Summary
In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.
Abstract
Per molti animali, la fame promuove cambiamenti nel sistema olfattivo in un modo che facilita la ricerca di fonti di cibo adeguate. In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster. In una scatola a tenuta di luce illuminato da luce rossa che è invisibile ai moscerini della frutta, una telecamera legata al software di acquisizione dati personalizzato controlla la posizione di sei mosche contemporaneamente. Ogni mosca si limita a camminare nelle singole arene contenenti un odore di cibo al centro. Le arene di test poggiano su un pavimento poroso che funziona per prevenire l'accumulo di cattivi odori. Latenza per localizzare la sorgente odore, un parametro che riflette la sensibilità olfattiva sotto diversi stati fisiologici, è determinata mediante analisi software. Qui, discutiamo i meccanismi critici di funzionamento di questo paradigma comportamentale e copriamo questioni specifiche riguardanti fly loading, contaminazione odore, la temperatura del test, qualità dei dati e l'analisi statistica.
Introduction
Stati di fame promuovere due tipi di comportamenti appetitivi: ricerca di cibo e di consumo alimentare 1. Questo semplice test comportamentale è utile per lo studio dei comportamenti chemiotattici associati foraggiamento 2,3. In particolare, si rintraccia la posizione fly, velocità di piedi e la latenza per l'individuazione di un obiettivo odore di cibo. Latenza di trovare cibo serve come parametro per i cambiamenti nella sensibilità del sistema di rilevamento dell'odore della mosca valle delle variazioni del suo stato appetitivo interna di misura. Una versione manuale di questo test è stato precedentemente utilizzato per mostrare segnalazione dei recettori GABA-B è importante per il comportamento localizzazione odore adulto vola 3. L'attuale versione automatizzata del test è stato determinante nello studio di come a breve neuropeptide-F (SNPF) Segnalazione rimodella la mappa olfattiva in Drosophila e le influenze appetitiva comportamenti 2.
Test è fatto in una, temperatura e umidità ambiente controllata scuro. Digitaletelecamere fissate sopra le chiare piastre di prova acrilico tiene in linea retroilluminato da 660-nm illuminazione a LED. Informazioni della telecamera viene elaborato in tempo reale da un computer di stanza vicino alla zona test. Usiamo software di acquisizione dati per registrare e memorizzare le coordinate delle posizioni mosca durante il periodo di prova.
In questo paradigma, il soggetto viene rilasciato in un'arena che contiene un odore di cibo al centro, l'oggetto odore crea una sfumatura odore di cibo all'interno dell'arena che induce il cibo comportamento di ricerca in tempo reale. Un analogo protocollo di ricerca odore è stata applicata verso lo studio di chemosensation in single larve di Drosophila 7. Mentre altri test comportamentali, come il quattro di campo olfattometro 4,5 o la t-labirinto 6 valutano odore di avversione o attrazione comportamenti, questo paradigma è più adatto per valutare i comportamenti sensibilità e chemiotassi olfattive.
Diversi vantaggi chiave accompagnano questo assay. In primo luogo, permette una rapida acquisizione di grandi insiemi di dati, poiché la raccolta e l'analisi dei dati sono per lo più automatizzati. In secondo luogo, questo saggio isola e misura il comportamento dei singoli mosche, eliminando così stimoli olfattivi sociali che possono influenzare i loro comportamenti. Terzo, la semplicità del protocollo e semplice disegno sperimentale rendono il dosaggio efficiente e facile da insegnare agli altri.
Inoltre, questo test può essere utilizzato per sondare ulteriormente i circuiti neurali sottostanti cibo comportamento di ricerca combinandolo con l'ampia toolkit genetica a disposizione di Drosophila melanogaster 8. Espressione mirata di transgeni che silenzio o eccitare i neuroni possono essere raggiunti con strumenti come il sistema GAL4-UAS, nonché la ts1 UAS-shibire, UAS-tetano-tossina, e UAS-TRPA1 (B) transgeni 9-12.
