Summary
Inchworming är en mycket repetitiva synkron grävande rörelse visas av BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR)-möss när det placeras i ett test bur med tillräcklig sågspån sängar. Förfarandet är en modifiering av juvenil social interaktion protokoll och används här för att bedöma repetitiva motoriska stereotypier relevanta för autism.
Abstract
Autism Spectrum Disorder (ASD) är en beteendemässigt definierad neurologisk sjukdom som kännetecknas av minskad ömsesidig social interaktion, avvikande kommunikation och repetitiva beteenden med begränsad ränta. Eftersom diagnosen baseras på kliniska kriterier, bör alla potentiellt relevanta gnagare modeller av denna heterogena sjukdom idealt rekapitulera dessa olika beteendemönster. Den BTBR T + Itpr3 tf / J (BTBR) musen är en etablerad djurmodell av ASD, visar repetitiva beteenden såsom ökad grooming, samt kognitiv stelbenthet. När det gäller social interaktion och intresse, har ungdomsspeltestet varit anställd i flera gnagarmodeller av ASD. Här visar vi att när BTBR möss testas i en juvenil social interaktion kapsling innehållande sågspån strö, uppvisar de en repetitiv synkron grävande rörelse. Denna repetitiva motorik, kallad "inchworming," hettepå grund av den stereotypa arten av de rörelser som uppvisas av mössen medan den rör sig horisontellt tvärs över golvet. Inchworming möss måste använda sina fram-och hind-lemmar synkront förskjuta strö, utföra minst en inåt och en utåt rörelse. Även om både BTBR och C56BL/6J (B6) möss uppvisar detta beteende, BTBR möss visar en signifikant högre varaktighet och frekvens inchworming och en minskad latens för att initiera inchworming när den placeras i en bedded kapsling. Vi drar slutsatsen att denna nyligen beskrivna beteendet ger ett mått på en repetitiv motor stereotypi som enkelt kan mätas i djurmodeller av ASD.
Introduction
Även om patofysiologin för autismspektrumstörningar (ASD) är fortfarande oklart, diagnos beror på närvaron av tre breda kategorier symptom: onormal social ömsesidighet, försämringar i kommunikation och repetitiva / stereotypa beteenden 1. De flesta gnagarmodeller inte att samtidigt återge alla tre symptom hos ett enskilt djur. Således, modeller som på ett tillförlitligt sätt kan simulera vissa eller alla aspekter av sjukdomen håller stort värde för utvecklingen av effektiva preventiva och terapeutiska strategier. En modell som inte visar alla tre aspekter av ASD är BTBR musen 1,2.
I kombination med ultraljud läten och sociala förhållningssätt analyser, är den juvenile social interaktion test som ofta används för att karakterisera musmodeller av pediatrisk ASD; dessa tester mått minskat och onormala sociala beteenden som representerar centrala funktioner i ASD. Förutom den juvenil sociala interaktionstestet, många andratester har använts för att mäta stereotypa beteenden i djurmodeller av ASD. Till exempel marmor nedgrävning test, vilket undersöker tendensen hos ett djur för att förskjuta bäddmaterial med användning av nos och framtassar under försök att täcka ett föremål, är tänkt att mäta kompulsiva stereotypa beteenden som inträffar som svar på aversiva stimuli 3,4. Följaktligen har gräva tester genomförts för att kvantifiera denna repetitiva beteenden i ASD djurmodeller och olika arter av gnagare 3,5-7. Gräva beteenden definieras som uppenbara riktade insatser av nosen eller tassar för att tränga undan bäddmaterial och har en hypotes att vara en känslig parameter för repetitivt motorik 4.
Här rapporterar vi en ny typ av grävning, som vi har benämnt "inchworming," i BTBR musstam. Karakteriseringen av detta nya beteende kan ge en robust mått på ett upprepande motorbeteende som kan användas för ytterligare valsolideringen av gnagare modeller såsom ASD, Huntingtons sjukdom eller tvångssyndrom beteende 8,9. Vi definierar "inchworming" som åtminstone en synkron rörelse fram-och hind-lemmar inåt följt av en synkron rörelse utåt vilket leder till förskjutning av strö. Detta skiljer sig från typiska grävbeteende på många sätt. Först inchworming beteende observeras vanligtvis som en kombination av episoder i stället för en enda isolerad händelse. Som kontrast kan grävning förekomma som enstaka koordinerad rörelse av antingen den bakre eller framtassarna 3. Dessutom inchworming rörelser tenderar att inträffa horisontellt över utrymmets golv i motsats till de stationära positioner som är karakteristisk för grävning beteenden. Slutligen inchworming beteende som beskrivs nedan förekommer ofta i BTBR inavlad stam av möss, men är sällan identifieras i B6 kontrollstammen, medan typiska gräv beteenden är vanliga i B6 och BTBR stammar av möss
Med tanke på att marmor nedgrävning, gräva, och juvenil lek har fastställt värde för att mäta onormalt beteende i musmodeller av ASD, kompletterar inchworming beteende dessa tidigare definierade mätningar av stereotypa beteenden. Särskilt inchworming beteendet ger ett användbart mått på lägre order motoriska stereotypier som vanligen identifieras i ASD 8,11. Dessutom kan denna nya inchworming förfarande ge forskare med ett extra värdefullt verktyg för analys av repetitiva motoriska beteenden som är relevanta för utvecklingsstörningar såsom ASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med den kanadensiska Animal Care kommittén och godkändes av University of Calgary Djurvård kommittén.
