Summary
Inchworming 충분한 톱밥 침구 테스트 케이지에 배치 할 때 BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) 마우스에 표시되는 고도의 반복적 인 동기 파는 움직임이다. 절차는 청소년의 사회적 상호 작용 프로토콜의 변형이며, 자폐증 스펙트럼 장애와 관련된 반복적 인 모터 stereotypies을 평가하기 위해 여기에 사용됩니다.
Abstract
자폐증 스펙트럼 장애 (ASD)는 제한된 관심이 감소 상호 사회적 상호 작용, 통신 이상, 그리고 반복적 인 행동을 특징으로하는 행동으로 정의 된 신경 발달 장애입니다. 진단은 임상 적 기준을 기반으로,이 유형이 다른 장애의 잠재적 관련 설치류 모델이 이상적으로 이러한 다양한 행동 특성을 요점을 되풀이한다. BTBR T + Itpr3의 TF / J (BTBR) 마우스는 증가 손질뿐만 아니라인지 적 경직성과 같은 반복적 인 행동을 표시, ASD의 설립 동물 모델입니다. 사회적 상호 작용과 그 관련하여, 청소년 재생 시험 ASD의 체류 설치류 모델에서 사용되어왔다. 여기, 우리는 BTBR 마우스는 톱밥 침구를 포함하는 청소년의 사회적 상호 작용의 인클로저에서 테스트 할 때, 그들은 반복적 인 동기 파는 동작을 표시 것을 보여준다. 라고 함이 반복적 모터 동작 "inchworming는"지명되었다바닥에 수평으로 이동하면서 마우스에 의해 전시 된 운동의 관념적인 성격 때문이다. Inchworming 마우스는 안쪽과 바깥쪽으로 움직임 하나 하나의 최소 수행, 침구 변위 동기 성에서 자신의 앞과 뒷다리 - 사지를 사용해야합니다. BTBR 및 C56BL/6J (B6) 마우스 모두가이 문제를 전시하지만, BTBR 마우스는 상당히 높은 지속 시간 및 주파수 inchworming와 침대 인클로저에 배치하면 inchworming 시작하는 감소 된 대기 시간을 보여줍니다. 우리는이 새롭게 설명한 동작이 쉽게 ASD의 동물 모델에서 측정 할 수있는 반복적 인 모터 상동증 (stereotypy)의 측정 값을 제공한다는 결론을 내린다.
Introduction
비정상적인 사회적 상호, 통신 장애, 반복적 인 / 진부한 행동 1 : 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD)의 병태 생리는 불분명 남아 있지만, 진단은 세 가지 증상 범주의 존재에 따라 달라집니다. 대부분의 설치류 모델은 동시에 하나의 동물의 세 가지 증상을 재현 할 수 없습니다. 따라서, 안정적으로 장애의 일부 또는 모든 측면을 시뮬레이션 할 수있는 모델은 효과적인 예방 및 치료 전략의 개발을위한 큰 가치를 개최합니다. ASD의 세 가지 측면을 표시하지 한 모델은 BTBR 마우스 1,2입니다.
초음파 발성 및 사회적 접근 분석법과 함께, 청소년 사회적 상호 작용 시험은 일반적 소아 ASD의 마우스 모델을 특성화하기 위해 사용된다; 이러한 테스트의 측정은 ASD의 핵심 기능을 나타내는 비정상적인 사회적 행동을 감소. 청소년 사회적 상호 작용 시험뿐만 아니라, 다른 많은테스트는 ASD의 동물 모델에서 관념적인 행동을 측정하는 데 사용되었다. 예를 들어, 객체를 덮도록 노력 둥 앞발을 이용 침구 물질을 치환하는 동물의 경향을 조사 대리석 매몰 시험, 혐오 자극 3,4에 응답하여 발생할 강박 관념적인 행동을 측정하는 것으로 생각된다. 따라서, 파고 테스트는 ASD의 동물 모델 및 설치류 3,5-7의 다른 종에서이 반복적 인 동작을 정량화하기 위해 구현되었다. 파는 행동은 주둥이 또는 침구 재료를 치환하는 발 명백한 지시 행동으로 정의하고 반복적 인 모터 동작 (4)의 중요한 매개 변수로 가정되었다.