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Protocol
1. Fly Raccolta e fame
- Posteriore linea sperimentali in condizioni di temperatura e umidità controllate (ad esempio 21 ° C, 50-60% di umidità relativa) su una luce di 12 ore / ciclo scuro.
- Raccogliere femminile vola il giorno della eclosion e luogo loro, insieme con 4-5 maschi, in nuove fiale alimentari (massimo 30 per fiala). Età vola 2-5 giorni.
- Preparare le camere per volare fame.
- Spingere un singolo tessuto (4,8 x 8,4 pollici) fino al fondo di una fiala di plastica vuoto. Completamente bagnare il tessuto con acqua distillata. Utilizzare un oggetto da spingere verso il basso sul tessuto e delicatamente spremere l'acqua in eccesso.
- Capovolgere il flaconcino per eliminare l'acqua in eccesso. Ci dovrebbe essere abbastanza acqua per mantenere in linea idratata e la camera di fame umida, ma non abbastanza per annegare le mosche.
- Trasferire le mosche dal flaconcino cibo in una camera di fame e collegare il flaconcino circa 18-24 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Conservare ilfiale in condizioni di temperatura e umidità controllate durante la notte fino a quando l'esperimento ha inizio il giorno successivo.
2. Preparazione del cibo odore
- Preparare una soluzione di agarosio 1% aggiungendo 0,1 g di bassa temperatura di fusione agarosio a 10 ml di acqua distillata in un pallone di vetro. Riscaldare la soluzione di agarosio in un forno a microonde solo fino a quando non comincia a bollire, ma ben prima che trabocca.
- Arrestare il forno a microonde e agitare il pallone una volta. Ripetere questa operazione altre due volte fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Conservare la soluzione di agarosio allo stato liquido, mantenendo il caldo pallone su una piastra riscaldante a 50 ° C.
- Aggiungere 990 ml di soluzione di agarosio 1% e 10 ml di aceto di mele in una provetta da 1,5 ml Eppendorf per ottenere una soluzione di aceto di sidro di mele 1%. Vortex la soluzione fino mista e posto in un incubatore bagno secco impostato a 50 ° C.
3. Test ambientale e l'impostazione della Camera comportamento
- Accendere il pannello LED (660 nm).
- Sciacquare i setacci e le piastre di prova con acqua calda e riscaldare in forno fino a quando tutta l'umidità è evaporata. Raffreddare i setacci e piatti giù per la temperatura ambiente di test prima degli esperimenti di inizio.
- Posizionare un piatto piano sulla parte superiore della piastra diffusore e riempire con acqua per aumentare l'umidità locale e per mascherare l'acqua nella goccia di agarosio.
- Posizionare i setacci sopra il piatto d'acqua.
4. Vola Loading nelle piastre di prova
Diagrammi con le specifiche per le piastre di prova possono essere trovati nella sezione supplementare Files. La piastra di prova è fatta di acrilico e si compone di 6 arene di prova. Un semplice dispositivo di scorrimento contiene in possesso di camere che permettono fly carico, il contenimento temporaneo, e il rilascio simultaneo di 6 mosche nelle loro rispettive camere al'inizio dell'esperimento. Reticolo inciso al centro di ogni arena nella piastra indicano dove devono essere pipettati odoranti.
- Inserire i cursori nella piastra test acrilico.
- Fare scorrere delicatamente l'aspiratore nel flaconcino passato il tappo di cotone e attendere circa 6 mosche di camminare nella aspirator.it è fondamentale per essere i più dolci possibili nella loro movimentazione. Si può approfittare di comportamento mosca phototactic per indurre le mosche a strisciare verso l'aspiratore puntando l'apertura flaconcino verso una fonte di luce fioca. Se necessario, si può anche applicare delicata aspirazione per aspirare circa 6 mosche di sesso femminile.
