Summary
Ein Protokoll zur Isolierung und Kultur und Bildinselzellclustern (ICC) von humanen fötalen Pankreaszellen abgeleitet wird beschrieben. Die Methode beschreibt die erforderlich sind, um Chipkarten aus Gewebe, Kultur als Monoschichten oder in Suspension als Aggregate und Bild für Marker der Proliferation und Pankreaszellschicksal Entscheidungen erzeugen Schritte.
Abstract
Seit fast 30 Jahren haben Forscher gezeigt, dass menschliche fötale ICCs unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen transplantiert gereift in funktionierende endokrine Zellen, wie durch einen signifikanten Anstieg der zirkulierenden menschlichen C-Peptids nach Glucosestimulation 1-9 zeigt. Jedoch in vitro ist Genese der Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen fetalen ICCs niedrigen 10; Ergebnisse erinnern an den letzten Experimenten mit humanen embryonalen Stammzellen (hES) durchgeführt, einer erneuerbaren Quelle der Zellen, die großen Versprechen als eine mögliche therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes zu halten. Wie ICCs, Transplantation von teilweise differenziert hESC generieren Glukose reagieren, Insulin produzierende Zellen, aber in vitro Entstehung der Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen ist viel weniger robust 17.11. Ein vollständiges Verständnis der Faktoren, die das Wachstum und die Differenzierung von endokrinen Vorläuferzellen beeinflussen erfordern wahrscheinlich Daten von beiden ICCs und er erzeugtSC. Während eine Reihe von Protokollen existieren, um Insulin-produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in vitro 11-22, weit weniger gibt es für ICCs 10,23,24 generieren. Teil dieser Diskrepanz kommt wahrscheinlich aus der Schwierigkeit bei der Arbeit mit menschlichen fötalen Pankreas. Auf dem Weg zu diesem Zweck haben wir weiterhin auf den bestehenden Methoden zu bauen, um fetale Inseln aus menschlichen Bauchspeicheldrüsen mit Schwangerschafts Alter zwischen isolieren 12-23 Wochen wachsen die Zellen als Monoschicht oder in Suspension und Bild für die Zellproliferation, Pankreas-Marker und menschlichen Hormonen einschließlich Glucagon und C-Peptid. ICCs durch die unten Ergebnis in C-Peptid-Freisetzung nach der Transplantation unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen, die ähnlich wie C-Peptid-Werte durch die Transplantation von frischem Gewebe 6 erhalten sind beschriebenen Protokoll erzeugt. Obwohl die hier vorgestellten Beispiele konzentrieren sich auf den Pankreas Endoderm Proliferation und β Zellbildung, kann das Protokoll eingesetzt, um andere Aspekte der Pankreasentwicklung zu studieren, Einschließlich der exokrinen, duktalen und andere Hormon-produzierenden Zellen.
Introduction
Eine primäre Beschränkung auf Zellbasis Insulin-Ersatz-Therapien bei Typ-1-Diabetes ist der Mangel an menschlichen Inselzellen für die Transplantation zur Verfügung. Die Fähigkeit, die Proliferation und Differenzierung von humanen Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin-produzierende Zellen, die die Stoffwechselanforderungen eines Insulin-Mangelzustand zu erfüllen regulieren bleibt ein wichtiger Baustein für eine zellbasierte Therapie zur Behandlung von Typ-1-Diabetes.
Bis zum Aufkommen der HES abgeleiteten Insulin-produzierenden Zellen, menschliche fötale endokrinen Pankreaszellen oder deren Vorstufen, wurden als potentielle Quellen von Zellen zur klinischen Transplantation angesehen. Obwohl die wissenschaftlichen und regulatorischen Landschaft hat sich in den letzten Jahren verändert, es bleibt eine lebenswichtige Notwendigkeit zu verstehen, wie der menschliche fetale Bauchspeicheldrüse entwickelt. Viele sehen jetzt therapeutische Verwendung von menschlichen fetalen Zellen als unwahrscheinlich, aber wenn wirksame und sichere Methoden, um die Zellen zu erweitern wurden gegründet, therapeutische Anwendung dieser Zellen könnte again erkundet werden. Eine große Hürde, die bleibt, ist, dass in vitro-Transformation von menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse Aggregate (ICC) in Glukose reagieren, ist Insulin sezerniere endokrinen Zellen derzeit ein ineffizienter Prozess. Obwohl viel Arbeit in fast 30 Jahren hat sich aufgeklärt, und skizziert das Expressionsprofil von Transkriptionsfaktoren für die Entwicklung des endokrinen Pankreas erforderlich, gibt es weiterhin Lücken in unserem Wissen über die zeitliche Expression von Transkriptionsfaktoren reguliert wird und die Zellfunktion zusammen.
