En protokoll for å isolere, kultur, og bilde holme celle klynger (ICCS) avledet fra humane føtale bukspyttkjertelen celler er beskrevet. Metoden detaljer de nødvendige skritt for å generere ICC-verdiene fra vev, kultur som monolayers eller i suspensjon som tilslag, og bildet for markører for spredning og bukspyttkjertelen celle skjebne beslutninger.
I nesten 30 år har forskere vist at menneskelige foster ICC-verdiene transplantert under nyre kapsel av nakne mus modnet til fungerende endokrine celler, noe som gjenspeiles av en betydelig økning i sirkulerende menneskelig C-peptid følgende glukose stimulering 1-9. Men in vitro, er tilblivelsen av insulinproduserende celler menneskelige foster ICC-verdiene fra lav 10; resultater som minner om siste eksperimenter utført med humane embryonale stamceller (hESC), en fornybar kilde til celler som holder store løftet som en potensiell terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Som ICC-verdiene, transplantasjon av delvis differensiert hESC generere glukose responsive, insulinproduserende celler, men in vitro tilblivelsen av insulinproduserende celler fra hESC er mye mindre robust 11-17. En fullstendig forståelse av de faktorer som påvirker vekst og differensiering av endokrine forløper celler vil trolig kreve data generert fra både ICC-verdiene, og hanSC. Mens en rekke protokoller finnes for å generere insulinproduserende celler fra hESC in vitro 11-22, langt færre eksistere for ICC-verdiene 10,23,24. En del av denne uoverensstemmelsen sannsynlig kommer fra vanskeligheten med å jobbe menneskelige foster bukspyttkjertelen med. Mot dette målet, har vi fortsatt å bygge på eksisterende metoder for å isolere føtale holmer fra menneskelige pancreases med svangerskaps aldre fra 12 til 23 uker, dyrke cellene som en monolayer eller i suspensjon, og bildet for celleproliferasjon, pancreatic markører og menneskelige hormoner inkludert glukagon og C-peptid. ICC-verdiene genereres av den protokoll som er beskrevet nedenfor, resulterer i C-peptid-frigjøring etter transplantasjon under nyrekapselen nakne mus som er lik C-peptid-nivåer som oppnås ved transplantasjon av friskt vev 6.. Selv om eksemplene som presenteres her fokusere på den pankreatiske endoderm proliferasjon og β celle genese, kan protokollen som brukes for å studere andre aspekter av pankreas utvikling, Inklusive eksokrin, duktalt og andre hormonproduserende celler.
En primær begrensning til celle-baserte insulin erstatning terapi ved type 1 diabetes er det sparsommelige menneskelige holmer som er tilgjengelige for transplantasjon. Evnen til å regulere proliferasjon og differensiering av humane pankreatiske forløper celler inn i insulin-produserende celler som oppfyller de metabolske kravene til en insulin-mangeltilstand forblir en kritisk byggesten for et cellebasert terapi til behandling av type 1 diabetes.
Før advent av hESC avledet insulinproduserende celler, menneskelige foster bukspyttkjertelens endokrine celler eller deres forløpere ble sett på som potensielle kilder til celler for klinisk transplantasjon. Selv om den vitenskapelige og regulatoriske landskapet har endret seg de siste årene, er det fortsatt et stort behov for å forstå hvordan den menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikler. Mange nå vise terapeutisk bruk humane føtale celler på som lite sannsynlig, men hvis effektive og sikre metoder for å utvide cellene ble etablert, terapeutisk bruk av disse cellene kunne agAin bli utforsket. Et stort hinder som gjenstår er at in vitro transformasjon av humane føtale bukspyttkjertelen celler tilslag (ICCS) til glukose responsive, er insulin sekresjon endokrine celler i dag en ineffektiv prosess. Selv om mye arbeid over nesten 30 år har belyst og beskrevet de uttrykk profilen til transkripsjonsfaktorer som kreves for utvikling av endokrine bukspyttkjertelen, er det fortsatt hull i vår kunnskap om hvordan tidsbaserte uttrykk av transkripsjonsfaktorer er regulert og knyttet til cellefunksjon.
Før advent av hESC avledet insulinproduserende celler, menneskelige foster bukspyttkjertelens endokrine celler eller deres forløpere ble sett på som potensielle kilder til celler for klinisk transplantasjon. Selv om den vitenskapelige og regulatoriske landskapet har endret seg de siste årene, er det fortsatt et stort behov for å forstå hvordan den menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikler. Mange nå vise terapeutisk bruk humane føtale celler på som lite sannsynlig, men hvis effektivog sikre fremgangsmåter for å utvide cellene ble etablert, terapeutisk anvendelse av disse cellene kan igjen bli utforsket. Et stort hinder som gjenstår er at in vitro transformasjon av humane føtale bukspyttkjertelen celler tilslag (ICCS) til glukose responsive, er insulin sekresjon endokrine celler i dag en ineffektiv prosess. Selv om mye arbeid over nesten 30 år har belyst og beskrevet de uttrykk profilen til transkripsjonsfaktorer som kreves for utvikling av endokrine bukspyttkjertelen, er det fortsatt hull i vår kunnskap om hvordan tidsbaserte uttrykk av transkripsjonsfaktorer er regulert og knyttet til cellefunksjon.