여기에서, 우리는 우리가 생쥐의 BTBR 변형에 "inchworming을,"라고 한 파고의 새로운 유형을보고합니다. 이 신규의 동작 특성은 또한 발에 사용될 수있다 반복적 모터 동작의 강력 측정을 제공 할 수있다이러한 ASD, 헌팅턴 병 또는 강박 행동 8,9와 같은 설치류 모델 idation. 우리는 안쪽으로 침구 소재의 변위에 이르게 바깥쪽으로 동기 움직임에 따라 앞과 뒷다리 - 사지의 적어도 하나의 동기 운동으로 "inchworming"를 정의합니다. 이것은 여러 가지 방법으로 일반 굴삭 동작과 다릅니다. 우선, 통상 동작 inchworming 오히려 단일 절연 된 이벤트보다 에피소드의 조합으로서 관찰된다. 반면, 파고는 뒷다리 또는 앞 발 3 하나의 단일 조정 운동으로 발생할 수 있습니다. 또, inchworming 운동 동작을 파고 특징적인 정지 위치에 반대 격납 바닥에 수평으로 발생하는 경향이있다. 전형적인 파는 행동은 쥐의 B6와 BTBR 변종에 공통되는 반면, 마지막으로, 아래에 설명 된 inchworming 동작은 마우스의 BTBR 근친 변형에 자주 발생하지만 드물게 B6 제어 변형에서 확인되지 않습니다
대리석 묘지, 파고 및 청소년 놀이 ASD의 마우스 모델에서 비정상적인 행동을 측정 값을 설정 한 것을 감안할 때, inchworming 동작은 관념적인 행동이 이전에 정의 된 측정을 보완합니다. 특히, inchworming 동작은 일반적으로 ASD 8,11에서 확인되는 낮은 순서 모터 stereotypies의 유용한 측정을 제공합니다. 또,이 새로운 inchworming 절차는 ASD 같은 발달 장애와 관련된 반복적 인 모터 동작의 분석을위한 유용한 도구가 추가로 연구를 제공 할 수있다.
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Protocol
모든 절차는 캐나다의 동물 보호위원회에 따라 실시 캘거리 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 동물 준비
- (12 시간) 시험을하기 전에 밤새 쥐를 격리합니다. 이 작업을 수행하기 위해 자체 테스트 전날까지 우리에서 실험 분석에 필요한 BTBR의 모든 및 B6 생쥐 (P35-P40)를 배치합니다.
- 동물이 새로운 환경에 길들 수 있도록 시험을하기 전에 행동 분석 방 30 분에 고립 된 마우스를 놓습니다.
2. 장비 준비
- 30 X 30cm의 유리 야 시험장에서 이동식 뚜껑을 상자에 넣습니다. 상자를 테이블 위에 올려 놓고 바닥에서 45도 각도로 비디오 카메라의 위치를; 카메라의이 위치는 외장 마우스의 전체지면의 시각화를 허용합니다. 의 벽에서 반사를 최소화하기 위해 적외선 조명을 사용하여상자.
- 낮은 럭스 환경에서 촬영을 최적화하기 위해 적외선 기능과 높은 줌 기능을 가지고 비디오 카메라를 사용한다. 마우스는 상자 전체에 걸쳐 시각화 수 있도록 이미지를 확대 인클로저에 카메라 초점을 맞 춥니 다.
- 톱밥 침구 (약 1 인치 깊이해야합니다)와 함께 상자의 바닥 전체를 커버.
3 테스트 절차
- 시험 인클로저 내 - 마우스의 내부 변형 쌍 (BTBR 또는 B6-B6 BTBR)를 놓습니다.
- 시험 실내 조명을 끄고.
- 방을 기록하고 종료 비디오 카메라를 시작합니다. 이는 생쥐의 거동에 실험자 영향을 방지 할 것이다. 11 분 동안의 활동을 기록합니다.
- 기록이 완료되면, 검사실를 재 입력하여 원래의 홈 케이지로 돌려 생쥐.
- , 톱밥 침구 폐기 70 % 에탄올로 전체 테스트 상자를 씻어 테스트의 바닥에 새 톱밥 침구를 배치인클로저.
- 내 얼룩 쌍의 나머지 부분에 대한 전체 과정을 반복하고 원래의 홈 케이지에 마우스를 반환합니다.
