Summary
I denne video artikel beskriver vi en automatiseret analyse for at måle effekten af sult eller mæthed på olfaktoriske afhængig mad søgeadfærd i den voksne bananfluen Drosophila melanogaster.
Abstract
For mange dyr, sult fremmer ændringer i det olfaktoriske system på en måde, der letter søgningen efter egnede fødekilder. I denne video artikel beskriver vi en automatiseret analyse for at måle effekten af sult eller mæthed på olfaktoriske afhængig mad søgeadfærd i den voksne bananfluen Drosophila melanogaster. I en lystæt kasse belyst af rødt lys, der er usynligt for bananfluer, et kamera er knyttet til erhvervelse custom data software overvåger placeringen af seks fluer samtidig. Hver flue er begrænset til at gå i de enkelte arenaer, der indeholder en fødevare lugt i centrum. Afprøvningsplanerne arenaer hvile på et porøst gulv, der fungerer for at forhindre lugt akkumulering. Latency at lokalisere lugt kilde, en metrik, der afspejler lugtesans under forskellige fysiologiske tilstande, bestemmes ved hjælp af software-analyse. Her diskuterer vi de kritiske mekanik kører denne adfærdsmæssige paradigme og dække specifikke emner vedrørende flyve loading, lugt forurening assay temperatur, datakvalitet og statistiske analyser.
Introduction
Tilstande af sult fremmer to typer appetitive adfærd: Søg Mad og fødevareforbrug 1. Denne enkle adfærdsmæssige analyse er nyttig for studiet af kemotaktiske adfærd i forbindelse med fouragering 2,3. Konkret er det spor flue position, ganghastighed og latenstid til at lokalisere en fødevare lugt mål. Latenstid af fødevarer fund tjener som metrik til at måle ændringer i følsomheden af flue lugt detection system nedstrøms ændringer i sin interne appetitive tilstand. En manuel version af dette assay er tidligere blevet anvendt til at vise, GABA-B-receptor-signalering er vigtig for lugt lokalisering adfærd hos voksne fluer 3. Den aktuelle automatiserede version af analysen var medvirkende til studiet af, hvordan kort neuropeptid-F (sNPF) signalering omformer olfaktoriske kortet i Drosophila og påvirkninger appetitive adfærd 2..
Test er udført på et mørkt, temperatur og fugtighed kontrolleret rum. Digitalvideokameraer ovenfor anførte de klare akryl test plader spore fluer baggrundsbelyst med 660 nm LED belysning. Information fra kameraet behandles i realtid ved en computer stationeret ved siden af testområdet. Vi anvender datafangst software til at registrere og gemme koordinater flyve positioner under testperioden.
I dette paradigme, er emnet frigives i en arena, der indeholder en fødevare lugt i midten, den lugt objekt skaber en fødevare lugt gradient i arena, der inducerer mad søgeadfærd i fluen. En lignende lugt søgeprotokol er blevet anvendt mod studiet af chemosensation i single Drosophila larver 7. Mens andre adfærdsmæssige assays, såsom de fire felter olfaktometer 4,5 eller t-labyrint 6 vurdere lugt aversion eller tiltrækning adfærd, er dette paradigme bedst egnet til at vurdere lugtesans og kemotaksis adfærd.
Flere vigtige fordele ledsage denne ASSAy. For det første tillader hurtig tilegnelse af store datasæt, fordi indsamling og analyse af data for det meste er automatiseret. For det andet, denne analyse isolerer og måler adfærd enkelte fluer, og dermed fjerne de sociale olfaktoriske tidskoder, der kan påvirke deres adfærd. For det tredje, enkelhed af protokollen og enkle eksperimentelle design gør analysen effektiv og let at undervise andre.
Desuden kan dette assay anvendes til yderligere at undersøge neurale kredsløb underliggende fødevarer søgeadfærden ved at kombinere det med den omfattende genetiske værktøjskasse til rådighed for Drosophila melanogaster 8. Målrettet ekspression af transgener, der stilhed eller ophidse neuroner kan opnås med værktøjer såsom GAL4-UAS system samt UAS-shibire TS1, UAS-tetanus-toksin, og UAS-TRPA1 (B) transgener 9-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fly Indsamling og sult
- Bag de eksperimentelle fluer under kontrollerede temperatur-og fugtighedsforhold (fx 21 ° C, 50-60% relativ fugtighed) på en 12-timers lys / mørke cyklus.
