En protokol til at isolere, er kultur og image ø-celle klynger (ICCS) afledt af humane føtale bugspytkirtelceller beskrevet. Metoden beskriver de er nødvendige for at generere ICC fra væv, kultur som monolag eller i suspension som aggregater, og image for markører af spredning og pancreas celle skæbne beslutninger trin.
For næsten 30 år har forskere vist, at humane føtale ICC'er transplanteret under nyrekapslen af nøgne mus modnet til fungerende endokrine celler, som det fremgår af en betydelig stigning i cirkulerende human C-peptid efter glukose stimulation 1-9. Men in vitro, tilblivelsen af insulinproducerende celler fra humane føtale ICC er lav 10; resultater, der minder om de seneste forsøg udført med menneskelige embryonale stamceller (hESC), en vedvarende celler, der holder meget lovende som en potentiel terapeutisk behandling for type 1-diabetes. Ligesom ICC, transplantation af delvist differentieret hESC generere glukose lydhør, insulinproducerende celler, men in vitro tilblivelsen af insulinproducerende celler fra embryonale er langt mindre robust 11-17. En fuldstændig forståelse af de faktorer, der påvirker vækst og differentiering af endokrine precursorceller vil sandsynligvis kræve data genereret fra både ICC og HESC. Mens en række protokoller eksisterer for at generere insulinproducerende celler fra embryonale in vitro 11-22, langt færre findes for ICC 10,23,24. En del af denne forskel sandsynligvis kommer fra vanskeligheden ved at arbejde med humane føtale bugspytkirtlen. Mod det formål har vi fortsat med at bygge videre på de eksisterende metoder til at isolere fosterceller holme fra menneskelige bugspytkirtel med svangerskabsuge aldre varierende fra 12 til 23 uger, vokser cellerne som et monolag eller i suspension, og image for celleproliferation, pancreas markører og menneskelige hormoner herunder glucagon og C-peptid. ICC genereret af nedenfor beskrevne protokol resulterer i C-peptid frigivelse efter transplantation under nyrekapsel af nøgne mus, der ligner C-peptid-niveauer opnået ved transplantation af frisk væv 6. Selvom eksemplerne her fokuserer på pancreas endoderm spredning og β celle tilblivelse, kan protokollen anvendes til at studere andre aspekter af bugspytkirtlen udvikling, Herunder eksokrine, duktale og andre hormon-producerende celler.
En primær begrænsning til cellebaserede insulin udskiftning behandlinger i type 1-diabetes er manglen på menneskelige holme til rådighed for transplantation. Evnen til at regulere proliferation og differentiering af humane pancreas præcursorceller i insulinproducerende celler, der opfylder de metaboliske krav fra en insulin-mangel tilstand er stadig et kritisk byggesten til en celle-baseret behandling til behandling af type 1 diabetes.
Indtil fremkomsten af embryonale afledt insulinproducerende celler, humane føtale pancreas endokrine celler eller deres forstadier blev betragtet som potentielle kilder til celler til klinisk transplantation. Selv om den videnskabelige og lovgivningsmæssige landskab har ændret sig i de seneste par år, er der stadig et afgørende behov for at forstå, hvordan den menneskelige føtal bugspytkirtlen udvikler sig. Mange nu se terapeutisk brug af menneskelige fosterceller som usandsynlig, men hvis effektive og sikre metoder til at udvide cellerne blev etableret, terapeutiske anvendelse af disse celler kunne again blive udforsket. En stor hurdle, der er tilbage er, at in vitro-transformation af humane føtale bugspytkirtelceller aggregater (ICCS) til glukose lydhør, insulinudskillende endokrine celler er i øjeblikket en ineffektiv proces. Selvom meget arbejde i løbet af næsten 30 år har belyst og afgrænset udtryk profilen af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for udviklingen af endokrine bugspytkirtel er der stadig huller i vores viden om, hvordan tidsmæssig udtryk for transkriptionsfaktorer er reguleret og relateret til celle funktion.
Indtil fremkomsten af embryonale afledt insulinproducerende celler, humane føtale pancreas endokrine celler eller deres forstadier blev betragtet som potentielle kilder til celler til klinisk transplantation. Selv om den videnskabelige og lovgivningsmæssige landskab har ændret sig i de seneste par år, er der stadig et afgørende behov for at forstå, hvordan den menneskelige føtal bugspytkirtlen udvikler sig. Mange nu se terapeutisk brug af menneskelige fosterceller som usandsynlig, men hvis effektivog sikre metoder til at udvide cellerne blev etableret, kan igen undersøges terapeutisk anvendelse af disse celler. En stor hurdle, der er tilbage er, at in vitro-transformation af humane føtale bugspytkirtelceller aggregater (ICCS) til glukose lydhør, insulinudskillende endokrine celler er i øjeblikket en ineffektiv proces. Selvom meget arbejde i løbet af næsten 30 år har belyst og afgrænset udtryk profilen af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for udviklingen af endokrine bugspytkirtel er der stadig huller i vores viden om, hvordan tidsmæssig udtryk for transkriptionsfaktorer er reguleret og relateret til celle funktion.