주 : inchworming 데이터의 신뢰성을 확인하기 위해, 과정은 다른 BTBR-BTBR 및 B6-B6 쌍 조합 일 이후에 반복 될 수있다. 이것은 관찰 된 행동이 격납 특정 상대에 의존하지 않지만 inchworming 개별되도록한다.
4. 데이터 분석
- Inchworming 효과적으로 침구를 치환 한 안쪽하고 공동 발생 이후의 바깥쪽으로 이동을 최소화하여, 동물의 앞과 뒷다리 피트의 동기 안쪽과 바깥쪽으로 이동으로 정의된다. 수동으로 시청하고 10 분 비디오에서 자벌레에 총 지속 시간, 주파수 및 대기 시간을 확인하기 위해 두 번 (한 번 각 마우스의 경우) 각 비디오 점수. 시간, 주파수 및 대기 시간을 inchworming의 수동 득점은 다음에 기초해야정의를 보내고 :
Inchworming 소요 시간은 각 마우스가 inchworming 행동에 종사하는 데 소요 된 총 시간으로 정의된다. inchworming의 이러한 측면의 점수, 시작 및 중지 할 수있는 타이머를 사용합니다. 마우스가 마우스 inchworming을 중지 할 때 타이머를 자벌레 정지하기 시작하면 타이밍을 시작합니다. 마우스가 다시 다시 시작 자벌레 타이머를 다시 중지하기 시작하면하고합니다. 10 분의 관찰 기간마다 마우스에서 inchworms의 기간 동안 타이머의 시작과 정지를 반복합니다. 이 0:00 ~ 10:00 분 사이에 inchworming 기간 점수를 생성합니다.
Inchworming 주파수는 : 마우스 10 분의 관찰 기간 inchworming 동작에 관여하는 횟수로 정의된다. 하나의 카운트 때마다 마우스의 시작과 정지가 inchworming을 수여한다. inchworming 주파수 점수는 0과 ∞ 사이의 숫자가 될 것입니다.
인치 웜에 대기 시간 : 시간 번째로 정의된다에 이전 inchworming의 첫 번째 발병에 전달합니다. 동영상이 시작되면 타이머를 시작이 시간 0시 수 있으며, 타이머를 중지 할 때 처음 마우스에서 inchworms. 마우스가 inchworming 동작을 표시하지 않는 경우 자벌레하는 대기 시간 10:00 될 것입니다. 자벌레하는 대기 시간을 분석 할 때, 0:01 ~ 10:00 분 사이의 점수를 얻을 수있다. 테스트 기간 동안 자벌레 실패 생쥐 결과 inchworming 동작을 표시 쥐 집단과 관련된 보장하기 위해 샘플 모집단에서 제거한다. - 전체 주파수와 비디오의 각 마우스에 inchworming의 기간을 계산합니다. 마우스의 특정 쌍 자벌레하기 위해 대기하는 자벌레 쌍의 첫 번째 마우스에 필요한 시간을 계산한다. 이러한 매개 변수는 마우스 6 반복 파는 행위와 관련된 이전의 방법 론적 작업을 기반으로합니다.
- 평균 기간을 계산, 주파수,및 대기 시간 분석 (B6 대 즉 BTBR) 각 실험 그룹의 파고. ANOVA 또는 변형 / 실험 그룹 사이의 데이터를 비교하는 t-검정을 사용합니다.
참고 : 프로 시저가 두 번째 날에 완료되면, 후속 시험 효과 또는 페어링 효과가 없었는지 확인하기 위해 반복 측정 ANOVA를 사용합니다.
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Representative Results
기재 청소년 재생 시험의 수정 된 버전은 관찰하고 신규 반복적 굴삭 동작 inchworming 칭했다 분석하는데 사용될 수있다. Inchworming는 B6 컨트롤보다 BTBR 마우스에 의해 훨씬 더 큰 범위에 전시된다. 전형적인 10 분 세션에서 BTBR 마우스는 약 5 분, 또는 관찰 기간의 절반 (톱밥 침구을 치환하기위한 노력의 일환으로 발의 동기 안쪽과 바깥쪽으로 움직임) 별개의 inchworming 동작을 표시합니다. 또한, 자벌레하는 대기 시간이 BTBR 마우스의 경우 상당히 짧은 - 그들은 일반적으로 기록 된 세션의 시작의 처음 10 초 내에 inchworming 시작합니다. 반면, 대조군 마우스 (B6)는 4 분의 인치 웜에 평균 대기 시간이 실제로 동작을 표시하는 자신의 시간의 아주 작은 부분을 보낸다. 이러한 연구 결과는 설치류 3,6 반복적 파는 행위에 대한 이전 연구에서 데이터와 유사하다.