- Saml kvindelige flyver på dagen for eclosion og placere dem, sammen med 4-5 hanner, i nye fødevarer hætteglas (maksimalt 30 per hætteglas). Alder flyver 2-5 dage.
- Forbered kamre til flue sult.
- Skub et enkelt væv (4,8 x 8,4 inch) ned til bunden af en tom plasthætteglas. Helt suge vævet med destilleret vand. Brug en genstand til at trykke ned på væv og forsigtigt klemme ud overskydende vand.
- Vend hætteglasset at kassere ekstra vand. Der bør være nok vand til at holde fluerne hydreret og sult kammer fugtig, men ikke nok til at drukne fluerne.
- Overfør fluerne fra hætteglasset mad ind i en sult kammer og sætte hætteglasset omkring 18-24 timer før forsøget begynder. Opbevarhætteglas under kontrollerede temperatur-og fugtighedsforhold natten indtil eksperimentet begynder den næste dag.
2. Forberedelse af Food Lugt
- Der fremstilles en 1% agarose-opløsning ved tilsætning af 0,1 g lavtsmeltende agarose til 10 ml destilleret vand i en glaskolbe. Opvarm agaroseopløsningen i en mikrobølgeovn lige indtil det begynder at koge, men længe før det koger over.
- Stop mikrobølgeovn og kolben hvirvle en gang. Gentag dette trin to gange mere, indtil agarosen er helt opløst. Hold agaroseopløsningen i flydende tilstand ved at holde kolben varm på en varmeplade indstillet på 50 ° C.
- Tilføj 990 ul af 1% agaroseopløsning og 10 pi æble cider eddike til et 1,5 ml Eppendorf rør til at lave en 1% æble cider eddike løsning. Vortex opløsningen, indtil blandet og sted i et tørt bad inkubator indstillet til 50 ° C.
3. Test Room and Behavior Chamber Setup
- Tænd LED panel (660 nm).
- Skyl soldene og afprøvning plader med varmt vand og varme dem i en tørreovn, indtil al fugt er fordampet. Cool soldene og plader ned til test rumtemperatur, før du begynder eksperimenter.
- Anbring en flad skål på toppen af diffusorplade og fyld den med vand for at øge den lokale fugtighed og for at maskere vandet i agarose dråbe.
- Placer sigterne over vandskål.
4.. Flyv Loading ind i test Plates
Diagrammer med specifikationer for test plader kan findes i supplerende Filsektionen. Afprøvningen Pladen er lavet af klar akryl og består af 6 test arenaer. En simpel skyder indeholder bedrift kamre, der tillader flyve lastning, midlertidig opbevaring, og samtidig frigivelse af 6 fluer i deres respektive kamre påstarten af forsøget. Trådkorset ætset i midten af hver arena i pladen angive, hvor lugtstoffer skal afpipetteres.
- Sæt skyderne i akryl test plade.
- Skub forsigtigt aspiratoren i hætteglasset forbi bomuldstampon og give omkring 6 fluer at gå ind i aspirator.it er afgørende for at være så skånsom som muligt i at håndtere dem. Man kan drage fordel af phototactic flyve adfærd at fremkalde fluer at kravle hen imod aspiratoren ved at pege hætteglasset åbning mod et svagt lys kilde. Hvis det er nødvendigt, kan man også anvende blid sugning at aspirere cirka 6 kvindelige fluer.
- Spidsen af sugeindretningen i det første hul afprøvning plade. Tillad en enkelt flue til at passere ind i detentionen og forsigtigt rykke skyderen frem til at indlæse en flue ind i det næste hul. Fortsæt, indtil fluer besætte alle 6 holder celler af pladen.
- Afpipetteres 5 ul 1% æble cider eddike agaroseopløsning direkte på midten af crOSS-hår på indersiden af test plade.
5.. Placering af Testing Plate
- For at centrere test plade, skal du åbne filen med navnet "Positionering Tool.vi." "LabVIEW VI for Positioning Tool. vi kan findes i Supplemental Filsektionen. Kør filen ved at klikke på den hvide pil i øverste venstre hjørne af skærmen.
- Placer test plade oven på sigten, således at arenaen åbning vender sien gulvet og lugt målet på loftet af pladen. Juster sigtekornet ætset ind bagsiden af test plade med trådkorset på monitorskærmen.
- Når tilpasningen er afsluttet, afbryde henrettelse ved at klikke på den røde prik placeret i nærheden af øverste venstre hjørne af skærmen.