1. Djurpreparering
- Isolera möss över natten (12 timmar) före testning. För att göra detta, placera alla BTBR och B6 möss (P35-P40) behövs för experimentell analys i burar själva, dagen före testning.
- Placera den isolerade möss i beteendeanalys rummet 30 min före testning så att djuren kommer att vänja till den nya miljön.
2. Förberedelse av utrustning
- Placera 30 x 30 cm Plexiglas låda med ett avtagbart lock i provningsrummet. Placera lådan på ett bord och placera videokameran till en 45 ° vinkel från botten; denna placering av kameran kommer att tillåta visualisering av hela golvet av kammaren och musen. Använd en IR-bakgrundsbelysning för att minimera bländning från väggen avlådan.
- Använd en videokamera som besitter en hög zoomfunktion med IR-kapacitet för att optimera filma i en låg lux miljö. Fokusera kameran på skåpet förstorar bilden så att mössen visualiseras genom hela rutan.
- Täck hela golvet i lådan med sågspån strö (bör vara ungefär 1 tum djup).
3 Test Procedure
- Placera en intra-stam par möss (BTBR - BTBR eller B6-B6) inom testinneslutningen.
- Släcker belysningen i testrummet.
- Starta videokameran för att spela in och lämna rummet. Detta kommer att förhindra försöks inflytande på beteendet hos mössen. Anteckna aktivitet för 11 min.
- När inspelningen är klar, åter gå in i provningsrummet och tillbaka mössen till sina ursprungliga hem burar.
- Kassera sågspån sängkläder, tvätta hela testrutan med 70% etanol, och placera nya sågspån strö i botten på testkapsling.
- Upprepa hela proceduren för resten av de intra-bets par och återgå mössen till sina ursprungliga hem burar.
OBS: För att kontrollera tillförlitligheten i inchworming uppgifter, kan proceduren upprepas på efterföljande dagar med olika BTBR-BTBR och B6-B6 par kombinationer. Detta kommer att säkerställa att det observerade beteendet är inte beroende på den specifika partnern i inneslutningen, men inchworming individ.
4. Dataanalys
- Inchworming definieras som den synkrona inåt och utåt rörelse djurets förgrunden-och Hind-fötter, med ett minimum av en co-förekommande inåt och sedan efterföljande rörelse utåt som effektivt förskjuter sängkläder. Manuellt titta på och göra mål varje video två gånger (en gång för varje mus) för att fastställa den totala varaktighet, frekvens, och latens att Inchworm i 10 min video. Manuell poängsättning av inchworming varaktighet, frekvens och latens bör baseras på uppföljningning definitioner:
Inchworming Längd: definieras som den totala tiden som varje mus bringar engagerad i inchworming beteende. Gör mål denna aspekt av inchworming, använd en timer som kan startas och stoppas. Starta timing när musen börjar inchworm och stoppa timern när musen stannar inchworming. När och om musen börjar inchworm igen, omstart och åter stoppa timern. Upprepa start och stopp av timern under hela den 10 min observationsperioden varje gång musen inchworms. Detta kommer att generera en inchworming varaktighet poäng som är 0:00 till 10:00 minuter.
Inchworming Frekvens: definieras som det antal gånger som musen hakar i inchworming beteende i 10 minuter långa observationsperioden. En enda räkning delas varje gång musen startar och slutar inchworming. Den inchworming frekvens poäng kommer att vara ett tal mellan 0 och ∞.