- Inserire la punta dell'aspiratore nel primo foro della piastra di prova. Lasciare una mosca per passare nella cella di detenzione e delicatamente avanzare il cursore in avanti per caricare una mosca nel foro successivo. Continuare fino a quando le mosche occupare tutti e 6 i titolari di cellule della piastra.
- Pipettare 5 ml di sidro di mele soluzione all'1% di aceto agarosio direttamente sul centro della crOSS-peli sulla faccia interna della lastra di prova.
5. Posizionamento della piastra Testing
- Per centrare la piastra di prova, aprire il file denominato "Posizionamento Tool.vi." "LabVIEW VI per il posizionamento Tool. vi si possono trovare nella sezione supplementare Files. Eseguire il file facendo clic sulla freccia bianca nell'angolo superiore sinistro dello schermo.
- Posizionare la lastra di prova sopra il setaccio tale che l'apertura dell'arena affronta il pavimento setaccio e la porta odore è sul soffitto della piastra. Allineare il reticolo incisi nel retro della piastra di test con il mirino sullo schermo del monitor.
- Quando l'allineamento è stato completato, interrompere l'esecuzione cliccando sul puntino rosso che si trova vicino all'angolo superiore sinistro del monitor.
6. Registrare il Fly posizione durante l'esperimento
- Per monitorare e registrare le coordinate del volo durante ogni prova ricerca di cibo, aprire il file del software di acquisizione "Fly Tracking -. Six Zones.vi "LabVIEW per" Fly Tracking - Six Zones.vi "si possono trovare nella sezione Supplemental Files Eseguire il file facendo clic sulla freccia bianca nell'angolo in alto a sinistra del monitor. .
- Assegnare un nome al file e fare clic su "OK".
- Anticipo i cursori nelle camere di prova per rilasciare le mosche nelle arene di prova. Fare attenzione a non spostare le camere test come questo porterà ad allineamento improprio con le coordinate software di analisi.
- Fare clic su "Start" (inizio registrazione) e garantire che l'unica fonte di luce nella camera di prova è il pannello LED 660 nm.
- Quando la prova è terminato, rimuovere il setaccio e camera di comportamento. Sollevare la piastra di prova dal setaccio e rimuovere le mosche immergendo la lastra di ghiaccio. Pulire delicatamente la piastra con acqua calda e rimuovere eventuali detriti agarosio. Posizionare le piastre di prova in un forno di essiccazione per rimuovere l'umidità.
- Ventilare l'area di prova girando su un smalventilatore l per circa 2 min. Accendere il ventilatore e caricare il successivo gruppo di mosche nel piatto test successivo.
7. Analisi dei dati Utilizzo di software personalizzato
"Analisi dei dati per Fly rilevamento a sei zone" può essere trovato nella sezione supplementare Files. Durante l'acquisizione dei dati, le coordinate della posizione mosca individuo record software di acquisizione per ogni punto temporale in un file di testo. Una fotocamera digitale singolo posizionato sopra le piastre di prova acquisisce immagini ad un frame rate di 0,5 Hz. Il programma software di analisi "Analisi dei dati per Fly Tracking-sei zone" estrae le informazioni dal file di testo per a) calcolare la velocità media, b) determinare il punto di tempo in cui una mosca che si trova con successo la fonte dell'odore, e c) costruire finestre grafiche che permetterà all'utente di visualizzazione: volare la posizione, la distanza della mosca dalla fonte odore nel tempo e la velocità media mosca nel corso del tempo. Formatta anche i dati per una facile esportazione in un SPREprogramma adsheet. In questa macro, il cibo ricerca di latenza è definito come il punto di tempo in cui vola spendere almeno 5 sec entro un raggio di 5 mm dal centro dell'arena.
- Aprire il file del software di analisi "Analisi dei dati per Fly Tracking - sei zone". Nella scheda "Windows", fare clic su "Crea nuova tabella". Ripetere questa operazione fino a quando sono stati creati sei tavoli.
- Nella scheda "macro", cliccare su "Foodfinding". Un pannello principale dovrebbe apparire con le seguenti opzioni: File Open Data Raw per il layout, Apri file Raw dati per il file di dati, Fly Posizione, Distanza, velocità, layout; FormatDataFile.
- Per visualizzare i dati grezzi senza aggiungere valori a un file di testo, fare clic su "Apri file Raw dati per Layout." Individuare e selezionare il file di dati sperimentali nella finestra del browser che viene visualizzata. Fare clic su "Apri".
- Clicca su "Fly Location" per visualizzare la posizione di ogni volo in ciascuna delle sei arene (sei piazzole XY raffiguranti ciascuna fly 'posizione s nel tempo dovrebbe apparire sullo schermo).
- Clicca su "Distanza" per visualizzare la distanza di ogni mosca dalla fonte dell'odore (sei appezzamenti raffiguranti la distanza della mosca dalla fonte dell'odore nel tempo dovrebbe apparire sullo schermo). La linea orizzontale y = 5 MM, indica la soglia a cui la mosca si considera situato alla fonte di cibo.
- Clicca su "Speed" per visualizzare la velocità media di ciascun volo durante il processo (sei appezzamenti raffiguranti la velocità della mosca nel tempo dovrebbe apparire sullo schermo).
- Clicca su "layout" per visualizzare un layout con tutte le posizione mosca, distanza e velocità grafici oltre alla velocità media (durante i primi 50 sec) e la latenza di trovare la fonte odori per ciascun volo (Figura 1). Per visualizzare correttamente il layout, può essere necessario regolare i margini. Per fare questo, prima di fare clic sulla finestra di layout. Nella scheda "File", cliccare su "Imposta pagina per il layout." Azzera i margini per0,2 pollici e fare clic su "OK". Subito a sinistra di ogni appezzamento posizione è un piccolo tavolo con le rubriche "Speed" e "Latency". I valori inseriti in ciascuna voce indicano la velocità media in mm / sec e ricerca di cibo la latenza in secondi. Voci vuote sotto Latency indicano la mosca non è riuscito a individuare la fonte degli odori. Cucina latenza di ricerca è definito come il punto di tempo in cui le mosche trascorso almeno 5 secondi entro un raggio di 5 mm dal centro della camera.
- Per stampare un layout, fare clic sull'area di layout (aggiornamenti layout file corrente). Fare clic su "File" e poi cliccate su "Layout di stampa".
- Per visualizzare il file successivo, è sufficiente fare clic su "Apri file Raw dati per Layout." Fare clic sul seguente file di dati grezzi che si desidera visualizzare e fare clic su "OK". Fare clic sulla finestra di layout per aggiornare la finestra con il nuovo file di dati.
- Le impostazioni possono essere salvate in un file di esperimento per un uso successivo.
8. Esportare i dati dail software di analisi dati in un programma di foglio di calcolo
- Per esportare i dati di velocità e latenza per ogni file, fare clic su "Apri file Raw dati per file di dati." Selezionare un file di dati sperimentali e cliccare su "Apri". Apparirà una nuova finestra del browser.
- Nella nuova finestra del browser, fate clic destro su "Nuovo" e quindi fare clic su "Documento di testo". Assegnare al nuovo documento di testo. Selezionare il file di testo nuovo nome e fare clic su "Apri". Questo memorizza i dati dal file di dati grezzi in file di testo.
- Per esportare i dati da un altro file, clicca su "Apri file Raw dati per il file di dati." Fare clic su un altro file e fare clic su "Apri". Selezionare il file di testo dal punto 8.2). Continuare questo processo per i file di dati rimanenti che si desidera esportare.
- Una volta che tutti i file di dati desiderati sono stati aggiunti al file di testo, fare clic su "File Formato dati". Selezionare il documento di testo utilizzato per memorizzare i dati provenienti dai passaggi precedenti e cliccare su "Apri" (una nuova window si aprirà automaticamente).
- Creare un nuovo documento di testo nella finestra, assegnare un nome al file e fare clic su "Salva". Questo crea un file di testo che contiene il nome del file, la velocità media, e la latenza per ogni mosca e possono essere importati in un foglio di calcolo.
- Piazzole cumulativi sono costruiti da dati sul numero totale di mosche raggiungimento dell'obiettivo odore cibo come funzione del tempo (Figura 3).
- Dati sperimentali sono analizzati per la significatività statistica utilizzando un test z per proporzioni.
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Representative Results
Il software di analisi dei dati e il layout, di cui un esempio può essere visto in Figura 1, sono utilizzate per valutare le prestazioni di ciascun volo durante la sua prova di 10 min secondo un insieme di criteri di analisi. I seguenti criteri sono utilizzati per determinare se i dati di ogni volo saranno utilizzati per l'analisi dei dati e sono progettati per eliminare le mosche che sono in grado di eseguire l'operazione di ricerca alimentare a causa di infortunio, malattia, stress, o la mancanza di motivazione.
Mosche che sono inattivi per più di 300 secondi sono considerati 'inattivi' e vengono respinte dal set di dati, a meno che a) già sono riusciti a localizzare la fonte di cibo o b) presentare una velocità media> 10 mm / sec per almeno 100 sec successivo al periodo inattivo (figure 2a, 2b, 2c).
Mosche sani mostrano robusta comportamento di ricerca immediatamente dopo il rilascio dalle loro camere di partecipazione. Così, per selezionare solo le mosche cheesporre velocità sani durante le prime fasi di ricerca odori attivo, vola solo che si muovono all'interno di un certo intervallo di velocità per i primi 50 secondi della prova sono accettati per l'analisi dei dati. Questo criterio è basato sulle nostre osservazioni che a) come linea vicino alla sorgente odore, la loro velocità diminuisce e b) poche mosche raggiungono il bersaglio odore nei primi 50 sec del dosaggio. I criteri di velocità sono determinati valutando le velocità medie di almeno 100 vola di controllo ad una data temperatura sperimentale. I limiti di velocità / bassa superiori vengono impostati in base alla velocità media + / - deviazione standard, rispettivamente. Per esempio, a 21 ° C, vola solo che si muovono tra 3,5-10,5 mm / sec nei primi 50 sec del processo sono utilizzati per l'analisi dei dati. Le eccezioni a questa regola sono fatti per mosche che trovano con successo la fonte dell'odore entro il primo 50 sec e sono quindi più lento rispetto del limite di velocità inferiore.
Le mosche che non si muovono attraverso tutti i quattro quadranti in campo e proseguire drittoper la fonte di cibo dopo il processo inizia sono respinti (Figura 2d).
Mosche che si intrecciano verso e lontano dalla fonte di cibo entro un raggio di 10 mm per un minimo di 50 sec sono considerati avere trovato con successo la fonte di cibo. La distanza raffigurante trama della mosca dalla sorgente odore nel tempo può essere utilizzato per valutare questo raro caso. Questo è l'unico caso di una ricerca di successo che non viene rilevata automaticamente dalla macro analisi dati corrente e deve essere rilevata manualmente (figura 2e)
Arenas con artefatti visibili in mosca posizione di traccia vengono rifiutati. Artefatti possono essere creati da qualsiasi evento in cui il software di acquisizione dati rileva un oggetto diverso dalla mosca. Spesso appaiono come lunghe linee rette che si estendono in tutta l'arena o si irradiano dal centro (Figura 2f).
In figura 3, mosche adulte affamate 18-24 ore presentano una o più altolfactory sensibilità agli odori legati all'alimentazione rispetto ai loro omologhi fed 1. Una trama grafica della percentuale cumulativa di mosche che individuare correttamente una fonte di odore di cibo mostra il 30% di tutte le mosche affamate successo all'interno di una finestra di 10 minuti, al contrario, solo il 7% di tutte le mosche alimentati farlo (Figura 3). Questa risposta comportamentale olfattiva intensa precedentemente è stato indicato per richiedere antenne intatto 1. La mancata osservanza di una chiara differenza tra la linea di controllo alimentati e affamati in questo test può essere risolto esaminando allevamento ambientale e delle condizioni di prova.
Una strategia utile per condizioni di test la risoluzione dei problemi è quello di esaminare se le mosche sono attratte da segnali aggiuntivi rispetto all'obiettivo odore misurando mosca attrazione per il veicolo odore, agarosio. Mosche affamate dovrebbe esibire una significativamente maggiore attrazione per aceto che al solo veicolo agarosio (Figura 4b). Figura 4arisultati mostre da un esperimento di ricerca di cibo che è stato eseguito a 32 ° C con umidità ambientale del 35% utilizzando il tipo di linea selvatici. In questa serie di dati, è stata rilevata alcuna differenza significativa tra mosca attrazione per aceto e il controllo agarosio. Ciò è probabilmente dovuto ad una crescente attrazione per l'acqua che si trova nel gocciolina agarosio a temperature di prova più calde. Aumentando il test di umidità al 50-60%, siamo riusciti a correggere questo cambiamento comportamentale e ripristinare la significativa differenza tra attrazione per l'aceto e il veicolo agarosio (Fig. 4b, * denota p-value <0,05).
Figura 1. Un layout tipico software di analisi dati illustra posizione vola nel tempo, vola distanza dalla sorgente odore nel tempo, e vola velocità nel tempo. La tabella 2 colonna in alto a sinistraangolo di ogni arena visualizza la velocità media (mm / sec) durante il primo 50 sec (colonna 1) e la latenza di trovare cibo in sec (colonna 2). Inoltre, il nome del file di testo aperto viene aggiunto nell'angolo in basso a sinistra (illustrato come, "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Esempi di diversi tipi di tracce conto nei criteri di analisi. A.) Fly che è stato inattivo per 300 + sec è respinta. B). Fly che è stato inattivo dopo aver individuato correttamente il cibo è accettato. C..) Fly che è stato inattivo per 300 + sec ma mostra robusta attività per almeno 100 secondi dopo il periodo di inattività è accettato. D). Fly th a punta dritto per la fonte di cibo dopo il rilascio è respinta. E). Flies quella trama verso e lontano dalla fonte di cibo entro un raggio di 10 mm per un minimo di 50 sec sono considerati di aver trovato con successo la fonte di cibo e sono accettati. F .) Arenas con artefatti visibili nel layout vengono rifiutati. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Diagramma grafico mostra una percentuale cumulativa di mosche alimentati e affamati che trovano origine odore nel tempo utilizzando la latenza di trovare cibo. (n = 88-96 mosche; * denota p-value <0.05, ** denota p-value <0.01).
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Figura 4. Condizioni di prova Risoluzione dei problemi A) plot grafico mostra la percentuale cumulativa di mosche che trovano l'1% di aceto o di un veicolo di agarosio nel tempo. Nessuna differenza significativa è stata rilevata in volo attrazione per entrambi bersaglio odore quando le condizioni di prova erano a 32 ° C e 35% di umidità (n = 62-94 mosche). B) plot grafico mostra la percentuale cumulativa di mosche che trovano l'1% di aceto o di un veicolo di agarosio nel tempo. Condizioni di prova erano a 32 ° C e 50-60% di umidità. In queste condizioni, mosche sono significativamente più attratti aceto 1% rispetto al veicolo agarosio (n = 55-71 linea; * denota valore p <0,05).
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Discussion
In questo protocollo, si descrive una procedura step-by-step per il saggio comportamento di ricerca di cibo. Oltre agli odori legati all'alimentazione, può anche essere adattato per lo studio della capacità della mosca per individuare altri oggetti odore. Ad esempio, può essere applicato verso lo studio del comportamento localizzazione compagno in mosche maschio 3 Ci sono diverse considerazioni aggiuntive per questo protocollo che citeremo qui quest'azienda procedura.:
In primo luogo, la temperatura di allevamento determina per quanto tempo mosche sperimentali devono essere invecchiati prima del test. Si raccomanda un intervallo di età esaminata per determinare l'età più appropriata per l'esperimento. Ad esempio, nella nostra esperienza, quando allevati a 21 ° C, le differenze tra le risposte fly nutriti e affamati sono più robusti dopo che sono stati invecchiati 4-5 giorni.
In secondo luogo, i LED illuminano una piastra diffusore in vetro che serve per creare costante e uniforme sotto the camere di acrilico. Sufficientemente anche, illuminazione costante e luminosa è fondamentale per il monitoraggio automatizzato di movimento mosca. Illuminazione irregolare o tremolante fonti di luce può portare a errori di tracciamento automatico della mosca che o comporta incapacità intermittente per rilevare la posizione della mosca o causare il software per confondere gli artefatti luminosi come la mosca. Abbiamo trovato sia una retroilluminazione a LED disponibile in commercio o un lavoro di matrice personalizzato costruito LED altrettanto bene nel soddisfare le esigenze di illuminazione per questo test.
In terzo luogo, se il software rileva erroneamente piccole variazioni di illuminazione o oggetti agarosio come extra, le impostazioni di rilevamento dell'oggetto in "Fly Tracking-sei zone" software di acquisizione può essere regolata per la soglia, così come le dimensioni dell'oggetto. Regolazione delle impostazioni di rilevamento assicura che solo un oggetto viene rilevato in ogni arena. Per visualizzare il numero di oggetti che vengono monitorati in ogni arena, fare clic sulla scheda "Threshold" del "Fly Tracking-Six Zones "software di acquisizione. Se più di un oggetto viene monitorata, si può regolare la dimensione Min, Max Size, soglia minima, o Soglia massima fino a quando il manufatto rilevato scompare.
Quarto, vola supporti utilizzati in questi esperimenti dovrebbero essere isogenized. Prestazioni comportamentali in questo paradigma sono molto sensibili alle differenze di background genetici. Femmine fecondate vengono utilizzati per ridurre il potenziale variabilità comportamentale associata con lo stato di accoppiamento o di sesso. Non c'è ragione di credere che questo test non sarebbe altrettanto efficace nello studio del comportamento dei maschi o femmine vergini.
Quinto, il setaccio deve essere sospesa leggermente al di sopra della piastra diffusore per evitare la saturazione odore del gradiente odore (la sospensione è di circa 2 cm con il nostro modello acquistabile). Usiamo setacci disponibili in commercio per creare un piano poroso sotto le piastre di prova.
Infine, al fine di produrre dati affidabiliset, la coerenza è necessaria in condizioni di allevamento e test sperimentali. In caso di mancata vedere le differenze significative tra le risposte nutriti e affamati in linea di controllo può essere risolto controllando per assicurarsi che 1) le mosche sono allevati in condizioni di temperatura e umidità stabili, 2) le mosche vengono nutriti con cibi freschi e non vengono allevati in condizioni di sovraffollamento, 3) nuova eclosed volare l'esposizione alle emissioni di CO 2 sono ridotte, 4) vola esperienza la stessa lunghezza di fame, 5) mosche sono testati in condizioni di temperatura e umidità stabili, e 6) l'ambiente di test e le camere non sono contaminati da odori provenienti da studi precedenti o esperimenti. Oltre ai parametri di cui sopra, isogenization delle scorte mosca è importante in quanto diversi background genetici possono influenzare le prestazioni mosca in questo saggio. Inoltre, se l'aceto è usato come sorgente odore, occorre prestare attenzione a garantire che non perda la sua potenza con l'ermeticamente sigillati e conservati a 4 ° C.
6 o quattro campo olfactometer 4,5.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza concorrente interesse finanziario.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca a JWW dal National Institute of Health (R01DK092640) e la National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