6.. Optag Fly holdning under eksperimentet
- At spore og registrere koordinaterne for fluen under hver mad search forsøg, åbne købet software filen "Fly Tracking -. Seks Zones.vi "LabVIEW VIs for" Fly Tracking - Seks Zones.vi "kan findes i den supplerende Filsektionen Kør filen ved at klikke på den hvide pil i øverste venstre hjørne af skærmen. .
- Tildele filen et navn, og klik på "OK".
- Advance skyderne i test kamre til at frigive fluerne ind i test arenaer. Vær omhyggelig med ikke at flytte test kamre, da dette vil føre til ukorrekt tilpasning med analyse software koordinater.
- Klik på "Start" (optagelse begynder) og sikre, at den eneste lyskilde i afprøvningen kammer er 660 nm LED panel.
- Når forsøget er afsluttet, fjernes sien og adfærd kammer. Løft test pladen fra si og fjerne fluerne ved at nedsænke pladen i isen. Rengør forsigtigt pladen med varmt vand og fjern agarose snavs. Placer test plader i en tørreovn at fjerne fugt.
- Udluft testområde ved at tænde en lilll fan i ca 2 min. Sluk for blæseren og indlæse den næste gruppe af fluer i den næste test plade.
7.. Dataanalyse Brug Custom Software
"Data Analyse for Fly Tracking-seks zoner" kan findes i den supplerende filer sektionen. Under datafangst, købet software registrerer individuel flyve position koordinater for hvert tidspunkt i en tekstfil. En enkelt digitalt kamera placeret over test plader erhverver billeder med en frame rate på 0,5 Hz. Analysen software program "Dataanalyse for flyve Tracking-seks zoner" udtrækker oplysninger fra denne tekstfil til a) beregne den gennemsnitlige hastighed, b) fastslå tidspunkt hvor en flue med succes placeret lugt kilde, og c) at opbygge grafiske vinduer som tillader brugeren at se: flyve placering, afstand af flyve fra lugt kilde over tid og gennemsnitlig flyve hastighed over tid. Den formaterer også data for nem eksport i en spreadsheet program. I denne makro, maden søgeventetid defineret som det tidspunkt hvor flyver bruge mindst 5 sek inden for en radius af midten af arenaen 5 mm.
- Åbn analyse software filen "Dataanalyse for Fly Tracking - Seks zoner". Under "Windows" fanen, klik på "Opret ny tabel." Gentag dette trin, indtil der er oprettet seks tabeller.
- Under "makroer" fanen, klik på "Foodfinding". En Hovedpanel skal vises med følgende muligheder: Åbn rådatafil for Layout, Open rådatafil for datafil, Fly Location; Afstand, hastighed, layout; FormatDataFile.
- For at se rådata uden at føje værdier til en tekstfil, skal du klikke på "Åbn Raw datafil for layout." Find og vælg den eksperimentelle data fil i browservinduet, der vises. Klik på "Åbn".
- Klik på "Flyv Location" for at se hver flue placering i hver af de seks arenaer (seks XY plots skildrer hver flyve 's position over tid skal vises på skærmen).
- Klik på "Afstand" for at se hver enkelt flue afstand fra lugt kilden (seks parceller skildrer fluen afstand fra lugt kilde over tid skal vises på skærmen). Den vandrette linje på y = 5 mm angiver tærsklen for fluen anses for at være placeret ved fødekilde.
- Klik på "Speed" for at se hver enkelt flue gennemsnitlige hastighed under forsøget (seks parceller skildrer fluen hastighed over tid skal vises på skærmen).
- Klik på "Layout" for at vise et layout med alle de flue placering, distance og hastighed graferne i tillæg til den gennemsnitlige hastighed (under de første 50 sek) og latenstid finde den lugt kilde til hver flue (figur 1). Til korrekt se layout, kan det være nødvendigt at justere margenerne. For at gøre dette, skal du først klikke på layoutet vinduet. Under fanebladet "Filer", klik på "Sideopsætning for layout." Nulstil margenerne til0,2 inches, og klik på "OK". Umiddelbart til venstre for hvert sted plot er et lille bord med overskrifterne "Speed" og "Latency". De indtastede værdier under hver overskrift angiver den gennemsnitlige hastighed i mm / sek og mad søgeventetid i sekunder. Tomme poster under Latency angiver fluen undladt at lokalisere lugt kilde. Mad søgeventetid defineres som tidspunkt hvor fluerne brugt mindst 5 sek inden for en radius på 5 mm fra midten af kammeret.