For nylig har inden stamceller anvendes den akkumulerede viden om tidsmæssig transkriptionsfaktor ekspression under ø udvikling til at drive produktion af celler, der udtrykker markører for modne endokrine celler. Selvom tilblivelse af insulinproducerende celler fra embryonale og inducerede pluripotente celler (IPSC) har gjort betydelige ogbetydelige fremskridt i de seneste par år, de mest effektive protokoller kræver to distinkte differentiering faser: 1) en tidlig in vitro differentiering til at generere celler, der udtrykker pancreas transskription forløber faktorer, efterfulgt af 2) in vivo modning efter transplantation – en såkaldt "black box "periode. For at komme videre, fremskridt i forståelsen af biologi underliggende holm modning in vivo, uanset cellekilde, skal forstås på et biokemisk niveau. Ligheden mellem de opnåede resultater med ICC og embryonale tyder på, at en række kritiske biokemiske processer, der regulerer overgangen af humane pancreas præcursorceller til modne, glucose lydhør, insulinudskillende celler in vitro forbliver ukendte. En central del af denne forståelse vil være at udvikle nye metoder til at udlede funktionelle endokrine cellepopulationer fra pancreasstamfaderceller og embryonale vil kræve ikke blot biokemisk caoaches der belyser modningen begivenheder, men metoder til at analysere ændringer.
Hvorfor tror vi, at billeddannelse humane føtale pancreas celler er et kritisk aspekt af at identificere ændringer i holmen modning? Svaret ligger delvist i den historiske søgen efter at generere insulinproducerende celler. Både model og vævs-kultur systemer for pancreas forstadier og holme har tilladt forskerne at udforske de betydelige forskelle, der eksisterer mellem modning af animalske holme og menneskelige holme in vitro. En begrænsning til udforskning af den menneskelige føtal bugspytkirtel udvikling er, at svangerskabsuge aldre, der lovligt kan anvendes kun giver anledning til heterogene celleaggregater. Selvom de isolerede føtale humane celler ligne holme, farvning efter in vitro kultur fra svangerskabsuge aldre 9-23 uger afslører mindre end 15% indeholder markører for endokrine celler, med de fleste celler ikke farvning for ø-hormoner. Men efter transplantation ogvivo modning, et stort flertal af celler udtrykker endokrine markører 6,25. Resultaterne fra disse undersøgelser er ved at blive gentaget i dag med embryonale differentiering protokoller, der kun er i stand til at generere beskedne bestande af enkelt hormon positive endokrine celler efter in vitro differentiering. In vitro metoder til at forbedre populationer af hormon positive celler vil sandsynligvis give indsigt i in vivo islet modning. Desuden at forstå de molekylære begivenheder, der driver den menneskelige føtal bugspytkirtlen udvikling vil sandsynligvis forbedre indsatsen for at udlede insulinproducerende celler fra embryonale og afgrænse de mekanismer, der regulerer β celle regenerering og pankreascelle transdifferentiation.
Lighederne mellem human føtal pankreascelle og embryonale modning kan udvides til cellefunktion. Ligesom murine celler, både humane føtale celler og differentierede embryonale er i stand til at frigive insulin som reaktion på glucoseefter ø neoformation in vitro 26,27. Men ved transplantation i nøgne mus og modning, både humane ø-lignende klynger og insulin-producerende celler afledt fra embryonale udviser en endokrin fænotype. Tre måneder efter podning, næsten 90% af de transplanterede celler fra enten befolkningen er insulin positive, og fungere normalt som bestemt af frigivelsen af C-peptid 17,26. Disse resultater indikerer, at transplantation giver kontekst og uidentificerede signaler, der fremmer ø modning. Optimeret imaging protokoller, såsom den er beskrevet her, for menneskerettighederne føtale bugspytkirtelceller vil støtte i søgningen til at identificere faktorer, der modulerer og fremskynde modning. Grundlæggende biokemisk udforskning af humane føtale pancreas celler og embryonale differentierede mod en endokrin afstamning i denne fase af udvikling er afgørende for at måle effektiviteten af modning.
Følgende protokol, som er skitseret i Figure1, giver vores nuværende metode til isolering af humane føtale pancreasceller, kaldet ICC fra hele human føtal bugspytkirtlen og billeddannelse af disse celler. Denne protokol kræver en indledende forberedelse af celler fra væv, som efterfølgende kan dyrkes som et monolag eller i suspension. Udarbejdelse af celler til billeddannelse af almindeligt anvendte markører for endokrin celledeling og modning er beskrevet.