Latens till Inchworm: definieras som den tid thvid passerar före den första uppkomsten av inchworming. Starta timern när filmen börjar, kommer det att finnas tid 00:00, och stoppa timern när musen inchworms för första gången. Om musen inte visar inchworming beteendet latensen att inchworm blir 10:00. Vid analys av latens att inchworm, kommer en poäng från 0:01 till 10:00 min erhållas. Möss som inte Inchworm under hela testperioden bör tas bort från prov befolkningen för att säkerställa att resultaten är relevanta för en befolkning på möss som visar inchworming beteende. - Beräkna den totala frekvensen och varaktigheten av inchworming för varje mus i videon. Beräkna den erforderliga tiden för den första musen i paret till inchworm för latensen till inchworm för den specifika par av möss. Dessa parametrar är baserade på tidigare metodarbete relaterat till repetitiva gräv beteenden hos möss 6.
- Beräkna den genomsnittliga varaktighet, frekvens,och latens för att gräva för varje försöksgrupp i analysen (dvs. BTBR vs B6). Använd en ANOVA eller ett t-test för att jämföra data mellan stammar / experimentella grupper.
Obs: När proceduren är klar på en andra dag, använd en upprepade mätningar ANOVA för att se till att det inte fanns några efterföljande effekter rättegång eller ihopparning effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den modifierade versionen av ungdomsspel prov som beskrivs här kan användas för att observera och analysera romanen repetitiva grävbeteende kallas inchworming. Inchworming ställs ut till en mycket större grad av BTBR möss än B6 kontroller. I en typisk 10 min session kommer BTBR möss visar distinkta inchworming beteende (synkron inåt och utåt rörelse tassarna i ett försök att förskjuta sågspån strö) under cirka 5 minuter, eller hälften av observationsperioden. Dessutom är latensen att inchworm betydligt kortare för BTBR möss - de börjar vanligtvis inchworming inom de första 10 sek i början av den inspelade sessionen. Däremot kontroll möss (B6) har en genomsnittlig latens till inchworm på 4 minuter och tillbringar mycket små delar av sin tid som faktiskt visar beteendet. Dessa resultat liknar data från tidigare studier på repetitiva gräv beteenden hos gnagare 3,6.
Figure 1 skildrar en korrekt experiment inställd för testprocedurer. Figur 2 visar den genomsnittliga inchworming varaktighet (A), frekvens (B) och latens (C) för att inchworm för BTBR möss och kontroll B6 stam. Samtliga parametrar var signifikant olika mellan de stammar. I experimentet rapporteras här var inchworming testet administreras under en 2 dagars testperiod, med alternativa ligaspel i den andra dagen, och resultaten av varje dag jämfördes. Inga signifikanta skillnader fanns, på så sätt säkerställa att effekterna var inte beroende av vare sig specifika mus pair eller upprepning av testet. Slutligen Figur 3 innehåller stillbilder från olika möss engagerade i de två primära komponenterna i inchworming beteende.
Figur 1. Utrustning inrättas för inchworming experimentet. Utrustning ställa upp för inchworming experimentet. En 30 cm kub av plexiglas låda ligger på ett bord framför en infraröd zoom kamera placerad i 45 ° vinkel. Den nedre delen av inneslutningen är täckt helt med ett jämnt skikt av minst en tum av sågspån.
Figur 2. Genomsnittlig inchworming varaktighet, frekvens och latens visas av par av BTBR och B6 möss. The BTBR (n = 8) och B6 (n = 8) möss testades vid P35-P40 under en två dagars testperiod och gjorde mål för inchworming beteende. A) BTBR stammen visade en signifikant längre betyda längd inchworming än B6 styrstam (p <0,001). B) De BTBR möss visade en signifikantaoch art högre frekvens av inchworming jämfört med B6 kontroller (p <0,001). C) Det fanns en signifikant skillnad i BTBR (n = 8) och B6 (n = 7) latens för att gräva med BTBR visar en markant minskning av den tid det tog för att visa beteendet jämfört med B6 kontroller (p = 0,001).
Figur 3. Illustrativ representation av olika möss i båda aspekterna av inchworming beteende. Det övre fältet är ett exempel på möss i förlängningsfasen av inchworming beteende, medan det undre fältet är ett exempel på mössen i kontraktion fasen av inchworming beteende . Inchworming definieras som den synkrona inåt och synkron rörelse utåt av den främre och bakbenen på musen att förflytta sängkläder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inchworming är en ny mätning av repetitivt beteende som kan användas för att studera många sjukdomar som uppvisar stereotypier såsom ASD. Det finns fyra steg som är av avgörande betydelse för att generera tillförlitliga inchworming uppgifter från den modifierade juvenil social interaktion protokoll: 1) den förlängda Isoleringen är avgörande för inchworming testet och får inte tas bort från protokollet eller förkortas. Detta krav är specifika för testning av inchworming parvis beskrivs här. 2) Videokameran måste vara lämpligt placerade och fokuserad så att mössen kan helt visualiseras genom hela plexiglasvägg. 3) Höljet bör rengöras noggrant mellan test par för att se till att de nuvarande beteende inte påverkas av dofter från det föregående par möss. 4) Strö materialet för Lådan måste vara tillräckligt (~ 1 cm djup) och måste vara sågspån; möss visar inte inchworming beteende med lite / inga sängkläder eller närplaceras på andra strömaterial.
