycotic | 1% | |
| FBS | 40% | |
| DMSO | 20% | |
| תקשורת PHA | RPMI-1640 | 500 מיליליטר |
| אנטיביוטיקה antimycotic | 1% | |
| FBS | 10% | |
| Phytohemaglutinin | 1% |
טבלת 1. חיוניתפתרונות.
| טווחים דינמיים עם ΔG | קבוצות פונקציונליות | טווחים דינמיים עם פה |
| ΔG <-10 | FG1 | פה> 100% |
| -10 <ΔG <+10 | FG2 | פה <50% |
| ΔG> +10 | FG3 | 50% <פה <95% |
טבלה 2. קטגוריזציה של קבוצות פונקציונליות על פי טווחים דינמיים שהוקמו עם ΔG ופה.
| חולים | כדאיות (%) | ריכוז תא (× 10 6 / מיליליטר) | תגובות |
| 343 | 88.7 | 11.64 | |
| 344 | 90.5 | 13.6 | |
| 345 | 94.4 | 8.54 | |
| 346 | 94.3 | 25.79 | |
| 347 | 94.2 | 27.36 | |
| 348 | 94.6 | 8.52 | |
| 349 | 91.2 | 0.82 | מספר מספק של תאים |
| 350 | 90.3 | 8.92 | |
| 352 | 92.6 | 8.28 | |
| 353 | 91.3 | 12.75 | |
| 354 | 86.9 | 7.62 | |
| 355 | 91.2 | 7.51 | |
| 356 | 90.3 | 9.36 | |
| 358 | 95.1 | 16.94 | |
| 359 | 92.3 | 13.89 | |
| 360 | 89.4 | 7.67 | |
| 361 | 93.5 | 7.84 | |
| 365 | 86.5 | 2.2 | מספר מספק של תאים |
| 368 | 92.6 | 15.69 | |
| 369 | 93.4 | 10.9 | |
| 370 | 92.5 | 19.93 | |
| 371 | 88.8 | 10.68 | |
| 374 | 93.9 | 16.86 | |
| 376 | 92.9 | 15.67 | |
| 377 | 93.1 | 9.99 | |
| 378 | 93.6 | 13.57 | |
| 379 </ Td> | 92.6 | 19.86 | |
| 380 | 91.1 | 8.46 | |
| 381 | 93.9 | 14.82 | |
| 382 | 92.1 | 23.06 | |
| 383 | 92.9 | 11.82 | |
| 384 | 89.1 | 7.73 |
לוח 3. כדאיות אחוזים וריכוז תא כפי שנקבע באמצעות מונה תא אוטומטי ומנתח כדאיות.
איור 1. עיצוב לזריעת תאים.
איור 2.עיצוב עבור מחלק תרכובות.
איור 3. טווח דינמי של הסיווג הפונקציונלי באמצעות המערכת מבוססת ה-CDS. גרף ממחיש ערכים של מידת חוסר איזון בין התגובות לGi וגירוי Gs הושג בPBMCs מחולים עם עקמת אידיופטית. ערכים נמדדו על ידי המערכת מבוססת ה-CDS בתגובה ל10 מיקרומטר של סומטוסטטין וisoproterenol. כל נקודה מייצגת את ΔG של שני התגובות בשני עותקים.
איור 4. השפעת rOPN בתגובה לגירוי Gi בPBMCs. תאים היו סרום רעב ל18 שעות בנוכחותו או היעדריו של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר rOPN ולאחר מכן מגורה עם 10 56; M של סומטוסטטין ליזום תגובה תאית בתיווך-Gi. הנתונים בגרף נוצרו מעכבה מרבי המינימום ומתאים לממוצע של תגובה בשני עותקים.
