Ett protokoll för att isolera, kultur, och bild holme cell kluster (ICCS) som härrör från mänskliga foster pankreasceller beskrivs. Metoden beskrivs de åtgärder som krävs för att generera ICCs från vävnad, kultur som monolager eller i suspension som aggregat, och bilden för markörer för proliferation och pankreas cell öde beslut.
I nästan 30 år har forskare visat att humana fetala ICCs transplanterade under njurkapseln i nakna möss mognat till fungerande endokrina celler, vilket framgår av en betydande ökning av cirkulerande human C-peptid efter glukosstimulering 1-9. Men in vitro är låg 10 uppkomsten av insulinproducerande celler från mänskliga foster ICCs; resultat som påminner om de senaste experiment utförda med mänskliga embryonala stamceller (hESC), en förnybar celler som håller stort löfte som en potentiell terapeutisk behandling för typ 1-diabetes. Som ICCs, transplantation av delvis differentierade hESC genererar glukos lyhörd, insulinproducerande celler, men in vitro uppkomsten av insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon är mycket mindre robust 11-17. En fullständig förståelse av de faktorer som påverkar tillväxt och differentiering av endokrina prekursorceller kommer sannolikt att kräva uppgifter som genereras från både ICCs och HESC. Medan ett antal protokoll existerar för att generera insulinproducerande celler från hESC in vitro 11 till 22, mycket färre existera för ICCs 10,23,24. En del av denna diskrepans sannolikt kommer från svårigheten att arbeta med mänskliga foster bukspottkörteln. Mot detta syfte har vi fortsatt att bygga vidare på befintliga metoder för att isolera foster holmar från mänskliga pancreases med gestational åldrar 12-23 veckor, odla cellerna som ett monolager eller i suspension, och bilden för celltillväxt, pankreas markörer och mänskliga hormoner däribland glukagon och C-peptid. ICCs genereras av protokollet beskrivet nedan i C-peptid frisättning efter transplantation under njurkapseln hos nakna möss som liknar C-peptidnivåer som erhållits genom transplantation av färsk vävnad 6. Även om de exempel som presenteras här fokuserar på den pankreatiska endoderm proliferation och β-cell genes kan protokollet användas för att studera andra aspekter av pankreatisk utveckling, Inklusive exokrin, duktal, och andra hormonproducerande celler.
En primär begränsning till cellbaserade insulinersättningsterapier i typ 1-diabetes är bristen på mänskliga holmar tillgängliga för transplantation. Förmågan att reglera proliferationen och differentieringen av humana pankreatiska prekursorceller till insulinproducerande celler som uppfyller de metaboliska kraven på en insulinbristtillstånd förblir en kritisk byggsten för en cellbaserad terapi för att behandla typ 1-diabetes.
Fram till tillkomsten av stamceller från mänskliga embryon härledda insulinproducerande celler, humana fetala pankreas endokrina celler eller deras föregångare betraktades som potentiella källor till celler för klinisk transplantation. Även om den vetenskapliga och rättsliga landskapet har förändrats under de senaste åren, finns det fortfarande ett stort behov för att förstå hur den mänskliga foster bukspottkörteln utvecklas. Många visa nu terapeutisk användning av mänskliga fosterceller som osannolikt, men om effektiva och säkra metoder för att expandera cellerna etablerades, terapeutisk användning av dessa celler kunde agAin utforskas. Ett stort hinder som återstår är att in vitro transformation av humana fetala pankreasceller aggregat (ICCS) till glukos lyhörd, är insulinproducerande endokrina celler närvarande en ineffektiv process. Även om mycket arbete under nästan 30 år har klarlagts och avgränsas uttrycksprofilen av transkriptionsfaktorer som krävs för utvecklingen av endokrina pankreas, finns det fortfarande luckor i vår kunskap om hur tidsmässiga uttryck av transkriptionsfaktorer är reglerad och relateras till cellernas funktion.
Fram till tillkomsten av stamceller från mänskliga embryon härledda insulinproducerande celler, humana fetala pankreas endokrina celler eller deras föregångare betraktades som potentiella källor till celler för klinisk transplantation. Även om den vetenskapliga och rättsliga landskapet har förändrats under de senaste åren, finns det fortfarande ett stort behov för att förstå hur den mänskliga foster bukspottkörteln utvecklas. Många visa nu terapeutisk användning av mänskliga fosterceller som osannolikt, men om effektivoch säkra metoder för att expandera cellerna etablerades, terapeutisk användning av dessa celler kunde återigen undersökas. Ett stort hinder som återstår är att in vitro transformation av humana fetala pankreasceller aggregat (ICCS) till glukos lyhörd, är insulinproducerande endokrina celler närvarande en ineffektiv process. Även om mycket arbete under nästan 30 år har klarlagts och avgränsas uttrycksprofilen av transkriptionsfaktorer som krävs för utvecklingen av endokrina pankreas, finns det fortfarande luckor i vår kunskap om hur tidsmässiga uttryck av transkriptionsfaktorer är reglerad och relateras till cellernas funktion.