Även om det inte beskrivs här, har vi observerat inchworming beteende i icke-isolerade, socialt inrymt BTBR möss placeras ensamt (i stället för i par) på ett liknande bedded kapsling. Under dessa förhållanden är de BTBR möss fortfarande inchworm, men vid en lägre frekvens och varaktighet, vilket sålunda indikerar att den inchworming beteende är ett stereotypt beteende möjligtvis induceras av social ångest (data visas ej). Med tanke på att studier har misslyckats med att på ett tillförlitligt sätt påvisa skillnader i ångest mellan BTBR och B6 kontroll möss, sannolikt en interagera med andra faktorer för att framkalla detta beteende 12 ångest. Men var i fokus för denna metodologiska artikeln det standardiserade modifiering av juvenil social interaktion protokoll eftersom det framkallar beteendet snabbt och tillförlitligt, med dramatiska skillnader mellan BTBR och B6 möss. Dessutom samlas uppgifter in från två djur i en enda session, vilket ökar informeraation vunnits från varje testperioden. I vårt laboratorium har inchworming beteendet endast bekräftats i åldersgruppen P35-P55. Även om det är möjligt att möss kommer yngre och äldre visa denna repetitivt beteende, kan man inte upptäckte inchworming vid andra åldrar visar att beteendet är specifik för ungdomar och unga vuxna möss.
Data från detta experiment visar tydligt att BTBR musstammen bedriver repetitiva inchworming beteende snabbare, oftare och under längre löptider än B6 kontroller. Den inchworming beteende kan därför ge forskare med ett nytt mått på repetitiva beteenden i andra ASD och sjukdomsmodeller. Även om det är ännu inte klart vad som driver denna repetitiva grävrörelse, BTBR möss visar också högre nivåer av själv grooming och socialt undvikande 1, 9. Som gräva är en medfödd genetiskt reglerad drag i möss, kan testning av inchworming beteende be appliceras lätt på andra stammar och har potential att bli ett värdefullt verktyg för att bedöma motoriska stereotypier och tvångsmässigt beteende i andra sjukdomsmodeller.
Ett av kännemärkebeteendemönster som kännetecknar ASD är repetitivt beteende med begränsade intressen 9. Förutom att lyfta fram en värdefull motor stereotypi, har detta experiment ökat giltigheten av musmodell av ASD BTBR genom att visa ytterligare ett repetitivt beteende som liknar den kliniska bilden av motoriska stereotypier i ASD patienter. Inchworming visas i både BTBR (ASD) möss och B6 kontroll möss, även om beteendet är relativt sällsynta i B6-möss. Beteendet som mest liknar inchworming gräver beteenden hos gnagare. Al. Thomas et 4 tyder på att för gnagare, gräva serverar en mängd olika funktioner, inklusive förvaring av livsmedel, rovdjur skatteflykt, och skydd från aversiva miljöer. Eftersom dessa funktioner är inte NECvändiga i laboratoriemiljö, kan möss som uppvisar höga nivåer av grävbeteende att uppfylla ett tvångsmässigt beteende behov 4. Vidare föreslår et al. Silverman 9 att gräva beteende bör inkorporeras i analysen av juvenil social interaktion testet som ett mått på icke-social aktivitet.
Sammanfattningsvis är inchworming ett högt upprepat beteende betydligt vanligare i BTBR möss (en modell av ASD) jämfört med B6-möss (kontrollstam). Även om etiologin av beteendet är för närvarande okänt, kan det vara en värdefull resurs för forskare som undersöker tvångsmässighet och upprepning i gnagarmodeller av många sjukdomar. Procedur tekniker är enkla och kan fyllas med lätthet i en 24 tim period. Dataanalys är mer komplicerat och tidskrävande, men videoinspelning testförfarandet gör det möjligt för forskare att slutföra analysen off-line och upprepade att säkerställa inter-rater konsekvens ochtillförlitlighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för det tekniska och logistiska stöd och sakkunskap från Rose Tobias, Younghee Ahn, och David N. Ruskin. Arbetet beskrivs här har finansierats av Alberta Barnsjukhuset Foundation och Alberta barnsjukhuset Forskningsinstitut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