איור 5. מצב תפקודי של חלבון Gi בPBMCs משליטה ונושאי scoliostic. PBMCs מנבדקי ביקורת וחולי scoliotic נחשפו להגדלת ריכוזים של סומטוסטטין כדי לעורר חלבוני Gi באמצעות קולט סומטוסטטין אנדוגני. התגובה התאית נמדדה על ידי מערכת מבוססת ה-CDS כמתואר בסעיף ההליך. עקומות נוצרו מעכבה מרבי מינימום. כל עקומה מייצגת את רגרסיה ליניארית. הנתונים היו מנורמלים לתגובה מקסימלי בתאים מנבדקי ביקורת וכל נקודה מתאימה לממוצע של תגובה בשני עותקים./ "= היעד" _blank 50768/50768fig5large.jpg "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 6. הפצה של קבוצות פונקציונליות בין שלבים שונים של עקמת. עוקבה גדולה של חולים עם scoliotic 794 (עקמומיות בין 10-44 °) מתונה ו162 מקרים חמורים (עקמומיות גדולה מ45 °) ואחריו באופן קבוע בSainte-Justine חולים, סווגו על פי המידה של חוסר איזון בין התגובה לGi וGs גירוי. תגובות נמדדו על ידי המערכת מבוססת ה-CDS בתגובה ל10 מיקרומטר של סומטוסטטין וisoproterenol.
Discussion
יש לנו תארנו הליך מפורט של בדיקה מבוססת תאים פרוגנוסטיים לעקמת אידיופטית כי הוא ישים לתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מבודדת טרי או קפוא נשמרת לתקופה של שנה עד אחד בחנקן נוזלי. מאז באמצעות PBMCs מבודדת טרי הוא מסורבל כאשר בודקים מספר גדול של אנשים, ההליך הוצג עם PBMCs הקפואה המציעות חלופה מעשית יותר בהגדרה קלינית. עם זאת, בעיות עם התא clumping על הפשרה היו נתקלו בעת PBMCs הקפואה היו בתחילה בשימוש, מה שמובילה לעתים לשונות בין assay. על מנת למקסם את שחזור assay, אנו ממליצים להימנע ממחזור ההפשרה הקפאה ושימוש במדגם הקפוא רק פעם אחת. ההליך הוא פשוט מאוד, המאפשר זיהוי מדויק של תפקוד חלבון Gi הפגום בזמן קצר. באמצעות הליך זה, ניתן לסווג ילדים אסימפטומטיים וscoliotic קלות לנבא התוצאה הקלינית שלהם טובים יותר ללא סכנה כלשהי לבריאותם. הוwever, בעת ביצוע סיווג על פי מידת התגובה המרבית לGi גירוי ביחס לנבדקים בריאים 12, כמה דרישות לנבדקי ביקורת צריכה להיות נפגשו. ואכן, כדי שתהיה לי עוקבה השוואה ראויה, נושאי השליטה חייבים להיות גיל ומין מתאים, לא יהיו על כל סוג של טיפול תרופתי, ולספק מידע אישי, כגון היסטוריה בעבר בודדת / משפחתית רפואית. דרישות אלה עלולות להוות מכשול חשוב לגיוס של נבדקי ביקורת. לכן, ביצוע סיווג על ידי בחינת המידה של חוסר איזון בין התגובה לגירוי חלבון Gi ו-G באותו האדם הוא אידיאלי כדי לחסל את הצורך בשימוש בקבוצת בקרה.
השימוש במערכת מבוססת CDS לבצע בדיקה פרוגנוסטיים זה הוא משמעותי במונחים של בו זמנית לספק Gi-ותגובות הסלולר בתיווך-GS באותו assay. למרות שניתן לסווג חולים רבים ללא ambiguity באמצעות הטווח הדינמי קבוע עבור assay זה, מספר קטן של חולים יפגין ערכים בגבול של טווחים, כפי שמדגים את התוצאות של הדו"ח הנוכחי. להפלות אנשים אלה, יש לנו הציגו ההערכה של ההשפעה של OPN בתגובה לגירוי Gi ידי הוכחת כי OPN גורם השפעת ההפרש על תגובה תאית בתיווך-Gi בין שלוש הקבוצות פונקציונליות. ואכן, מצאנו כי בנוכחותו של OPN, בתגובה לעליות גירוי Gi בFG1, תוך שהוא מקטין בFG2 וFG3, בFG2 מידה גבוהה יותר. למרות העלות הגבוהה של OPN, שימוש הכמוקין חיוני להבחין מקרים מעורפלים, ולכן לשפר את הדיוק של assay הסיווג שלנו. עם זאת, יש assay זה חסרון שבמינימום של 1.5 x 10 5 תאים לכל גם נדרש להתבונן תגובה תאית עם המערכת מבוססת ה-CDS בתנאי הניסוי שלנו. דגימות מטופל מסוימות לא תהיה לי מספר מספיק שלתאים להיבדק. במקרה זה, יש צורך לזכור את החולים עבור איסוף דם נוסף, שיכול להיות מדאיג עבור משפחות ומתסכלות עבור צוות הרפואי ומעבדה. מחקרים פרוספקטיביים מתוכננים במעבדה שלנו כדי לטפל בבעיה זו.
עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי מסתמך על שיטות פשוטות ומוכחות להכנת תאים ואילו הבדיקות מתבצעות באופן אוטומטי באמצעות מערכת תוקף ללא תווית 13, 14 לעקוב אחר תגובותיהם של התאים. פלטפורמת הבדיקות היא זולה יחסית בהשוואה לפלטפורמה גנטית זמינה עבור הפרוגנוזה של מחלות אחרות. כמו כן, העלות של כל החומרים חד פעמים, כוללים צינורות איסוף דם, טיפים, האלקטרודה המיוחדת microplates, וחרוטים וצינורות Eppendorf, היא לא יקרה מאוד ונאמדה בפחות מ -3,000 דולרים כדי להשלים בדיקות לכאלף חולים. למרות הערכה זו אינה כוללת את עלויות עבודה להכנת דגימותומבצע את הבדיקה, בדיקה זו נשארה הרבה יותר זול מאשר פלטפורמות הדור הבא של רצף. ראויים לציון, הוא השוואת העלות לא רק לפלטפורמות גנטיות, אבל באופן ספציפי יותר הקשורים לתחום של AIS, הוא העלויות הכרוכות להדמיה רדיולוגית. היום, יותר ממיליון ילדים בארה"ב וכ -100,000 ילדים בקנדה מאובחנים עם עקמת אידיופטית, והעלות הכוללת של אבחון וניטור של ילדי scoliotic ידי חשיפת רנטגן היא מעל 2.5 מליארד דולרים בשנה בצפון אמריקה. לפיכך, הליך assay מבוסס התאים שלנו יהיה צפוי להיות מתאים להקרנה ומעקב אחר ילדים עם עקמת אידיופטית ללא סיכון בריאותי ובעלות נמוכה יותר שיגרתי.
Disclosures
עבודה זו הובילה למספר פטנטים להחזיק ידי Sainte-Justine חולים האוניברסיטאי ועוד רבים אחרים תלויות ועומדת במספר מדינות. הממד הרביעי השדרה LLC הוא בעל הרישיון הבלעדי של Sainte-Justine חולים האוניברסיטאי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ La Fondation איב Cotrel de l'Institut de France, פריז, צרפת (לד"ר מורו), המכון הקנדי לחקר בריאות (מענק PP2-99,466 לד"ר מורו) ומהממד הרביעי השדרה LLC , ניו יורק, ארה"ב (מענק מחקר לד"ר מורו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
| FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
| Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
| Somatostatin | Tocris | 1157 | |
| Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
| PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
| Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
| Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
| 50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
| Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
| Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
| Equipment | |||
| Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
| Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
| Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
| Water bath | VWR International | 89032-204 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
| Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
| Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |
References
- Kane, W. J. Prevalence: a call for a statement of terms. Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).
- Bunnell, W. P. Selective screening for scoliosis. Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).
- Asher, M. A., Burton, D. C. Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects. Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).
- Fong, D. Y., et al. A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening. Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).
- Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer? Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).
- Kim, H., et al. Scoliosis imaging: what radiologists should know. Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).
- Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program. Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).
- Nachemson, A. A long term follow-up study of non-treated scoliosis. Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).
- Enneking, W. F., Harrington, P. Pathological changes in scoliosis. J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).
- Miller, N. H. Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis. Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).
- Nash, C. L. Jr, Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis. J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).
- Akoume, M. Y., et al. Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy. Spine. 35 (13), 601-608 (2010).
- Verdonk, E., et al. Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors. Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).
- Peters, M. F., et al. Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs. J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).
- Peters, M. F., Scott, C. W. Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity. J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).
- Akoume, M. Y., et al. Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis. J. Clin. Invest. , Submitted (2013).