Bis zum Aufkommen der HES abgeleiteten Insulin-produzierenden Zellen, menschliche fötale endokrinen Pankreaszellen oder deren Vorstufen, wurden als potentielle Quellen von Zellen zur klinischen Transplantation angesehen. Obwohl die wissenschaftlichen und regulatorischen Landschaft hat sich in den letzten Jahren verändert, es bleibt eine lebenswichtige Notwendigkeit zu verstehen, wie der menschliche fetale Bauchspeicheldrüse entwickelt. Viele sehen jetzt therapeutische Verwendung von menschlichen fetalen Zellen als unwahrscheinlich, aber wenn effektiveund sichere Methoden erweitern die Zellen wurden gegründet, konnte die therapeutische Verwendung dieser Zellen wieder erkundet werden. Eine große Hürde, die bleibt, ist, dass in vitro-Transformation von menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse Aggregate (ICC) in Glukose reagieren, ist Insulin sezerniere endokrinen Zellen derzeit ein ineffizienter Prozess. Obwohl viel Arbeit in fast 30 Jahren hat sich aufgeklärt, und skizziert das Expressionsprofil von Transkriptionsfaktoren für die Entwicklung des endokrinen Pankreas erforderlich, gibt es weiterhin Lücken in unserem Wissen über die zeitliche Expression von Transkriptionsfaktoren reguliert wird und die Zellfunktion zusammen.
Vor kurzem hat die Stammzellfeld das angesammelte Wissen über zeitliche Transkriptionsfaktor-Expression während der Insel Entwicklung eingesetzt, um die Produktion von Zellen, die die Marker der reifen endokrinen Zellen exprimieren zu fahren. Obwohl Entstehung der Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Zellen (iPS) hat erhebliche gemacht undbedeutende Fortschritte in den letzten Jahren sind die wirksamsten Protokolle erfordern zwei verschiedene Differenzierungsphasen: 1) ein früher in vitro Differenzierung zu Zellen, Pankreas-Vorläufertranskriptionsfaktoren, gefolgt von 2) in vivo Reifung nach der Transplantation zu erzeugen - eine sogenannte "Black Box "Zeit. Um voranzukommen, Fortschritte im Verständnis der Biologie zugrunde liegenden Insel Reifung in vivo, unabhängig von der Zellquelle, muss in einem biochemischen Ebene verstanden werden. Die Ähnlichkeit zwischen den mit ICCs und HES erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine Reihe von kritischen biochemischen Prozesse, die den Übergang von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen in reife, Glucose reagiert, Insulin sekretierenden Zellen in vitro zu regulieren unbekannt. Ein zentraler Teil dieses Verständnisses wird es sein, neue Methoden zu entwickeln, um funktionelle endokrine Zellpopulationen aus Pankreas-Vorläuferzellen ableiten und hESC wird nicht nur biochemische ca. erfordernoaches, die die Reifung Ereignisse, sondern Methoden, um die Änderungen zu analysieren aufzuklären.