Nylig har stamcellefeltet ansatt akkumulert kunnskap om timelig transkripsjonsfaktor uttrykk under holme utvikling for å drive produksjonen av celler som uttrykker markører for modne endokrine celler. Selv om tilblivelsen av insulinproduserende celler fra hESC og induserte pluripotente celler (iPSC) har gjort betydelige ogbetydelige fremskritt i de siste årene, de mest effektive protokoller krever to distinkte differensiering faser: 1) en tidlig in vitro differensiering for å generere celler som uttrykker bukspyttkjertelen forløper transkripsjonsfaktorer, etterfulgt av 2) in vivo modning etter transplantasjon – en såkalt "black box "periode. For å bevege seg fremover, fremskritt i forståelsen av biologien underliggende holme modning in vivo, uavhengig av cellen kilde, må forstås på et biokjemisk nivå. Likheten mellom de resultater som oppnås med ICC-verdiene og hESC antyder at en rekke kritiske biokjemiske prosesser som regulerer overgangen av humane pankreatiske forløper celler til modne, glukose, insulin responsive utsondrende celler in vitro er imidlertid ukjent. En sentral del av denne forståelsen vil være å utvikle nye metoder for å utlede funksjonelle endokrine cellepopulasjoner fra bukspyttkjertelen stamceller og hESC vil kreve ikke bare biokjemisk caoaches som belyser modningen hendelser, men metodene for å analysere endringer.
Hvorfor tror vi at bildebehandling humane føtale bukspyttkjertelen celler er en kritisk del av å fange opp endringer i holme modning? Svaret ligger delvis i den historiske søken etter å skape insulinproduserende celler. Både modell og vev-kultur-systemer for bukspyttkjertelen forløpere og holmer har tillatt forskere å utforske de betydelige forskjellene som eksisterer mellom modning av dyre holmer og menneskelige holmer in vitro. En begrensning til utforskning av menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikling er at svangerskaps aldre som lovlig kan brukes bare gi opphav til heterogene celle aggregater. Selv om de isolerte føtale menneskeceller ligner holmer, flekker etter in vitro kultur fra svangerskaps aldre 9-23 uker avslører mindre enn 15% inneholde markører for endokrine celler, med de fleste cellene ikke flekker på holmen hormoner. Men etter transplantasjon og ivivo modning, et stort flertall av celler uttrykker endokrine markører 6,25. Resultatene fra disse studiene blir gjentatt i dag med hESC differensiering protokoller som bare er i stand til å generere beskjedne bestander av enkelt hormon positive endokrine celler etter in vitro differensiering. In vitro metoder for å forbedre bestander av hormon positive celler vil trolig gi innsikt i in vivo holme modning. Å forstå de molekylære hendelser som driver human foster bukspyttkjertelen utvikling vil sannsynligvis forbedre arbeidet med å utlede insulinproduserende celler fra hESC og videre avgrense hvilke mekanismer som regulerer β celle regenerering og bukspyttkjertelen celletransdifferensiering.
Likhetene mellom menneskelig foster bukspyttkjertelen celle og hESC modning kan utvides til celle funksjon. Som murine celler, både humane føtale celler og differensiert hESC er ikke i stand til å frigi insulin som svar på glukoseetter holme neoformation in vitro 26,27. Men ved transplantasjon i nakne mus og modning, både menneskelige holme-liknende samlinger og insulinproduserende celler avledet fra hESC utstillings en endokrin fenotype. Tre måneder etter pode, nesten 90% av de transplanterte cellene fra enten befolkningen er insulin positive, og fungere normalt som bestemmes ved utgivelsen av C-peptid 17,26. Disse resultatene indikerer at transplantasjon gir kontekst og uidentifiserte signaler som fremmer holme modning. Optimalisert bilde protokoller, slik som den er beskrevet her, for menneske føtale bukspyttkjertelen celler vil hjelpe i søket for å identifisere faktorer som modulerer og akselerere modning. Fundamental biokjemiske utforskning av menneskelige foster bukspyttkjertelen celler og hESC differensiert mot en endokrin avstamning på dette stadiet av utviklingen er avgjørende for å måle effektiviteten av modning.
Den følgende protokoll, som er skissert i Figure 1, gir vår nåværende metode for isolering av humane føtale pankreatiske celler, kalt ICC-verdiene fra hel human fetal pancreas og avbildning av disse cellene. Denne protokoll krever en initial tilberedning av celler fra vev, som deretter kan dyrkes som et monolag eller i suspensjon. Utarbeidelse av celler for avbildning av brukte markører av endokrine celleproliferasjon og modning er beskrevet.