FigurE 1은 테스트 절차에 대해 설정 적절한 실험이. 2 BTBR 마우스 및 제어 B6 변형에 자벌레하는 평균 inchworming 기간 (A), 주파수 (B)과 대기 시간 (C)를 보여줍니다 보여줍니다. 모든 매개 변수는 변종 사이에 유의 한 차이가 있었다. 여기에보고 된 실험에서, inchworming 시험은 두 번째 날에 다른 짝으로, 2 일 시험 기간 동안 투여하고, 매일의 결과를 비교 하였다. 유의 한 차이가 이렇게 효과가 특정 마우스 페어링 또는 시험의 반복 하나에 의존하지 있다고 보장을 찾을 수 없습니다. 마지막으로, 그림 3은 inchworming 문제의 두 가지 기본 구성 요소에 종사하는 다른 생쥐의 스틸 사진이 포함되어 있습니다.
그림 1. 장비 inchworming 실험에 대해 설정합니다. inchworming 실험에 대해 설정 장비. 30cm 큐브 플렉시 유리 상자는 45 ° 각도로 배치 된 적외선 줌 카메라의 앞 테이블에 설정되어 있습니다. 인클로저의 바닥은 톱밥 최소 1 인치의 짝수 층으로 완전히 덮여있다.
그림 2. 평균 inchworming 기간, 주파수, 지연 BTBR 및 B6 생쥐 쌍으로 표시됩니다. BTBR (N = 8)와 B6 (N = 8) 마우스는 두 일 테스트 기간 동안 P35-P40에 테스트 inchworming 득점했다 동작.) BTBR 균주 B6 제어 균주보다 inchworming의 상당히 긴 기간은 평균 (P <0.001). B) BTBR 마우스는 signific 표시를 표시B6 컨트롤 (P <0.001)에 비해 inchworming의 antly 높은 주파수. C)는이 BTBR에 유의 한 차이가 있었다 (N = 8)와 B6 (N = 7) 대기 BTBR은 시간이 눈에 띄게 감소를 표시와 함께 발굴에 B6 컨트롤 (p = 0.001)에 비해 동작을 표시했다.
하판은 inchworming 동작의 수축 단계에서 마우스의 예 반면도 3. inchworming 동작의 양쪽 측면에있는 다른 생쥐의 예시적인 표현. 상판은 inchworming 동작의 연장 상에있는 쥐의 예입니다 . Inchworming은 앞의 내적 동기 및 동기 바깥쪽으로 이동으로 정의하고 침대의 위치를 변경하기 위해 마우스의 사지를 뒷다리됩니다.
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Discussion
Inchworming하는 등 ASD로 stereotypies을 나타내는 많은 질환을 연구하는 데 사용할 수있는 반복적 인 행동의 새로운 척도이다. 수정 된 청소년의 사회적 상호 작용 프로토콜에서 신뢰할 수있는 inchworming 데이터를 생성에 매우 중요하다 4 단계가 있습니다 : 1) 확장 격리 기간은 inchworming 시험에 필수적이며, 프로토콜에서 제거하거나 단축 할 수 없습니다. 이 요구 사항은 여기에 설명 쌍으로 inchworming의 테스트에 고유합니다. 2) 비디오 카메라를 적절하게 위치되고 마우스는 완전히 전체 플렉시 격납 통하여 가시화 될 수 있도록 주력 할 필요가있다. 3) 인클로저는 철저하게 현재의 행동이 마우스의 사전 쌍의 냄새에 의해 영향을받지 않도록 시험의 쌍 사이에 청소해야합니다. 4) 인클로저의 침구 소재가 충분해야합니다 (~ 1 인치 깊이)과 톱밥해야합니다; 마우스는 작은 /없는 침구하거나 inchworming 동작을 표시하지 않습니다다른 침구 소재에 배치.