- Hvis du vil udskrive et layout, skal du klikke på layoutet området (opdateringer layout til aktuelle fil). Klik på "File" og klik derefter på "Print Layout".
- For at se den næste fil, skal du blot klikke på "Åbn Raw datafil for layout." Klik på den næste rå datafil, du vil se, og klik på "OK". Klik på Layout vinduet for at opdatere vinduet med den nye datafil.
- Indstillingerne kan gemmes i et eksperiment fil til senere brug.
8.. Eksportere data fraData Analysis Software til et regnearksprogram
- Sådan eksporterer hastighed og latency data for hver fil, skal du klikke på "Åbn rådatafil for datafil." Vælg en eksperimentel datafil, og klik på "Åbn". Et nyt browservindue vises.
- I det nye browservindue, skal du højreklikke på "Ny" og derefter klikke på "tekstdokument." Navngiv den nye tekstdokument. Vælg den nyligt navngivne tekstfil og klik på "Åbn". Denne gemmer data fra de rå data fil i tekstfilen.
- Hvis du vil eksportere data fra en anden fil, skal du klikke på "Åbn Raw datafil for datafil." Klik på en anden fil, og klik på "Åbn". Vælg den tekstfil fra trin 8.2). Fortsæt denne proces for de resterende datafiler, som du ønsker at eksportere.
- Når man har tilføjet alle de ønskede data filer til tekstfil, klik på "Format datafil." Vælg Tekstdokument bruges til at lagre data fra de foregående trin, og klik på "Open" (en ny window åbner automatisk).
- Opret et nyt tekstdokument i vinduet, tildele filen et navn, og klik på "Gem". Dette skaber en tekstfil, der indeholder filnavnet, gennemsnitlig hastighed, og latenstid for hver flyve og kan importeres ind i et regnearksprogram.
- Kumulative grunde er konstrueret ud fra data om det samlede antal fluer nå fødevarer lugt målet som en funktion af tiden (figur 3).
- Eksperimentelle datasæt analyseres for statistisk signifikans ved hjælp af en z-test for proportioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De data analyse software og layout, hvoraf et eksempel kan ses i figur 1, der bruges til at vurdere hvert enkelt flue ydeevne under dets 10 min retssag i henhold til et sæt kriterier analyse. Følgende kriterier anvendes til at bestemme, om data fra hver flue vil blive anvendt til dataanalyse og er designet til at fjerne disse fluer, der ikke er i stand til at udføre den mad søgningen opgave på grund af skader, sygdom, stress eller mangel på motivation.
Fluer, der er inaktive i mere end 300 sekunder, betragtes "inaktiv" og afvises fra datasættet, medmindre de a) allerede har formået at lokalisere den fødekilde eller b) udviser en gennemsnitlig hastighed> 10 mm / sek i mindst 100 sekunder efter den inaktive periode (figur 2a, 2b, 2c).
Sunde fluer udviser robust søgeadfærd umiddelbart efter løsladelse fra deres bedrift kamre. Således at vælge kun de fluer, derudviser sunde hastigheder i de tidlige stadier af aktiv lugt søgning, flyver kun at bevæge sig inden for et bestemt interval af hastigheder for de første 50 sekunder af forsøget er accepteret til dataanalyse. Dette kriterium er baseret på vores observationer, at a) som fluer nær lugt kilde, deres hastighed falde, og b) par fluer nå lugt mål inden for de første 50 sekunder af assayet. Kriterierne Hastigheden bestemmes ved at vurdere den gennemsnitlige hastighed på mindst 100 kontrol fluer på et givet eksperimentel temperatur. De øvre / nedre hastighedsgrænser er fastsat af den gennemsnitlige hastighed + / - standardafvigelse, hhv. For eksempel ved 21 ° C, flyver kun at flytte mellem 3,5-10,5 mm / sek i de første 50 sekunder af forsøget anvendes til dataanalyse. Undtagelser fra denne regel er lavet til fluer, der med held placeret lugt kilde inden for de første 50 sekunder, og dermed er langsommere end den nedre hastighedsgrænse.
Fluer, der ikke bevæger gennem alle fire kvadranter i arenaen og hoved ligefor fødekilde efter retssagen begynder afvises (Figur 2d).