Warum glauben wir, dass die Abbildung menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse ist ein kritischer Aspekt der Identifizierung Veränderungen im Insel Reifung? Die Antwort liegt zum Teil in der historischen Aufgabe, Insulin produzierende Zellen zu erzeugen. Beide Modell-und Gewebekultursystemen für Pankreas-Vorläufern und Inselchen haben Forschern erlaubt, die wesentlichen Unterschiede, die zwischen Reifung von Tier-und Menschen Inselchen Inseln in vitro vorhanden erkunden. Eine Beschränkung auf die Erforschung des menschlichen fetalen Pankreas Entwicklung ist, dass die Schwangerschaftsalter, die legal eingesetzt werden können, nur die zu heterogenen Zellaggregate. Obwohl die isolierten fötalen menschlichen Zellen ähneln Inselchen, Färbung nach in vitro-Kultur von Schwangerschaftsalter 9-23 Wochen zeigt weniger als 15% enthalten Marker für endokrine Zellen, wobei die meisten Zellen nicht-Färbung für die Inselhormone. Jedoch nach der Transplantation undvivo Reifung, eine große Mehrheit der endokrinen Zellen exprimieren Marker 6,25. Die Ergebnisse aus diesen Studien werden heute mit hES Differenzierungsprotokolle, die nur in der Lage, bescheidene Populationen von Einzel Hormon positiven endokrinen Zellen generieren hallte nach in vitro Differenzierung. In-vitro-Methoden, um Populationen von Hormon-positiven Zellen verbessern wird wahrscheinlich einen Einblick in in-vivo-Insel Reifung. Darüber hinaus, das Verständnis der molekularen Ereignisse, die menschlichen fetalen Pankreas-Entwicklung treiben wird wahrscheinlich Bemühungen um Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen ableiten und weiter abzugrenzen, die Mechanismen, die Zellregeneration und β Pankreaszelle Transdifferenzierung regulieren zu verbessern.
Die Ähnlichkeiten zwischen menschlichen fetalen Pankreas-Zellreifung und hES-Zell-Funktion kann verlängert werden. Wie murine Zellen, sowohl menschliche fötale Zellen und differenzierte hES Insulin nicht in Reaktion auf Glukose freizugeben sindnach Inselneubildung in vitro 26,27. Jedoch nach Transplantation in Nacktmäusen und Reifung sowohl menschlichen Inseln wie Cluster und Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen zeigen eine endokrinen Phänotyp abgeleitet. Drei Monate nach der Transplantation, fast 90% der transplantierten Zellen entweder Bevölkerung Insulin positiv und normal zu funktionieren, wie durch die Freisetzung von C-Peptid 17,26 bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transplantation bietet Kontext und nicht identifizierte Signale, die Insel Reifung zu fördern. Optimierte Bildgebung Protokolle, wie das hier beschrieben wird, für den menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse wird bei der Suche nach Faktoren, die zu modulieren und zu beschleunigen Reifung identifizieren helfen. Grund biochemischen Erforschung der menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse und hESC in Richtung einer endokrinen Linie differenziert in dieser Phase der Entwicklung ist für die Messung der Effizienz der Reifung.
Das folgende Protokoll, in Figur skizzierte 1, stellt unsere derzeitigen Verfahren zur Isolierung von humanen fötalen Pankreaszellen, genannt ICCs aus ganzen menschlichen fötalen Pankreas-und Abbildungs dieser Zellen. Dieses Protokoll erfordert eine anfängliche Herstellung von Zellen aus Gewebe, die anschließend als Monoschicht oder in Suspension gezüchtet werden können. Herstellung von Zellen für die Bildgebung von gebräuchlichen Markern von endokrinen Zellproliferation und Reifung beschrieben.
Erzeugung und Darstellung von ICCs in Abwesenheit oder Gegenwart einer Vielzahl von chemischen Modifizierungsmitteln stellt ein schnelles Verfahren, verglichen mit Transplantationsmodellen, zur Identifizierung Kulturbedingungen und Verbindungen, die Reifung von humanen fötalen Pankreaszellen in voll funktions exokrinen, duktalen oder beschleunigen Hormon-produzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse.
Protocol
Stellt fest, bevor Sie beginnen:
- Menschlichen fetalen Pankreas wurden aus den Geburtsschäden Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), die das Gewebe geerntet wurden. Informierte Einwilligung zur Gewebespende, Lagerung und Verwendung der Proben wurde von den Spendern von der Mitte erhalten. Das Protokoll Zustimmung Aussage wurde schriftlich geregelt und der University of California, Human Research Protections Program San Diego genehmigt die ganze Studie (Protokoll # 081237XT).