Nyligen har stamcellsfältet används den ackumulerade kunskapen om tidstranskriptionsfaktor uttryck under holme utveckling för att driva produktionen av celler som uttrycker markörer för mogna endokrina celler. Även uppkomst av insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon och inducerade pluripotenta celler (iPSC) har gjort betydande ochbetydande framsteg under de senaste åren, de mest effektiva protokoll kräver två olika differentierings faser: 1) en tidig in vitro differentiering för att generera celler som uttrycker bukspottkörtel gångare transkriptionsfaktorer, följt av 2) in vivo-mognad efter transplantation – en så kallad "black box "period. För att flytta framåt, framsteg i att förstå biologi underliggande holmen mognad in vivo, oavsett cellkälla, måste förstås på en biokemisk nivå. Likheten mellan de resultat som erhållits med ICCs och hESC tyder på att ett antal kritiska biokemiska processer som reglerar övergången av humana pankreas prekursorceller till mogna, glukos lyhörd, insulinproducerande celler in vitro är fortfarande okända. En central del i denna överenskommelse är att utveckla nya metoder för att få fram fungerande endokrina cellpopulationer från pankreas progenitorceller och stamceller från mänskliga embryon kommer att kräva inte bara biokemisk caoaches som belyser mognadshändelser, men metoder för att analysera förändringarna.
Varför tror vi att avbilda humana fetala celler i bukspottkörteln är en viktig aspekt för att identifiera förändringar i holme mognad? Svaret ligger delvis i den historiska strävan att skapa insulinproducerande celler. Både modellen och vävnadskultursystem för pankreas prekursorer och holmar har låtit forskare att utforska de stora skillnader som finns mellan mognaden av djur holmar och humana öar in vitro. En begränsning till utforskandet av människans foster bukspottkörteln utveckling är att de gestational åldrar som lagligen får användas ger endast upphov till heterogena cellaggregat. Även de isolerade fetala mänskliga celler liknar holmar, färgning efter in vitro-kultur från graviditets åldrarna 9-23 veckor avslöjar mindre än 15% innehåller markörer för endokrina celler, med de flesta celler som inte färgning för holme hormoner. Emellertid efter transplantation och vidvivo mognad, en stor majoritet av celler uttrycker endokrina markörer 6,25. Resultaten från dessa studier genom ekade i dag med hESC differentieringsprotokoll som endast kan generera små populationer av enstaka hormon positiva endokrina celler efter in vitro differentiering. In vitro-metoder för att förbättra populationer av hormon positiva celler kommer sannolikt att ge insikt i in vivo-holme mognad. Dessutom förstå de molekylära händelser som driver mänsklig fosterpankreas utveckling kommer sannolikt att förbättra arbetet med att härleda insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon och ytterligare avgränsa de mekanismer som reglerar β cellförnyelsen och pankreascelltransdifferentiering.
Likheterna mellan human fetal pankreatisk cell och hESC mognad kan utvidgas till cellfunktion. Liksom murina celler, både humana fetala celler och differentierade hESC är oförmögna att frisätta insulin som svar på glukosefter holme nybildning in vitro 26,27. Men efter transplantation in i nakna möss och mognad, både mänskliga holme-liknande kluster och insulinproducerande celler från stamceller från mänskliga embryon uppvisar en endokrin fenotyp. Tre månader efter transplantation, nästan 90% av de transplanterade cellerna från antingen befolkningen är insulin positiva, och fungera normalt bestämt med lanseringen av C-peptid 17,26. Dessa resultat tyder på att transplantation ger sammanhang och oidentifierade signaler som främjar holme mognad. Optimerad avbildningsprotokoll som den som beskrivs här, för humana fetala pankreasceller kommer att hjälpa till i sökandet för att identifiera faktorer som modulerar och påskynda mognad. Grundläggande biokemiska utforskning av humana fetala pankreasceller och stamceller från mänskliga embryon differentierade mot en endokrin härstamning i detta skede av utveckling är avgörande för att mäta effektiviteten av mognad.