Fluer, der væver mod og væk fra fødevarer kilder inden for en radius af 10 mm i mindst 50 sekunder, anses for at have held fundet fødekilde. Plottet afbilder afstand af flyve fra lugt kilde over tid kan anvendes til at evaluere denne sjældne tilfælde. Dette er det eneste tilfælde af en vellykket søgning, der ikke registreres automatisk af den aktuelle dataanalyse makro og skal opdages manuelt (fig. 2e)
Arenas med synlige artefakter i flue position spor afvises. Artefakter kan oprettes af enhver begivenhed, hvor datafangst softwaren registrerer en anden end fluen objekt. De optræder ofte som lange, lige linjer, der spænder på tværs af arenaen eller udstråler fra centrum (figur 2f).
I figur 3 voksne fluer sultet 18-24 timer udviser en højere olfactory følsomhed over for fødevarer relaterede lugte end deres fodret modparter 1. En grafisk afbildning af den kumulative procentdel af fluer, der med held finde en fødevare lugt kilde viser 30% af alle udsultede fluer lykkes inden for en 10 min vindue, i modsætning hertil kun 7% af alle fodret fluer gøre det (Figur 3). Den øgede olfaktoriske adfærdsmæssig reaktion er tidligere blevet vist at kræve intakt antenner 1. Manglende overholdelse af en klar forskel mellem fodrede og sultede kontrol fluer i denne analyse kan løses ved at undersøge miljø-opdræt og test forhold.
En nyttig strategi test fejlfinding betingelserne for, er at undersøge, om fluer er tiltrukket af andre end den lugt mål ved at måle flyve tiltrækning til lugt køretøj, agarose yderligere signaler. Sultet fluer skal udvise en signifikant større tiltrækning til eddike end den agarose køretøj alene (figur 4b). Figur 4audviser resultater fra en fødevare søgning eksperiment, der blev udført ved 32 ° C med en miljømæssig fugtighed på 35% under anvendelse af vildtype-fluer. I dette datasæt, var ingen signifikant forskel mellem flue tiltrækning til eddike og agarose kontrol opdaget. Dette er sandsynligvis på grund af en stigende tiltrækning til vandet i agarose dråbe under varmere test temperaturer. Ved at øge test fugtighed 50-60%, var vi i stand til at korrigere for denne adfærdsmæssige skift og genoprette den betydelige forskel mellem tiltrækning til eddike og agarose køretøj (figur 4b, * betegner p-værdi <0,05).
Figur 1. En typisk analyse software data layout illustrerer flyve position over tid, distance flyve fra lugt kilde over tid, og flyve hastighed over tid. 2 Tabelkolonnen i øverste venstrehjørne af hver arena viser gennemsnitlig hastighed (mm / sek) i løbet af de første 50 sekunder (kolonne 1) og latenstiden af fødevarer fund i sek (kolonne 2). Desuden er navnet på den åbnede tekstfil som bilag til den nederste venstre hjørne (vist som "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Klik her for at se større figur .
Figur 2. Eksempler på forskellige typer af spor behandlet i Analyse kriterier. A.) Fly, der har været inaktiv i 300 + sek afvises. B.) Fly, der har været inaktiv efter en vellykket lokalisering mad er accepteret. C.) Fly, der har været inaktiv i 300 + sek men viser robust aktivitet i mindst 100 sekunder efter inaktiv periode er accepteret. D). Flyv th på hovedet lige til fødekilde efter frigivelse afvises. E). Fluer at væve mod og væk fra mad kilder inden for en radius af 10 mm i mindst 50 sek anses for at have held fundet fødekilde og accepteres. F .) Arenas med synlige artefakter i layoutet afvises. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Grafisk plot viser en kumulativ procentdel af fodret og udsultede fluer, der finder lugt kilde over tid ved hjælp latenstid af fødevarer fund. (n = 88-96 fluer * betegner p-værdi <0,05, ** angiver p-værdi <0,01).