- Es ist wesentlich, um sowohl die menschlichen fötalen Pankreas und den Container, der Bauchspeicheldrüse auf Eis während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten. Die Spaltung und Verdauung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
- Senden die Klinik, wo die menschlichen fötalen Pankreas wurde aus dem Puffer für die Lagerung und den Transport von Pankreas erhalten. (RPMI-1640 + 10% normalem Humanserum (NHS), 300 mM Trehalose SG, Penicillin / Streptomycin und Fungizon).
1. Dissektion der menschlichen fetalen Pankreas
- Man löst 5 mg Kollagenase RT XI in HBSS auf eine Endkonzentration von 2,5 mg / ml zu ergeben. Filter sterilisieren die Lösung mit einem 0,22 Mikron-Spritzenfilter in ein steriles (autoklaviert) Szintillationsfläschchen und bei 4 ° C In einer Gewebekultur Kapuze, Set aus 2 sterile Petrischalen, eine sterile kleinen Tiegel (wenn ein Schmelztiegel nicht verfügbar ist, ein kleines Becherglas substituiert sein kann), sterilisierte Schere und Pinzette. 2 ml HBSS auf eine Petrischale, um die Bauchspeicheldrüse zu waschen. Absaugen von Flüssigkeit aus dem Röhrchen, das die fötalen Pankreas, so dass etwa 1 ml.
- Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette in die 60 mm Petrischale ohne HBSS. Für diese Experimente werden fetale ICCs aus frischen Pankreas mit Schwangerschafts Alter von 9 bis 23 Wochen erzeugt. Isolierung von Pankreas bei früheren gestionational Alter ist schwierig, aufgrund der Größe der Bauchspeicheldrüse. Das Protokoll ist wahrscheinlich für Schwangerschaftsalter über 23 Wochen, jedoch Nahme von pancreata nach dieser Zeit ist wegen der Bundes (US) schwierig wäre. Gelegentlich kommt der fötalen Pankreas mit Milz, Fett oder Bindegewebe aus der ursprünglichen Präparation befestigt. Die zusätzliche Gewebe ist leicht mit dem bloßen Auge sichtbar und sollte aus der Bauchspeicheldrüse, bevor das Protokoll entfernt werden.
- Spülen der Bauchspeicheldrüse in einem minimalen Volumen von kaltem HBSS (~ 0,5 ml) in die Petrischale.
- Bewegen Sie die gereinigten Bauchspeicheldrüse zu dem kleinen sterilen Tiegel mit Hilfe einer sterilen Pinzette und in einen Eiskübel. Dann wird der Tiegel in einem Halter für ein 50 ml-Zentrifugenrohr und mit 2 Scheren, kräftig Scheibe der Bauchspeicheldrüse für einige Minuten. (In der Regel 2-5 min, aber die Zeit ist abhängig von der Größe und Festigkeit des Gewebes). Schnitt-Technik ist wichtig. Halten einer Seite der Schere in einer festen Position bewegt nur die gegenüberliegenden Griffen. Die Spitzen der Schere sollte auf dem Boden des Tiegels liegen. Fahren Sie mit schnellen Scherenbewegung auf die Bauchspeicheldrüse in kleine PauseStück. Je kleiner die Gewebestücke, desto besser die Kollagenase wird funktionieren.
- 1,5 ml HBSS + den zerkleinerten Bauchspeicheldrüse, das Fläschchen mit dem Kollagenase und in einem Wasserbad Schüttler bis 37 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute bis zu 10 min. Sie häufiger als einmal während der ersten 5 min nicht zu überprüfen. Aufschlußzeit hängt von der Qualität des Gewebes kann so wenig wie 6 min ausreichend sein. Der Endpunkt ist, wenn die Teilchen klein und einheitlich.