Generering og avbildning av ICC-verdiene i fravær eller nærvær av et utvalg av kjemiske modifiserende midler gir en hurtig metode, sammenlignet med transplantasjonsmodeller, for å bidra til å identifisere dyrkningsbetingelser og forbindelser som akselerere modningen av humane føtale pankreatiske celler til fullstendig funksjonell eksokrin, duktalt, eller hormonproduserende pankreatiske celler.
De metodene som presenteres her, lar en til å generere ICC-verdiene menneskelige foster bukspyttkjertelen og senere image for markører for celleproliferasjon og bukspyttkjertel endoderm fra. Prosessen med human fetal pancreas dissosiasjon kreves omtrent 90 min, etterfulgt av en 72 timers periode dannelse ICC, en fremgangsmåte som er vesentlig forskjellig fra protokoller for å isolere β celle stamceller fra mus. Protokollen presenteres her gir en reproduserbar metode som gjør det mulig for forskeren å utforske menneskelige foster bukspyttkjertelen utvikling. To forskjellige typer av langsgående studier kan utføres. For det første kan den potensielle for å generere funksjonelle pankreas celletyper (ductal celler, eksokrine celler, og hormon-positive celler) fra forskjellige svangerskaps aldre vurderes etter transplantasjon. For det andre, kan ICC-verdiene fra en enkelt gestasjonsalder dyrkes i kultur, behandlet med utvalgte farmakologiske midler og transplantert ved ulike tidspunkt i løpet av ICC kultur til å utforske forskjelleri celle skjebne. Med den enorme innsatsen for tiden rettet mot hESC differensiering inn insulinproduserende celler, er problemene knyttet til insulinsekresjon i respons til fysiologiske stimuli igjen blir gjenopplivet. Menneske ICC-verdiene gir en unik modellsystem for å studere denne kritiske aspektet av fosterets bukspyttkjertelen celleproliferasjon og β celle utvikling.
Som med hvilken som helst protokoll å isolere celler fra vev, detaljer er avgjørende for suksess. Et antall parametre er dessverre utenfor kontroll av laboratoriepersonalet som utfører eksperimentet. To problemer som oppstår ved dette laboratoriet omfatte dårlig kvalitet på utgangsmateriale og levering av ikke-pankreatisk vev. Sunn foster bukspyttkjertelen vev er fast til en sakse kutt. Hvis vevet kutt for lett, er det et tegn på at de pankreatiske enzymer har begynt å fordøye bukspyttkjertelen selv. Fra dette er det dessverre ingen utvinning og utarbeidelse er best kansellert. Sjelden, en ierfarne teknikere fjerne bukspyttkjertelen vil forvirre seksjoner av tarmen for bukspyttkjertelen. Disse prøvene vil ha mye mer elastisitet enn en bukspyttkjertel og en bemerkelsesverdig lumen vil være til stede. Igjen bør disse prøvene kastes.
Når protokollen ovenfor ble fulgt som beskrevet, er det sjelden problemer som oppstår for å kaste isolering av sporet. Et par punkter å huske på for å sikre en jevn isolasjon inkluderer, for å bruke skarp saks for presis bukspyttkjertelen skjæring og å sørge for å ikke la noen vevsprøve for stor til å fordøye. Hvis kuttene er ikke små nok, så kollagenase ikke virker effektivt, og det er få ICC-verdiene dannes. Motsatt, når du bruker en ny batch av collagenase, starter med et tilsvarende nivå dersom IE (internasjonale enheter) for fordøyelsen som tidligere ble brukt. Imidlertid reduserer inkubasjonstiden for å sikre at i løpet av fordøyelsen ikke forekommer. Denne feilsøkingsteknikk sikrer at IU etiketten ikke variere betydelig fra parti til BAtch.
Tatt i perspektiv, er denne teknikken for isolering humane føtale ICC-verdiene av relativt standard på området. De fleste laboratorier bekreftet våre funn at tillegg av HGF til media hjelper cellene overlever og sprer 33. I sammendraget har vi utviklet en metode for å isolere humane føtale ICC-verdiene frisk pankreata med gestational alder som spenner 9-23 uker. Cellene kan dyrkes som et monolag eller i suspensjon til eksperimenter for å visualisere endokrin pankreas transkripsjonsfaktorer og humant insulin.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) og NIH (DK54441).
Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
1M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
Penicillin – Streptomycin 100X Solution | Life Technologies | 15070063 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
Dnase | Sigma | DN25 | |
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
PBS | Gibco | 14190 | |
16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) | Sigma | I2018 | |
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) | Sigma | G2654 | |
PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
AlexaFluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
AlexaFluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
AlexaFluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
AlexaFluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
Agarose | Sigma | A-6013 |