Ett strukturerat protokoll presenteras för en cellbaserad analys som ett funktionstest för att förutsäga prognosen för idiopatisk skolios med hjälp av cellulära dielektrisk spektroskopi (CDS). Analysen kan utföras med färska eller frysta perifera mononukleära blodceller (PBMC) och förfarandet är avslutat inom 4 dagar.
Detta protokoll detaljer den experimentella och analysförfarandet för en cellbaserad analys som utvecklats i vårt laboratorium som ett funktionstest för att förutsäga prognosen för idiopatisk skolios i asymtomatiska och drabbade barn. Analysen innebär en bedömning av den funktionella statusen för Gi och Gs proteiner i perifera mononukleära blodceller (PBMC) genom cellulära dielektrisk spektroskopi (CDS), med hjälp av en automatiserad CDS baserat instrument, och klassificeringen av barn i tre funktionella grupper (FG1 , FG2, FG3) med avseende på profilen av obalans mellan graden av respons på Gi och Gs proteiner stimulans. Klassificeringen bekräftas ytterligare av den differentiella effekten av osteopontin (OPN) om svar på Gi stimulering bland grupper och allvarlig progressiv sjukdom refereras av FG2. Ungefär, är en volym av 10 ml blod krävs för att utvinna PBMC genom Ficoll-gradienten och cellerna lagras därefter i flytande kväve. Det tillräckligt antal PBMCs för att utföra analysen erhålls efter två dagar av cellodling. I huvudsak är celler först inkuberas med phytohemmaglutinin (PHA). Efter 24 h inkubation ersattes mediet av ett PHA fritt odlingsmedium under ytterligare 24 h före cellsådd och OPN behandling. Celler sedan spektroskopiskt screenas för deras svar på somatostatin och isoproterenol, som respektive aktiverar Gi och Gs proteiner genom deras besläktade receptorer. Både somatostatin och isoproterenol samtidigt injiceras med ett integrerat flödessystemet och cellernas svar övervakas i 15 min. Analysen kan utföras med färska eller frysta PBMC och förfarandet är avslutat inom 4 dagar.
Idiopatisk skolios är en ryggrad missbildning av okänd orsak definieras i allmänhet som en lateral krökning är större än 10 grader tillsammans med en vertebral rotation 1. Villkoret drabbar 4% av den pediatriska populationen och är oftast diagnostiseras i åldrarna 9 till 13 år 2,3,4. Diagnosen är främst av utslagning och görs först efter att utesluta andra orsaker till spinal missbildning såsom vertebral missbildning, neuromuskulära eller syndrom störningar. Traditionellt är det trunkal asymmetri avslöjades av Adams framåt böjningsprovning och mäts med scoliometer under fysisk undersökning 5. Diagnosen kan därefter bekräftas genom röntgenobservation av kurvan och vinkelmätningen med användning av Cobb-metoden 6.
När väl diagnosen, är det primära målet för läkare att hantera skolios barn om kurvan kommer att utvecklas. I själva verket är kurvan progression ofta oförutsägbara ochär mer frekvent bland flickor än hos pojkar 7. Om den inte behandlas kan den kurvan utvecklas dramatiskt, skapa betydande fysisk deformitet och till och med hjärt-problem. Dessa manifestationer bli livshotande när kurvan överstiger 70 ° 8,9. De nuvarande behandlingsalternativ för att förhindra eller stoppa kurvan progression innefattar stagning och kirurgi. I allmänhet är bracing rekommenderas för kurvor mellan 25-40 °, och kirurgi är reserverad för kurvor som är större än 45 ° eller inte svarar på stagning.
Ungefär 10% av barn med diagnosen idiopatisk skolios har kurvan progression kräver korrigerande operation 10. För närvarande finns det ingen beprövad metod eller test tillgängliga för att identifiera denna typ av patienter. Följaktligen är alla diagnostiserade barn som utsatts för flera röntgenbilder över flera år, oftast tills de når skelett mognad. Det uppskattas att den typiska patienter med skolios harcirka 22 röntgenundersökningar under en 3-årsperiod 11. På grund av den potentiella risken för flera röntgenundersökningar, de alternativa metoder som kan ge utföra prognosen av idiopatisk skolios utan att utsätta barn för joniserande strålning är starkt önskvärt. Med avsikt att tillgodose detta behov, har vi tidigare tagit fram en cellbaserad screening-analys som ett prognostiskt test för att snabbare identifiera de asymtomatiska barn som riskerar att utveckla idiopatisk skolios. Testet förutsäger kliniska resultat i såväl asymtomatiska och drabbade barn genom att undersöka den funktionella status Gi proteiner och klassificera barnen in i tre funktionella grupper (FG1, FG2 och FG3) beroende på graden av maximal respons på Gi protein stimulering 12 mätt med CDS baserat system. Detta system används i stor utsträckning för att bedöma signalöverföring via G-proteiner i olika celltyper 13,14,15,16. Det ger information omtotal integrerad cellernas respons till externa stimuli genom att mäta förändringar i impedans till följd av aktivering av cellytreceptorer. Celler sås i mikroplattor som innehåller elektroderna i botten av brunnarna och systemet tillämpar en liten spänning att inducera extracellulära och transcellulära strömmar. Följande förening injektion i brunnen, är receptorer på cellens yta stimuleras och signaltransduktionshändelser inträffar, vilket leder till cellförändringar som påverkar flödet av extracellulära och transcellulär strömmar, och därmed påverka den uppmätta storleken. Med denna metod, de skoliospatienter och barn större risk att utveckla skolios är mindre känsliga för Gi protein stimulering jämfört med friska kontrollpersoner, och klassificeringen bygger på den procentuella graden av minskning i förhållande till kontrollgruppen. De klassificerings intervallen är fasta mellan 10 och 40% för FG3, 40 och 60% för FG2, och 60 och 90% för FG1 12.