- Füllen Sie das Fläschchen (10-15 ml) mit kaltem HBSS die Kollagenase-Aktivität zu stoppen. Zeigen auf Eis und ermöglichen die Klumpen für 10 Minuten absetzen. Oft an dieser Stelle einige Zelltod ist aufgetreten und DNA wird in den Medien veröffentlicht. Dies kann der Medien "strähnig" zu machen; in diesem Fall wird mit 100 ul DNase (10 mg / ml Stamm) zu der Lösung.
- Nachdem das Gewebe in der Szintillationsfläschchen wurde für 10 min, absaugen der oberen Schicht so dass es etwas weniger als halb voll (7-8 ml) angesiedelt. Übertragen der Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen5 ml HBSS. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
- Saugen Sie den HBSS und die Zellen resuspendieren in 5 ml Medium RPMI-1640, Glutamax, 10% normalem Humanserum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, Penicillin / Streptomycin und Fungizon. Platte auf 60 mm Petrischale. Für die Forscher versuchen, β-Zellen zu erzeugen, fügen HGF (10 ng / ml final) zu den Medien. Zusätzlich kann eine Anzahl von Gruppen haben gezeigt, dass die Ergänzung des Kulturmediums mit der Inkretinhormon GLP-1 erhöht auch β-Zellen 28. Zellen sollten in Suspension für 72 Stunden zu aggregieren und bilden ICCs gelassen werden.
- Nach 72 Stunden in Suspension können die Zellen auf der Matrix der menschlichen Zelllinie HTB9 Matrix, wie zuvor beschrieben 29 plattiert werden. Unabhängig von den Wachstumsbedingungen sollten die Medien alle 48 Stunden gewechselt werden.
2. Immunfluoreszenz der Marker der Zellproliferation und Endokrine Reifung in ICCs in Suspension gezüchtet, Monolayer oder auf Glasdeckgläser
- Um die Zellproliferation zu messen, wird BrdU-Markierung entweder adhärenten Zellen oder Zellen in Suspension für 12 h vor der PFA-Fixierung durchgeführt. BrdU Reagenz 1:100 verdünnt und Filter in RPMI-1640-sterilisiert, Glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, Penicillin / Streptomycin und Fungizon.
- Für Zellen in Suspension: Zentrifugieren für 5 min bei 300 × g und saugen Kulturmedium. 10 ml PBS, um die Chipkarten für 5 min bei 300 g waschen und saugen, Zentrifuge. Wenn die Chipkarten gehen in Paraffin eingebettet werden, folgen Sie bitte Fakultativprotokoll 3,1-3,17 Für adhärenten Zellen:. Entfernen Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit PBS wie oben beschrieben. Fix-Zellen für 20 min mit 4% PFA bei RT, dann zweimal mit PBS waschen. An diesem Punkt können die Platten mit Parafilm eingewickelt und in PBS bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert werden.
- Inkubieren der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min bei RT. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und gelten Blockierungspuffer (2% tunNTaste Serum, 2% Rinderserumalbumin, 50 mM Glycin in PBS) für 1 h verdünnt. Waschen Sie die Zellen mit Arbeitspuffer (Blockierungspuffer verdünnt 1:10). Verdünnen Sie die Antikörper in Arbeitspuffer. Für Zellen auf Deckgläschen gewachsen, verdünnte den Antikörper in 60 ul Gesamtvolumen. Für Zellen in einer 6-Well-Platte verdünnt man das Antikörper in 600 &mgr; l Gesamtvolumen. Um mehrere Epitope Fleck kann ein Cocktail aus Antikörpern angewendet werden. Als Kontrolle verwendet IgG oder vorgeImmunSerum anstelle des spezifischen Antikörpers. Kontrollproben sind mit Kontroll-IgG von derselben Spezies inkubiert, wie der primäre Antikörper verwendet werden.
- Inkubieren des primären Antikörpers entweder 1,5 h bei RT und O / N bei 4 ° C. Saugen Sie den primären Antikörper und 3x waschen mit Arbeitspuffer bei RT.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper bei 1:200 für Rhodamin und FITC konjugierte Antikörper, 1:500 - 1:1000 für die Alexa konjugierten Antikörpern. Es ist wichtig zu beachten, dass alle Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Decken Sie die ProbenAluminiumfolie, um den Verlust des Signals zu verhindern. Inkubation für 1 h bei RT.