ad/50801/50801fig4.jpg "/>
Figur 4.. Fejlfinding testbetingelser A) Grafisk plot viser kumulative procentdel af fluer, der finde 1% eddike eller agarose køretøj over tid. Ingen signifikant forskel blev påvist i flue tiltrækning til enten lugt mål, når testforhold var ved 32 ° C og 35% fugtighed (n = 62-94 fluer). B) Grafisk plot viser kumulative procentdel af fluer, der finde 1% eddike eller agarose køretøj over tid. Testbetingelser var ved 32 ° C og 50-60% luftfugtighed. Under disse betingelser er fluer betydeligt mere tiltrukket til 1% eddike end agarose køretøj (n = 55 til 71 fluer * betegner p-værdi <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, vi skal beskrive en trin-for-trin procedure til fødevareindustrien søgeadfærd assay. Ud over fødevarer relaterede lugte, kan det også være tilpasset til studiet af fluen evne til at lokalisere andre lugt objekter. For eksempel kan det blive anvendt mod studiet af mate lokalisering adfærd i mandlige fluer 3 Der er flere andre overvejelser for denne protokol, som vi vil nævne her vedrørende denne procedure.:
Først temperaturen opdræt afgør, hvor længe eksperimentelle fluer skal være fyldt før testning. Det anbefales, at en række aldre undersøges for at bestemme den mest hensigtsmæssige alder til eksperimentet. For eksempel i vores erfaring, når opdrættet ved 21 ° C, forskellene mellem fodret og sultede flyve reaktioner er mest robuste efter de er blevet alderen 4-5 dage.
For det andet, LED'erne belyse et glas diffuser plade, som tjener til at skabe konstant, selv belysning under the akryl kamre. Tilstrækkeligt selv, konstant, og lyse belysning er afgørende for automatiseret sporing af flyve bevægelse. Ujævn belysning eller flimrende lyskilder kan føre til fejl i automatiseret sporing af fluen, der enten resulterer i intermitterende manglende evne til at opdage fluen stilling eller medføre, at softwaren forveksle de lette artefakter som fluen. Vi har fundet både et kommercielt tilgængelige LED-baggrundsbelysning eller en specialbygget LED-array arbejde lige så godt med at opfylde belysning behov for denne analyse.
For det tredje, hvis softwaren fejlagtigt registrerer små ændringer i lys eller agarose som ekstra genstande, indstillingerne objekt afsløring i "Fly Tracking-Seks Zones" erhvervelse software kan justeres for grænsen såvel som objekt størrelse. Justering af indstillingerne afsløring sikrer, at der kun registreres ét objekt i hver arena. Hvis du vil se antallet af objekter, der spores i hver arena, klik på "Threshold" fanen i "Fly Tracking-Six Zones "erhvervelse software. Hvis mere end ét objekt bliver sporet, kan man justere Minimumstørrelse, Max størrelse, Min Threshold eller Max Threshold indtil den detekterede artefakt forsvinder.
For det fjerde, flyve arter, der anvendes i disse forsøg, bør isogenized. Adfærdsmæssige forestillinger i dette paradigme er yderst følsomme over for forskelle i genetiske baggrunde. Parret hunner anvendes til at reducere potentielle adfærdsmæssige variation forbundet med parring status eller køn. Der er ingen grund til at tro denne analyse ville ikke være lige så effektiv i at studere adfærd hanner eller jomfruelige hunner.
Femte bør sigten suspenderes lidt over lysdiffusorpladen at forhindre lugt mætning af lugt gradient (suspension er cirka 2 cm med vores kommercielt købt modellen). Vi bruger kommercielt tilgængelige sier at skabe en porøs gulv under test plader.
Endelig for at producere pålidelige datasæt er nødvendige sammenhæng i eksperimentelle opdræt og testbetingelser. Enhver manglende se signifikante forskelle mellem fodrede og sultede reaktioner i kontrol fluer kan løses ved kontrol for at sikre 1) fluer opdrættes under stabile temperatur-og fugtighedsforhold, er 2) fluer fodret med friske fødevarer og ikke opdrættes i overfyldte betingelser, 3) nyligt eclosed flyve eksponering for CO 2 er minimeret, 4) flyver erfaring den samme længde af sult, 5) fluer testes under stabile temperatur-og fugtighedsforhold, og 6) testmiljø og kamre ikke er forurenede med lugte fra tidligere forsøg eller eksperimenter. Ud over de ovennævnte parametre, isogenization af flyve bestande er vigtigt, da forskellige genetiske baggrunde kan påvirke flue resultater i dette assay. Desuden, hvis eddike anvendes som lugt kilde, skal der drages omsorg for at sikre, at den ikke mister sin styrke ved at holde det tæt forseglet og opbevaret ved 4 ° C.
6 eller fire felter olfaktometer 4,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til JWW fra National Institute of Health (R01DK092640) og National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