Följande protokoll, som beskrivs i Figure 1, ger vår nuvarande metod för isolering av humana fetala pankreasceller, som kallas ICCs från hela den mänskliga foster bukspottkörteln och avbildning av dessa celler. Detta protokoll kräver en initial beredning av celler från vävnad, som därefter kan odlas som ett monoskikt eller i suspension. Beredning av celler för avbildning av vanliga markörer för endokrin celltillväxt och mognad beskrivs.
Generering och avbildning av ICCs i frånvaro eller närvaro av en mängd olika kemiska modifieringsmedel ger en snabb metod, jämfört med transplantationsmodeller för att identifiera odlingsbetingelser och föreningar som påskyndar mognaden av humana fetala bukspottkörtelceller i fullt fungerande exokrin, duktal, eller hormonproducerande celler i bukspottkörteln.
De metoder som presenteras här möjliggör en att generera ICCs från mänskliga foster bukspottkörteln och därefter bild för markörer för celltillväxt och pankreas endoderm. Processen för mänskliga foster bukspottkörteln dissociation krävs ca 90 min, följt av en 72 hr ICC bildningsperiod, en strategi som skiljer sig avsevärt från protokoll för att isolera β cell stamceller från mus. Protokollet som presenteras här ger en reproducerbar metod som gör det möjligt för forskare att undersöka human fetal pankreatisk utveckling. Två olika typer av longitudinella studier kan utföras. För det första kan den potential att generera funktionella pankreascelltyper (duktal celler, exokrina celler, och hormon positiva celler) från olika gestational åldrar bedömas efter transplantation. För det andra kan ICCs från en enda gestationsålder odlas i kultur, behandlades med utvalda farmakologiska medel och transplanteras vid olika tidpunkter under ICC-kultur för att utforska skillnadernai cell öde. Med de enorma ansträngningar som för närvarande riktas mot hESC differentiering till insulinproducerande celler, är problemen med insulinutsöndring som svar på fysiologiska stimuli igen återupplivas. Mänskliga ICCs ger ett unikt modellsystem för att studera denna kritiska aspekten av foster bukspottkörteln celltillväxt och β cellutveckling.
Som med alla protokoll för att isolera celler från vävnader, detaljer är avgörande för framgång. Ett antal parametrar finns tyvärr utanför kontroll av den laboratoriepersonal som utför experimentet. Två problem som detta laboratorium inkluderar dålig kvalitet på utgångsmaterial och tillhandahållande av icke-pankreatisk vävnad. Friska foster pankreasvävnad är fast till en sax klippa. Om styckningsdelar, vävnads för lätt, är det ett tecken på att de pankreasenzymer har börjat smälta bukspottkörteln själv. Från detta finns det tyvärr ingen återhämtning och förberedelser är bäst avbryts. Sällan, en ierfaren tekniker att ta bort bukspottkörteln kommer att förvirra delar av tarmen för bukspottkörteln. Dessa prover kommer att ha mycket mer elasticitet än en bukspottkörtel och en anmärkningsvärd lumen kommer att närvara. Återigen bör dessa prover kasseras.
När protokollet ovan följs som beskrivs, det finns sällan några problem som uppstår för att kasta isoleringen ur spår. Några punkter att komma ihåg för att säkerställa en smidig isolering ingår, för att använda vass sax för exakt bukspottkörteln skärning och för att se till att inte lämna någon vävnadsprov för stor för att smälta. Om snitten inte är tillräckligt små, då kollagenas inte fungerar effektivt, och få ICCs bildas. Omvänt, när en ny kull av kollagenas, börja med en liknande nivå om IE (internationella enheter) för matsmältningen som tidigare använts. Emellertid minska inkubationstiden för att säkerställa att över matsmältningen inte sker. Denna felsökningsteknik säkerställer att IU etiketten inte varierar kraftigt från parti till batch.
Taget i perspektiv, är relativt vanlig denna teknik för isolering av humana fetala ICCs i fält. De flesta laboratorier bekräftade våra iakttagelser att tillägg av HGF till media hjälper cellerna att överleva och föröka sig 33. Sammanfattningsvis har vi utvecklat en metod för att isolera mänskliga foster ICCs frisk pancreata med gestational åldrar 9-23 veckor. Cellerna kan odlas som ett monolager eller i suspension för försök att visualisera pankreas endokrina transkriptionsfaktorer och humant insulin.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av California Institute för regenerativ medicin (RB3-02266) och NIH (DK54441).
Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
1M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
Penicillin – Streptomycin 100X Solution | Life Technologies | 15070063 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
Dnase | Sigma | DN25 | |
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
PBS | Gibco | 14190 | |
16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) | Sigma | I2018 | |
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) | Sigma | G2654 | |
PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
AlexaFluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
AlexaFluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
AlexaFluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
AlexaFluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
Agarose | Sigma | A-6013 |