Optional: Um die Kerne zu visualisieren, DAPI können 1:500 während der zweiten Inkubation hinzugefügt werden. Dies ist nützlich zur Quantifizierung der Proteinexpression in der gesamten Zellpopulation. - Saugen Sie den sekundären Antikörper und waschen 3x mit Arbeitspuffer bei RT. Für Zellen, die auf einem Deckglas aufgewachsen, heben das Deckglas mit einer Pinzette, während im Puffer eingetaucht; waschen Sie es durch das Eintauchen in PBS. Für Zellen in einer 6-Well-Platte gewachsen, fügen PBS zu waschen und absaugen. An diesem Punkt sind sie bereit, unter einem inversen Mikroskop zu untersuchen.
- Berühren Sie den Rand des Deckglases vorsichtig auf einer Kimwipe von überschüssigem PBS loszuwerden. Fügen Sie einen Tropfen Montage Gel auf einem Glasobjektträger und Deckglas invertieren die auf die Folie. Überschüssiges Montage Gel durch Aspiration. Tippen Sie auf das Deckglas vorsichtig mit der Rückseite einer 200 ul Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen.
- Trocken bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten oder O / N bei 4 ° C und untersuchen unter einem fluorescent oder konfokalen Mikroskop.
3. (Optional) Immunfluoreszenzfärbung von Proteinen aus Paraffin eingebettet ICCs
- Bereiten Sie einen 3% igen Lösung und abkühlen lassen auf 55-60 ° C
- Übertragung der ICCs in Suspension zu einer 15 ml konischen Röhrchen inkubiert und zentrifugiert bei 1500 g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie das Medium aus den Zellen und fixieren mit 500 ul 4% PFA für 10 min bei RT. Verwenden Sie nicht das Pellet, es sei denn, das Pellet ist sehr groß.
- Zweimal Waschen des Pellets mit 750 ul PBS. Wie die 4% PFA, werden diese Abfälle als gefährlich einzustufen und sollten gemäß den gefährlichen Abfällen Spezifikationen Ihrer Einrichtung entsorgt werden.
- Flick vorsichtig das Zellpellet nach unten die Wand der 15 ml konischen Röhrchen lösen und fügen 150-200 ul der Agarose.
- Mischen Sie durch leichtes Schwenken der Röhre, aber keine Blasen bilden.
- Lassen bei 4 ° C für 5-10 min verfestigt.
- Verwenden Sie eine 21 G Nadel zu verdrängenund das Pellet in ein frisches 15 ml konischen Röhrchen.
- Paraffineinbettung und die Vorbereitung der Abschnitte auf Objektträger können vor Ort mit Hilfe eines Mikrotoms oder durch Ihre Kern Mikroskopie Einrichtungen durchgeführt werden.
- Entparaffinieren Gewebe, Hydrat und mit Wasser schnell.
- Mit 0,2 M Glycin für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um das restliche Aldehydgruppen zu quenchen.
- Zweimal Waschen Sie die Objektträger mit PBS für 2 min je.
- Für Antigen-Retrieval, bringen 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) über Kochplatte zum Kochen bringen. Tauchen Sie die Folien in der Puffer, warten, bis es wieder zum Kochen zu kommen, und warten Sie 15 min.
- Das Becherglas von der Heizplatte. Wartezeit von ca. 40 min für die Folien, die im Puffer zu kühlen.
- Waschen Sie die Folien mit H 2 O für jeweils 5 Minuten, waschen Sie die Folien zweimal mit PBS für jeweils 5 min, blockieren mit 2% n Esel-Serum in PBS für 1 Stunde.
- Inkubieren mit primärem Antikörper, um die korrekte Konzentration im Arbeitspuffer, enthaltend 0,2% Triton X-100 verdünnt.Im allgemeinen wird der primäre Antikörper über Nacht inkubiert wenn Anfärben für Transkriptionsfaktoren und für 1,5 h bei Anfärbung für Hormone, Marker der Proliferation und / oder Differenzierung.
- Folgen Sie den Schritten 2,3-2,9 oben beschrieben.
Representative Results
Sorgfältige Vorbereitung der fetalen ICCs ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Repräsentative Bilder, wie die Zellen aussehen typischerweise in definierten Zeiträumen nach der Beschichtung sind in Abbildung 2 dargestellt. Nach der Reinigung werden die frisch vergoldet Zellaggregate erscheinen als kleine, karge klare Cluster, die wenigen Zellen (2A) enthalten. Nach der ersten 24 Stunden (2B), sind viele der Zellhaufen größer, aber zahlreiche kleine Cluster verbleiben. Nach 48 Stunden wurden die Cluster deutlich erweitert, bleiben aber asymmetrisch (Abbildung 2C). Nach 72 Stunden sollten die ICCs klar sein, relativ einheitliche Größe und Form (Abb. 2D). Es ist an dieser Stelle, dass die Zellen entweder auf Matrizen, wie HTB-9, 24 h vor der Immunfluoreszenz oder erlaubt, für weitere 72 h in Abwesenheit oder Gegenwart von Chemikalien oder Medikamente, die die Expression von Genen verändern können, wachsen plattierenden für endokrinen Pankreaszelle g erforderlicheneration. Abbildung 3 zeigt eine Reihe von häufig verwendeten Antikörper entweder ICC Proliferation oder Differenzierung in Richtung Pankreas Endoderm beurteilen. In 3A wurden ICCs an HTB-9 überzogen, für 4 Tage gezüchtet und für PDX1, einer kritischen Marker der Pankreasentwicklung gefärbt. Obwohl in vitro-Färbung von ICCs wird routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, häufiger menschlichen fötalen ICCs unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen transplantiert und erlaubt, zu proliferieren und zu differenzieren in vivo 6,9,30-32. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Transplantation werden die Mäuse getötet und die Nieren, die die transplantierten ICCs wird entfernt, in 4% Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Sequential 5 um Abschnitte werden entweder vor Ort mit Hilfe eines Mikrotoms oder durch einen Kern-Mikroskopie-Anlage erzeugt. Epitop-Demaskierung und Färbung von Proteinen aus Paraffin eingebetteten Gewebe für Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist in Fakultativprotokoll von 3,10 bis 3 beschrieben.. 17. In 3B wurden transplantiert ICCs mit der epithelialen Zellmarker Cytokeratin pan (PanCK, grün) gefärbt und mit Ki67 (rot), die Zellproliferation zu beurteilen. In einem anderen Beispiel wurden sowohl Humaninsulin (grün) und Glucagon (rot) nach der Transplantation und die Reifung unter die Nierenkapsel einer nackten Maus (3C) festgestellt.
Abbildung 1. Flussdiagramm des menschlichen fetalen ICC Vorbereitung und Färbung für Immunfluoreszenz.
2. Repräsentative fötalen ICCs Zubereitung 0, 24, 48 oder 72 Stunden nach dem Plattieren. (A) ICCsin Suspension wurden sofort nach der Plattierung abgebildet wird, (B) 24 Stunden nach der Plattierung, (C) 48 Stunden nach dem Ausstreichen oder (D) 72 Stunden nach dem Ausplattieren. Maßstab für AC, 10-facher Vergrößerung = 300 um, Maßstab für D, 20 Vergrößerung = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
.. (; Grün pan-CK) und Proliferation (Ki67, rot), (C) Insulin Abbildung 3 Immunfluoreszenz von plattierten ICCs Routinemäßig werden ICCs für (A) des Pankreas Endoderm PDX1 Marker (grün), (B) endokrinen Zellen abgebildet (grün) und Glukagon (rot). Maßstab für AC, 40-facher Vergrößerung = 20 um.
Discussion
Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen es, ICCs aus humanen fötalen Pankreas Bild und anschließend für Marker der Zellproliferation und der Bauchspeicheldrüse Endoderm zu erzeugen. Der Prozess der menschlichen fetalen Pankreas Dissoziation benötigt etwa 90 min, gefolgt von einem 72 Stunden Zeitraum ICC Bildung, einem Ansatz, der wesentlich von Protokollen β Zellvorläuferzellen aus der Maus zu isolieren ist. Die hier vorgestellte Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode, die die Forscher menschlichen fetalen Pankreas-Entwicklung zu erkunden. Zwei unterschiedliche Typen von Langzeitstudien durchgeführt werden. Erstens kann das Potential an funktionellen Pankreaszelltypen (Gangzellen exokrine Zellen und Hormon-positive Zellen) aus verschiedenen Schwangerschaftsstadien erzeugen nach der Transplantation geprüft. Zweitens kann ICCs aus einer Schwangerschaftsdauer in Kultur gezüchtet werden, mit ausgewählten pharmakologischen Mitteln behandelt und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur ICC transplantiert, um Unterschiede zu erforschenin Zellschicksal. Mit den enormen Anstrengungen derzeit auf hESC Differenzierung in Insulin produzierenden Zellen gerichtet sind, sind die Probleme mit der Insulin-Sekretion in Reaktion auf physiologische Reize assoziiert wieder neu belebt. Menschen ICCs bieten eine einzigartige Modellsystem, um diesen kritischen Aspekt der fetalen Pankreas-Zellproliferation und β-Zell-Entwicklung zu untersuchen.
Wie bei jedem Protokoll, um Zellen aus Geweben isolieren, Details sind entscheidend für den Erfolg. Eine Anzahl von Parametern sind leider nicht der Kontrolle des Laborpersonals Durchführung des Experiments. Zwei Probleme von diesem Labor gestoßen sind schlechte Qualität des Ausgangsmaterials und der Lieferung nicht Pankreasgewebe. Gesunde fetale Pankreasgewebe ist fest an einen Scherenschnitt. Wenn die Gewebeschnitte zu leicht, es ist ein Zeichen, dass die Enzyme der Bauchspeicheldrüse haben begonnen, die Bauchspeicheldrüse selbst verdauen. Von diesem gibt es leider keine Erholung und der Vorbereitung ist am besten aufgehoben. Selten wird ein inerfahrenen Techniker Entfernen der Bauchspeicheldrüse Abschnitte des Darms für die Bauchspeicheldrüse zu verwirren. Diese Proben werden viel mehr Elastizität als ein Bauchspeicheldrüse haben und eine bemerkenswerte Lumen wird anwesend sein. Auch hier sollten diese Proben verworfen werden.
Wenn das Protokoll oben wie beschrieben gefolgt, gibt es nur selten alle Probleme, die die Isolation aus der Bahn werfen entstehen. Ein paar Punkte zu beachten, um einen reibungslosen Isolation zu gewährleisten sind, um scharfe Schere für präzisen Schneid Bauchspeicheldrüse zu verwenden und sicherzustellen, dass jede Gewebeprobe zu groß, um zu verdauen nicht verlassen. Wenn die Schnitte sind nicht klein genug ist, dann ist die Kollagenase nicht effizient arbeitet, und nur wenige ICCs gebildet werden. Umgekehrt, wenn Sie eine neue Charge von Kollagenase, mit einem ähnlichen Niveau zu starten, wenn IE (Internationale Einheiten) für die Verdauung wie zuvor verwendet. Jedoch verringern die Inkubationszeit, um sicherzustellen, dass über die Verdauung nicht auftritt. Diese Fehler Technik stellt sicher, dass die IU-Label nicht signifikant variieren von Charge zu batch.
In der Perspektive genommen, ist diese Technik für die Isolierung von humanen fötalen ICCs im Bereich relativ Standard. Die meisten Labors bestätigt unsere Ergebnisse, dass die Zugabe von HGF an die Medien hilft den Zellen überleben und sich vermehren 33. Zusammenfassend haben wir eine Methode, um menschliche fötale ICCs frischen Pankreas mit Schwangerschafts Alter von 9 bis 23 Wochen zu isolieren entwickelt. Die Zellen als Monoschicht oder in Suspension für Experimente zur endokrinen Pankreastranskriptionsfaktoren und Humaninsulin visualisieren gezüchtet werden.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) und dem NIH (DK54441) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
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