Generation og billeddannelse af ICC i fraværet eller tilstedeværelsen af en række kemiske modificerende midler giver en hurtig metode, sammenlignet med transplantationsmodeller, at hjælpe med at identificere dyrkningsbetingelser og forbindelser, der fremskynder modning af humane føtale bugspytkirtlen celler i fuldt funktionel exokrint, duktalt, eller hormonproducerende pancreasceller.
De metoder, der præsenteres her, at man kan generere ICC fra humane føtale bugspytkirtel og efterfølgende billede for markører af celledeling og pancreas endoderm. Processen med human føtal pancreas dissociation kræves omkring 90 minutter, efterfulgt af en 72 timers ICC dannelse periode, en tilgang, der er væsentligt forskelligt fra protokoller til at isolere β celle stamceller fra mus. Protokollen præsenteres her tilvejebringer en reproducerbar metode, som gør det muligt for forskeren at undersøge human føtal pancreatisk udvikling. To forskellige typer af longitudinelle studier kan udføres. Først, kan den potentiale til at generere funktionelle pancreas celletyper (duktale celler, eksokrine celler og hormon positive celler) fra forskellige svangerskabsuge aldre vurderes efter transplantation. For det andet, kan ICC fra en enkelt gestationsalder dyrkes i kultur, behandlet med udvalgte farmakologiske midler og transplanteres på forskellige tidspunkter i løbet af ICC kultur at udforske forskellei celle skæbne. Med den store indsats i øjeblikket rettet mod embryonale differentiering til insulinproducerende celler er de problemer, der er forbundet med insulinsekretion som respons på fysiologiske stimuli igen blive genoplivet. Menneskelige ICC giver en unik model system til at studere denne kritiske aspekt af fosterets bugspytkirtel celledeling og β celle udvikling.
Som med enhver protokol til at isolere celler fra væv, detaljer er afgørende for succes. En række parametre er desværre uden for kontrol af laboratoriepersonale, der udfører eksperimentet. To problemer, som dette laboratorium omfatter dårlig kvalitet af udgangsmateriale og levering af ikke-bugspytkirtlen væv. Sund føtalt bugspytkirtlen væv er fast at en saks klippe. Hvis væv nedskæringer for let, er det et tegn på, at pancreas enzymer er begyndt at fordøje bugspytkirtlen selv. Fra dette er der desværre ingen nyttiggørelse og forberedelse er bedst annulleret. Sjældent, en ierfaren tekniker fjerne bugspytkirtlen vil forvirre dele af tarmen til bugspytkirtlen. Disse prøver har meget mere elasticitet end en bugspytkirtel og en bemærkelsesværdig lumen vil være til stede. Igen bør disse prøver kasseres.
Når ovenstående protokol følges som beskrevet, er der sjældent nogen problemer, der opstår at smide isolation af sporet. Et par punkter at huske at sikre en gnidningsløs isolation omfatter at bruge skarpe sakse til præcis bugspytkirtel opskæring og at sørge for at ikke efterlade nogen vævsprøve for stor til at fordøje. Såfremt udskæringer er ikke små nok, så collagenase ikke fungerer effektivt, og få ICC dannes. Omvendt, når du bruger et nyt parti af collagenase, starte med en tilsvarende niveau, hvis IE (internationale enheder) til fordøjelsen som tidligere anvendt. Imidlertid mindskes inkubationstiden for at sikre, at over fordøjelsen ikke forekommer. Denne fejlfinding teknik sikrer, at IE etiketten ikke varierer væsentligt fra parti til batch.
Taget i perspektiv, denne teknik til isolering af humane føtale ICC er forholdsvis standard inden for området. De fleste laboratorier bekræftede vores resultater, at tilsætning af HGF til mediet hjælper celler overlever og prolifererer 33. Sammenfattende har vi udviklet en metode til at isolere humane føtale ICC'er frisk pancreas med svangerskabsuge aldre spænder 9-23 uger. Cellerne kan dyrkes som et monolag eller i suspension til eksperimenter at visualisere pankreatiske endokrine transkriptionsfaktorer og humant insulin.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af California Institute for regenerativ medicin (RB3-02266) og NIH (DK54441).
Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
1M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
Penicillin – Streptomycin 100X Solution | Life Technologies | 15070063 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
Dnase | Sigma | DN25 | |
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
PBS | Gibco | 14190 | |
16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) | Sigma | I2018 | |
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) | Sigma | G2654 | |
PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
AlexaFluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
AlexaFluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
AlexaFluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
AlexaFluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
Agarose | Sigma | A-6013 |