<p class = "jove_content"> På senare tid har vi modifierat denna metod genom att visa att de tre funktionella grupper tydligt kan urskiljas enligt profilen av obalans mellan svar på Gi och Gs stimulering. I själva verket fann vi att svar på Gi stimulering dominerade i FG3, medan någon uppenbar obalans observerades i FG2. Däremot FG1 uppvisade dominans för svar på Gs stimulering. Dessutom har vi gett belägg för att patienter som tillhör FG2 löper större risk att utvecklas till den grad att behöva operation 17. Precisionen av denna klassificering test har ytterligare förbättrats genom att visa en differentiell effekt osteopontin (OPN) om svar på Gi stimulering bland funktionella grupper.Här dokumenterar vi de detaljerade stegen av experimentella och analytiska förfarandena i denna funktionstest som för närvarande utförs i vårt laboratorium.
Vi har beskrivit ett detaljerat förfarande för en cellbaserad prognostiska test för idiopatisk skolios som gäller för perifera mononukleära blodceller (PBMC) nyligen isolerade eller bevaras fryst i upp till ett år i flytande kväve. Sedan använder nyligen isolerade PBMC är besvärligt när man testar stort antal individer, var proceduren presenteras med frysta PBMC som erbjuder ett mer praktiskt alternativ i klinisk miljö. Emellertid var problem med cellklumpning vid upptining stött när frysta PBMC ursprungligen användes, leder ibland till inter-assay variabilitet. För att maximera analys reproducerbarhet, rekommenderar vi att undvika frys-tö cykel och använda den frysta prov endast en gång. Proceduren är mycket enkel, vilket möjliggör exakt upptäckt av defekt Gi proteiners funktion på kort tid. Med hjälp av denna procedur, kan asymtomatiska och skolios barn lätt klassificeras att bättre förutsäga deras kliniskt resultat utan någon fara för deras hälsa. HoWever, när du utför klassificering enligt graden av maximal respons på Gi stimulering jämfört med friska kontrollpersoner 12, flera krav för kontrollpersoner bör uppfyllas. Ja, för att få en korrekt jämförelse kohort måste kontrollpersoner vara ålder och kön matchade, inte på någon form av medicinering, och ge privat information, till exempel tidigare individ / familjär sjukdomshistoria. Dessa krav kan utgöra ett stort hinder för rekrytering av kontrollpersoner. Därför utför klassificering genom att undersöka graden av obalans mellan svar på Gi och Gs-protein stimulans i samma individ är idealisk för att eliminera behovet av att använda kontrollpersoner.
Användningen av CDS-baserat system för att utföra denna prognostiskt test är betydande i fråga om att samtidigt skapa Gi-och Gs-medierade cellulära svar i samma analys. Trots att många patienter kan klassificeras utan ambiguity användning av det dynamiska området som fastställts för denna analys, kommer ett litet antal patienter uppvisar värden vid gränslinjen för intervall, såsom visas av resultaten i föreliggande rapport. För att skilja dessa individer, har vi infört utvärderingen av effekten av OPN på svar på Gi stimulering genom att visa att OPN inducerar en differentiell effekt på Gi-medierad cellulär respons bland de tre funktionella grupper. I själva verket fann vi att i närvaro av OPN, svar på Gi stimulering ökningar FG1, medan den minskar i FG2 och FG3, i högre utsträckning i FG2. Trots de höga kostnaderna för OPN är viktigt att använda denna chemokine att skilja tvetydiga fall, och därmed förbättra noggrannheten i vår klassificering analys. Emellertid har denna analys en nackdel i att ett minimum av 1,5 x 10 5 celler per brunn krävs för att observera cellulära svaret med CDS-baserat system under våra experimentella betingelser. Vissa patientprover kommer inte att ha tillräckligt mångaceller som skall testas. I detta fall är det nödvändigt att erinra om de patienter för ytterligare blodinsamling, vilket kan vara oroande för familjer och frustrerande för den medicinska och laboratoriepersonal. Blivande studier planeras i vårt laboratorium för att behandla denna fråga.
Ändå bygger det nuvarande protokollet på enkla och beprövade metoder för att förbereda celler medan testning automatiseras med hjälp av en validerad etikett fritt system 13, 14 för att övervaka cellernas svar. Testningen plattform är relativt billigt jämfört med genetisk plattform tillgänglig för prognosen av andra sjukdomar. Även kostnaden för allt engångsmaterial, inklusive blodprovsrör, tips, den speciella elektrodmikroplattor, och koniska och Eppendorf-rör, är inte särskilt dyrt och beräknas till mindre än $ 3000 för att slutföra ett test för cirka tusen patienter. Även om denna uppskattning inkluderar inte arbetskostnader för beredning av proveroch utför testet, förblir detta test betydligt billigare än nästa generations sekvenseringsplattformar. Anmärkningsvärt, inte bara jämfört med kostnaden för genetiska plattformar, men mer specifikt relaterade till området för AIS, är kostnader i samband med radiologisk avbildning. Idag är mer än en miljon barn i USA och omkring 100.000 barn i Kanada diagnosen idiopatisk skolios, och den totala kostnaden för diagnos och övervakning av de skolios barn genom röntgenexponeringen är över 2,5 miljarder dollar årligen i Nordamerika. Således skulle vår cellbaserade analysförfarandet förväntas vara lämpliga för rutinmässig screening och uppföljning av barn med idiopatisk skolios utan hälsorisk och till lägre kostnad.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, Frankrike (till Dr Moreau), Den kanadensiska Institutes of Health Research (bevilja PP2-99.466 till Dr Moreau) och från Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (forskningsbidrag till Dr Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |