अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल, मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं से व्युत्पन्न संस्कृति, और छवि आइलेट सेल समूहों (ICC देखने) में वर्णित है. विधि ऊतक, संस्कृति monolayers के रूप में या समुच्चय के रूप में निलंबन में, और प्रसार के मार्कर और अग्नाशय सेल भाग्य के फैसले के लिए छवि से ICC देखने उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम विवरण देता है.
लगभग 30 वर्षों के लिए, वैज्ञानिकों ग्लूकोज उत्तेजना 1-9 निम्नलिखित मानव सी पेप्टाइड प्रचलन में उल्लेखनीय वृद्धि के सबूत के रूप नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपित मानव भ्रूण ICC देखने, अंत: स्रावी कोशिकाओं कामकाज में परिपक्व हो कि प्रदर्शन किया है. हालांकि इन विट्रो में, मानव भ्रूण ICC देखने से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं की उत्पत्ति कम 10 है; मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) के साथ प्रदर्शन किया हाल के प्रयोगों की याद ताजा परिणाम, टाइप 1 मधुमेह के लिए एक संभावित चिकित्सीय उपचार के रूप में महान वादा पकड़ कि कोशिकाओं का एक अक्षय स्रोत है. ICC देखने की तरह, आंशिक रूप से भेदभाव कर hESC का प्रत्यारोपण ग्लूकोज उत्तरदायी, इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न, लेकिन hESC से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं की इन विट्रो उत्पत्ति में बहुत कम मजबूत 11-17 है. अंत: स्रावी अग्रदूत साबित कोशिकाओं के विकास और भेदभाव को प्रभावित करने वाले कारकों की एक पूरी समझ होने की संभावना डेटा ICC देखने और वह दोनों से उत्पन्न की आवश्यकता होगीअनुसूचित जाति. प्रोटोकॉल के एक नंबर के लिए इन विट्रो 11-22, ICC देखने 10,23,24 के लिए अब तक कम अस्तित्व में hESC से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए मौजूद हैं. कि विसंगति का हिस्सा होने की संभावना मानव भ्रूण अग्न्याशय के साथ काम करने की कठिनाई से आता है. कि अंत में हम लेकर गर्भावधि उम्र के साथ मानव pancreases से भ्रूण टापू अलग करने के लिए मौजूदा तरीकों पर निर्माण जारी रखा है 12 से 23 सप्ताह से, एक monolayer के रूप में या निलंबन में कोशिकाओं के विकास, और सेल प्रसार, अग्नाशय मार्करों और मानव हार्मोन के लिए छवि ग्लूकागन और सी पेप्टाइड सहित. ICC देखने ताजा ऊतक 6 के प्रत्यारोपण द्वारा प्राप्त सी पेप्टाइड के स्तर के समान हैं कि नग्न चूहों के गुर्दे कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपण के बाद सी पेप्टाइड रिहाई में परिणाम नीचे वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न. यहाँ प्रस्तुत उदाहरण अग्नाशय अन्तर्जनस्तर प्रसार और β सेल उत्पत्ति पर ध्यान केंद्रित हालांकि, प्रोटोकॉल अग्नाशय के विकास के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, बहि, वाहिनीपरक, और अन्य हार्मोन का उत्पादन कोशिकाओं सहित.
टाइप 1 मधुमेह में सेल आधारित इंसुलिन प्रतिस्थापन उपचार के लिए एक प्राथमिक सीमा प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध मानव islets की कमी है. एक इंसुलिन की कमी राज्य की चयापचय की मांग को पूरा करने वाले इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में मानव अग्नाशय के अग्रदूत साबित कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव को विनियमित करने की क्षमता टाइप 1 मधुमेह के इलाज के लिए एक सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण इमारत ब्लॉक बनी हुई है.
HESC व्युत्पन्न इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं, मानव भ्रूण अग्नाशय के अंत: स्रावी कोशिकाओं या उनके पूर्ववर्ती के आगमन के नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं के संभावित स्रोतों के रूप में देखा गया है जब तक. वैज्ञानिक और विनियामक परिदृश्य पिछले कुछ वर्षों में बदल गया है, मानव भ्रूण अग्न्याशय विकसित करता है समझने के लिए कैसे एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बनी हुई है. कई अब कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए प्रभावी और सुरक्षित तरीके स्थापित किए गए थे, तो संभावना नहीं है, हालांकि, इन कोशिकाओं के चिकित्सीय उपयोग एजी सकता के रूप में मानव भ्रूण कोशिकाओं की चिकित्सकीय प्रयोग देखनेपता लगाया जा ऐन. बनी हुई है कि एक प्रमुख बाधा उत्तरदायी ग्लूकोज में मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं समुच्चय (ICC देखने) के इन विट्रो परिवर्तन में, अंत: स्रावी कोशिकाओं स्रावित इंसुलिन वर्तमान में एक अकुशल प्रक्रिया है. ज्यादा काम पर लगभग 30 साल elucidated और अंत: स्रावी अग्न्याशय के विकास के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल चित्रित किया गया है, अंतराल प्रतिलेखन कारक के अस्थायी अभिव्यक्ति विनियमित और सेल समारोह से संबंधित है के बारे में हमारे ज्ञान में वहाँ रहते हैं.
HESC व्युत्पन्न इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं, मानव भ्रूण अग्नाशय के अंत: स्रावी कोशिकाओं या उनके पूर्ववर्ती के आगमन के नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं के संभावित स्रोतों के रूप में देखा गया है जब तक. वैज्ञानिक और विनियामक परिदृश्य पिछले कुछ वर्षों में बदल गया है, मानव भ्रूण अग्न्याशय विकसित करता है समझने के लिए कैसे एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बनी हुई है. कई अब, लेकिन अगर प्रभावी संभावना नहीं के रूप में मानव भ्रूण कोशिकाओं की चिकित्सकीय प्रयोग देखनेऔर कोशिकाओं स्थापित किए गए थे विस्तार करने के लिए सुरक्षित तरीके, इन कोशिकाओं के चिकित्सीय उपयोग फिर से पता लगाया जा सकता है. बनी हुई है कि एक प्रमुख बाधा उत्तरदायी ग्लूकोज में मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं समुच्चय (ICC देखने) के इन विट्रो परिवर्तन में, अंत: स्रावी कोशिकाओं स्रावित इंसुलिन वर्तमान में एक अकुशल प्रक्रिया है. ज्यादा काम पर लगभग 30 साल elucidated और अंत: स्रावी अग्न्याशय के विकास के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल चित्रित किया गया है, अंतराल प्रतिलेखन कारक के अस्थायी अभिव्यक्ति विनियमित और सेल समारोह से संबंधित है के बारे में हमारे ज्ञान में वहाँ रहते हैं.
हाल ही में, स्टेम सेल के क्षेत्र परिपक्व अंत: स्रावी कोशिकाओं के मार्कर व्यक्त कि कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए ड्राइव आइलेट विकास के दौरान अस्थायी प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के बारे में संचित ज्ञान कार्यरत है. HESC और प्रेरित pluripotent कोशिकाओं (iPSC) से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं की उत्पत्ति पर्याप्त बनाया गया है और यद्यपि- एक तथाकथित "ब्लैक बॉक्स 2 द्वारा पीछा अग्नाशय के अग्रदूत प्रतिलेखन कारक,) प्रत्यारोपण के बाद में विवो परिपक्वता व्यक्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 1) एक प्रारंभिक इन विट्रो भेदभाव: पिछले कुछ वर्षों में उल्लेखनीय प्रगति की है, सबसे प्रभावी प्रोटोकॉल दो अलग भेदभाव चरणों की आवश्यकता "अवधि. आगे बढ़ने के लिए, चाहे सेल स्रोत के बावजूद, एक जैव रासायनिक स्तर पर समझा जाना चाहिए, vivo में जीव विज्ञान अंतर्निहित आइलेट परिपक्वता को समझने में अग्रिम. ICC देखने और hESC साथ प्राप्त परिणामों के बीच समानता विट्रो में परिपक्व, ग्लूकोज उत्तरदायी, इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं में मानव अग्नाशय के अग्रदूत साबित कोशिकाओं के संक्रमण को नियंत्रित करने वाले महत्वपूर्ण जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के एक नंबर अनजान रहते हैं कि पता चलता है. इस समझ के एक केंद्रीय हिस्सा अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं से कार्यात्मक अंत: स्रावी सेल आबादी प्राप्त करने के लिए उपन्यास तरीके विकसित करने के लिए किया जाएगा और hESC जैव रासायनिक appr न केवल आवश्यकता होगीपरिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए परिपक्वता की घटनाओं, लेकिन तरीकों को स्पष्ट है कि oaches.
क्यों हम मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं इमेजिंग आइलेट परिपक्वता में परिवर्तन की पहचान का एक महत्वपूर्ण पहलू है कि विश्वास करते हो? जवाब इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए ऐतिहासिक खोज में आंशिक रूप से निहित है. अग्नाशय के व्यापारियों और islets के लिए मॉडल और ऊतक संस्कृति सिस्टम दोनों शोधकर्ताओं ने इन विट्रो में पशु टापू और मानव islets की परिपक्वता के बीच विद्यमान महत्वपूर्ण मतभेदों का पता लगाने के लिए अनुमति दी है. मानव भ्रूण अग्न्याशय विकास का अन्वेषण करने के लिए एक सीमा है कि कानूनी तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि गर्भावधि उम्र केवल विषम सेल समुच्चय को जन्म दे रहा है. पृथक भ्रूण मानव कोशिकाओं टापू, धुंधला गर्भावधि उम्र 9-23 हफ्तों से इन विट्रो संस्कृति के बाद कम से कम 15% सबसे कोशिकाओं आइलेट हार्मोन के लिए धुंधला हो जाना नहीं के साथ, अंत: स्रावी कोशिकाओं के लिए मार्कर होते हैं पता चलता है जैसे लगते हैं. हालांकि, प्रत्यारोपण के बाद और मेंपरिपक्वता vivo, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या को अंत: स्रावी मार्करों 6,25 व्यक्त करते हैं. इन अध्ययनों से परिणाम में इन विट्रो भेदभाव के बाद हार्मोन सकारात्मक कोशिकाओं की आबादी बढ़ाने के लिए. इन विट्रो विधियों की संभावना में विवो आइलेट में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा केवल एक हार्मोन सकारात्मक अंत: स्रावी कोशिकाओं की मामूली आबादी उत्पन्न करने में सक्षम हैं कि hESC भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ आज प्रतिध्वनित किया जा रहा है परिपक्वता. इसके अलावा, मानव भ्रूण अग्नाशय के विकास ड्राइव कि आणविक घटनाओं को समझने की संभावना hESC से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं निकाले जाते हैं और आगे β सेल पुनर्जनन और अग्नाशय सेल transdifferentiation कि विनियमित तंत्र को चित्रित करने के प्रयासों में सुधार होगा.
मानव भ्रूण अग्नाशय सेल और hESC परिपक्वता के बीच समानता सेल समारोह के लिए बढ़ाया जा सकता है. Murine कोशिकाओं की तरह, मानव भ्रूण कोशिकाओं और विभेदित hESC दोनों ग्लूकोज के जवाब में इंसुलिन रिलीज करने में असमर्थ हैंइन विट्रो 26,27 में आइलेट neoformation के बाद. हालांकि, नग्न चूहों और परिपक्वता, दोनों मानव आइलेट की तरह समूहों और hESC प्रदर्शनी एक endocrine फेनोटाइप से व्युत्पन्न इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में प्रत्यारोपण पर. तीन महीने ग्राफ्टिंग के बाद, आबादी या तो से प्रतिरोपित कोशिकाओं का लगभग 90% इंसुलिन सकारात्मक रहे हैं, और सी पेप्टाइड 17,26 की रिहाई के द्वारा निर्धारित रूप में सामान्य रूप से कार्य करते हैं. इन परिणामों प्रत्यारोपण आइलेट परिपक्वता को बढ़ावा देने कि संदर्भ और अज्ञात cues प्रदान करता है कि संकेत मिलता है. ऐसे मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं परिपक्वता मिलाना और तेजी लाने के कारकों की पहचान करने के लिए खोज में सहायता करेगा के लिए, यहाँ वर्णित एक के रूप में अनुकूलित इमेजिंग प्रोटोकॉल,. विकास के इस स्तर पर एक अंत: स्रावी वंश के प्रति भेदभाव मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं और hESC के मौलिक जैव रासायनिक अन्वेषण परिपक्वता की दक्षता मापने के लिए आवश्यक है.
Figur में उल्लिखित निम्नलिखित प्रोटोकॉल,ई 1, इन कोशिकाओं के पूरे मानव भ्रूण अग्न्याशय और इमेजिंग से ICC देखने बुलाया मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं के अलगाव के लिए हमारे वर्तमान तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल बाद में एक monolayer के रूप में या निलंबन में उगाया जा सकता है जो ऊतकों से कोशिकाओं का एक प्रारंभिक तैयारी की आवश्यकता है. अंत: स्रावी सेल प्रसार और परिपक्वता का आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्करों की इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी में वर्णित है.
रासायनिक संशोधित एजेंटों की एक किस्म की अनुपस्थिति या उपस्थिति में जनरेशन और ICC देखने के इमेजिंग संस्कृति की स्थिति और पूरी तरह कार्यात्मक बहि, वाहिनीपरक, या में मानव भ्रूण अग्नाशय कोशिकाओं की परिपक्वता में तेजी लाने कि यौगिकों की पहचान में मदद करने के प्रत्यारोपण के मॉडल के साथ तुलना में एक तेजी से विधि प्रदान करता है हार्मोन अग्नाशय कोशिकाओं का निर्माण किया.
यहाँ प्रस्तुत तरीकों सेल प्रसार और अग्नाशय अन्तर्जनस्तर के मार्कर के लिए मानव भ्रूण अग्न्याशय और बाद में छवि से ICC देखने उत्पन्न करने के लिए एक सक्षम. मानव भ्रूण अग्न्याशय हदबंदी की प्रक्रिया एक 72 घंटा आईसीसी गठन अवधि, माउस से β सेल पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल से काफी अलग है कि एक दृष्टिकोण के द्वारा पीछा किया, के बारे में 90 मिनट की आवश्यकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल शोधकर्ता मानव भ्रूण अग्नाशय के विकास का पता लगाने के लिए अनुमति देता है एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने तरीका प्रदान करता है. अनुदैर्ध्य अध्ययन के दो विभिन्न प्रकार किया जा सकता है. सबसे पहले, अलग गर्भावधि उम्र से कार्यात्मक अग्नाशय प्रकार की कोशिकाओं (वाहिनीपरक कोशिकाओं, बहि कोशिकाओं, और हार्मोन सकारात्मक कोशिकाओं) उत्पन्न करने की क्षमता प्रत्यारोपण के बाद मूल्यांकन किया जा सकता. दूसरा, एक एकल गर्भावधि उम्र से ICC देखने, संस्कृति में विकसित चयनित औषधीय एजेंटों के साथ इलाज किया और मतभेदों का पता लगाने के लिए आईसीसी संस्कृति के दौरान अलग अलग समय बिंदुओं पर प्रत्यारोपित किया जा सकता हैसेल भाग्य में. वर्तमान में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं में hESC भेदभाव के निर्देश पर किया जा रहा है जबरदस्त प्रयासों के साथ, शारीरिक उत्तेजनाओं के जवाब में इंसुलिन स्राव से संबंधित समस्याओं को फिर से पुनर्जीवित किया जा रहा है. मानव ICC देखने भ्रूण अग्न्याशय सेल प्रसार और β सेल के विकास के इस महत्वपूर्ण पहलू का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.
ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किसी भी प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, विवरण सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. मानकों के एक नंबर प्रयोग का प्रदर्शन प्रयोगशाला कर्मियों के नियंत्रण से बाहर दुर्भाग्य से कर रहे हैं. इस प्रयोगशाला द्वारा सामना करना पड़ा दो समस्याओं गरीब प्रारंभिक सामग्री की गुणवत्ता और गैर अग्नाशय के ऊतकों का वितरण शामिल है. स्वस्थ भ्रूण अग्नाशय के ऊतकों एक कैंची काटने के लिए फर्म है. ऊतक में कटौती भी आसानी से करते हैं, तो यह अग्नाशय एंजाइमों अग्न्याशय खुद को पचाने के लिए शुरू कर दिया है कि एक संकेत है. इस से वहाँ कोई वसूली दुर्भाग्य है और तैयारी सर्वश्रेष्ठ रद्द कर दिया है. कभी कभी, एक मेंअग्न्याशय हटाने अनुभवी तकनीशियन अग्न्याशय के लिए पेट के वर्गों को भ्रमित करेंगे. इन नमूनों को एक अग्न्याशय की तुलना में काफी अधिक लोच है और एक उल्लेखनीय लुमेन उपस्थित रहेंगे. फिर, इन नमूनों खारिज किया जाना चाहिए.
के रूप में वर्णित ऊपर प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है, तो ट्रैक से अलगाव फेंक करने के लिए उठता है कि किसी भी मुद्दे को शायद ही कभी रहे हैं. एक चिकनी अलगाव सुनिश्चित करने के लिए याद करने के लिए कुछ बिंदुओं सटीक अग्न्याशय काटने के लिए तेज कैंची का उपयोग करने के लिए और पचाने के लिए बहुत बड़ी किसी भी ऊतक का नमूना नहीं छोड़ कर सुनिश्चित करना शामिल है. कटौती काफी छोटा नहीं कर रहे हैं, तो collagenase प्रभावी ढंग से काम नहीं करता है, और कुछ ICC देखने का गठन कर रहे हैं. Collagenase के एक नए बैच का उपयोग करते समय पाचन के लिए आइयू (अंतरराष्ट्रीय इकाइयों) पहले से इस्तेमाल के रूप में इसके विपरीत, यदि एक समान स्तर के साथ शुरू करते हैं. हालांकि, पर पाचन उत्पन्न नहीं होती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ऊष्मायन समय कम. यह समस्या निवारण तकनीक आइयू लेबल बैच से बीए करने के लिए काफी भिन्न नहीं है कि यह सुनिश्चित करता हैदर्पण.
परिप्रेक्ष्य में लिया, मानव भ्रूण ICC देखने के अलगाव के लिए इस तकनीक के क्षेत्र में अपेक्षाकृत मानक है. अधिकांश प्रयोगशालाओं मीडिया को HGF के अलावा कोशिकाओं 33 जीवित है और पैदा करना मदद करता है कि हमारे निष्कर्ष की पुष्टि की. संक्षेप में, हम 9 से 23 सप्ताह से लेकर गर्भावधि उम्र के साथ मानव भ्रूण ICC देखने ताजा pancreata अलग करने के लिए एक विधि विकसित की है. कोशिकाओं अग्नाशय के अंत: स्रावी प्रतिलेखन कारक और मानव इंसुलिन कल्पना करने के लिए एक monolayer या प्रयोगों के लिए निलंबन के रूप में विकसित किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम रिजनरेटिव मेडिसिन (RB3-02266) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट और एनआईएच (DK54441) द्वारा समर्थित किया गया.
Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
1M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
Penicillin – Streptomycin 100X Solution | Life Technologies | 15070063 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
Dnase | Sigma | DN25 | |
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
PBS | Gibco | 14190 | |
16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) | Sigma | I2018 | |
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) | Sigma | G2654 | |
PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
AlexaFluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
AlexaFluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
AlexaFluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
AlexaFluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
Agarose | Sigma | A-6013 |