여기에 설명하는 것은 아니지만, 우리는 유사한 베드 인클로저에 혼자 (오히려 쌍 이상) 배치 비 절연, 사회적으로 수용 BTBR 마우스에 inchworming 행동을 관찰했다. 이러한 조건 하에서, BTBR 마우스는 여전히 자벌레 있지만 낮은 주파수 및 지속 시간에 따라서 inchworming 동작 가능성 사회 불안 (데이터 미도시)에 의해 유도 된 진부한 동작임을 나타낸다. 그러나, 연구는 확실하게 BTBR 및 B6 제어 생쥐 사이에 불안의 차이를 입증하지 못한 점을 감안, 불안 가능성이 동작 (12)을 유도하는 다른 요소와 상호 작용합니다. 이 BTBR와 B6 생쥐 사이의 극적인 차이, 신속하고 안정적으로 동작을 이끌어 때문에,이 방법 론적 문서의 초점은 청소년의 사회적 상호 작용 프로토콜에 대한 표준화 된 수정했다. 또, 데이터는 이와에게 알려 증가 단일 세션에서이 동물로부터 수집ATION 각 시험 기간에서 얻었다. 우리의 실험실에서 inchworming 동작은 P35-P55의 연령 범위에서 확인되었다. 이 마우스는 젊은 세 이상이 반복적 인 동작을 표시 할 가능성이 있지만, 다른 연령대에 inchworming 확인하지 않으면 동작이 청소년과 젊은 성인 쥐에 특정 나타낼 수 있습니다.
이 실험의 데이터는 BTBR 마우스의 변형이 더 자주 그리고 B6의 컨트롤보다 더 긴 기간을 위해, 더 빠르게 반복 inchworming 행동에 종사하는 것을 명확하게 나타냅니다. inchworming 동작은 따라서 반복적 인 다른 ASD의 행동과 질병 모델의 새로운 측정 연구자를 제공 할 수 있습니다. 그것은이 반복 파고 모션 원동력 아직 명확하지 않지만, BTBR 마우스는 자기 미용 및 사회적 회피 1, 9의 높은 수준을 표시합니다. 파고는 생쥐의 타고난 유전자 조절의 특성이므로, inchworming 행동의 테스트는 B 수전자는 다른 균주에 쉽게 적용 및 기타 질병 모델에 모터 stereotypies와 강박 행동을 평가하기위한 유용한 도구가 될 수있는 잠재력이있다.
ASD의 특성을 특징 행동 특성 중 하나는 제한된 이익 9 반복적 인 동작입니다. 귀중한 모터 상동증 (stereotypy)을 강조하는 이외에,이 실험은 ASD 환자 모터 stereotypies의 임상 양상과 유사한 추가적인 반복 동작을 보여줌으로써 ASD의 BTBR 마우스 모델의 타당성을 증가했다. 동작은 B6 생쥐에서 비교적 드물지만 Inchworming는 BTBR (ASD) 마우스와 B6 제어 마우스 모두에 표시됩니다. 가장 가까운 inchworming 유사한 동작은 설치류의 행동을 파고있다. 토마스 등. 4 설치류, 파고는 식품 저장, 포식자 회피하고 혐오 환경으로부터의 보호 등의 다양한 기능을 제공하는 것이 좋습니다. 이러한 기능은 NEC 없습니다으로essary 실험실 환경에서, 파고 행동의 높은 수준을 표시 마우스는 강박 행동이 필요 4를 충족 할 수있다. 또한, 실버 등. 9 파고 행동이 아닌 사회 활동의 척도로서 청소년의 사회적 상호 작용 시험의 분석에 포함되어야 함을 시사한다.
요약하면, inchworming는 B6 마우스 (제어 주)에 비해 BTBR 쥐에서 유의하게 더 널리 높은 반복 행동 (ASD의 모델)입니다. 행동의 원인은 알 수 있지만, 그것은 많은 질병의 설치류 모델에서 compulsivity 및 반복 검사 연구원을위한 귀중한 자원이 될 수있다. 절차 적 기술은 단순하며, 24 시간의 기간에 쉽게 완료 될 수있다. 데이터 분석은 더 복잡하고 시간 소모적이지만, 테스트 절차를 녹화 영상은 연구자가 오프 - 라인 분석을 완료하기 위해 반복적 자간 일관성을 보장 할 수 있으며신뢰성.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 로즈 토비아스, 영희 안, 데이비드 N. 러스킨에서 제공하는 기술 및 물류 지원과 전문 지식에 대한 감사드립니다. 여기에 설명 된 작품은 알버타 어린이 병원 재단과 알버타 아동 병원 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
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