Summary
في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف مقايسة الآلي لقياس تأثير الجوع أو الشبع على حاسة الشم التي تعتمد سلوك البحث الغذائية في الفاكهة الكبار يطير ذبابة الفاكهة السوداء البطن.
Abstract
لكثير من الحيوانات والجوع يعزز التغييرات في نظام حاسة الشم بطريقة تسهل البحث عن مصادر الغذاء المناسب. في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف مقايسة الآلي لقياس تأثير الجوع أو الشبع على حاسة الشم التي تعتمد سلوك البحث الغذائية في الفاكهة الكبار يطير ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في ضوء مربع محكم تنيره الضوء الأحمر التي هي غير مرئية للذباب الفاكهة، وكاميرا مرتبطة برنامج الحصول على بيانات مخصصة تراقب الموقف من ستة الذباب في وقت واحد. ويقتصر كل ذبابة على السير في الساحات الفردية التي تحتوي على رائحة الطعام في المركز. والساحات اختبار ترتكز على أرضية مسامية الذي يعمل على منع تراكم الرائحة. يتم تحديد زمن الوصول لتحديد مصدر الرائحة، والذي يعكس حساسية متري حاسة الشم تحت الدول الفسيولوجية المختلفة، من خلال تحليل البرمجيات. هنا، ونحن نناقش اليات حرجة من تشغيل هذا النموذج السلوكي وتغطية قضايا محددة تتعلق ذبابة loadiنانوغرام، وتلوث الرائحة ودرجة الحرارة الفحص، جودة البيانات، والتحليل الإحصائي.
Introduction
الدول الجوع تعزيز نوعين من السلوكيات مشهي: البحث الغذائية والاستهلاك الغذائي 1. هذا الاختبار السلوكية البسيطة هي مفيدة لدراسة السلوكيات المرتبطة الكيميائي تستخدم علفا 2،3. على وجه التحديد، فإنه يتابع الموقف الطاير، سرعة المشي والكمون لتحديد موقع الهدف رائحة الطعام. الكمون لتقصي الغذاء بمثابة متري لقياس التغيرات في حساسية من رائحة نظام الكشف عن الذبابة المصب من التغيرات في حالته مشهي الداخلية. وهناك نسخة من دليل هذا الاختبار كان يستخدم في السابق ليبرهن GABA-B مستقبلات الإشارات المهم للسلوك رائحة التوطين في الذباب الكبار 3. وكان الإصدار الآلي الحالية للمقايسة دور فعال في دراسة كيفية قصيرة نيوروبيبتيدي-F (SNPF) إشارات تعيد تشكيل خريطة حاسة الشم في ذبابة الفاكهة والتأثيرات مشهي السلوكيات 2.
ويتم اختبار في ودرجة الحرارة والرطوبة غرفة مظلمة تسيطر عليها. رقميكاميرات الفيديو المبينة أعلاه واضحة لوحات اختبار الاكريليك تتبع الذباب الخلفية بواسطة 660 نانومتر إضاءة LED. تتم معالجة المعلومات من الكاميرا في الوقت الحقيقي من خلال جهاز كمبيوتر المتمركزة بالقرب من منطقة الاختبار. ونحن نستخدم برنامج الحصول على بيانات لتسجيل وحفظ إحداثيات المواقع ذبابة خلال فترة الاختبار.
في هذا النموذج، يتم تحرير هذا الموضوع إلى الساحة التي تحتوي على رائحة الطعام في المركز؛ الكائن رائحة يخلق رائحة الطعام التدرج داخل الساحة الذي يسبب السلوك الغذائي في البحث الطاير. وقد تم تطبيق رائحة مماثلة نحو بروتوكول البحث دراسة chemosensation في واحد يرقات ذبابة الفاكهة 7. بينما المقايسات السلوكية الأخرى مثل olfactometer 4،5 أربعة الميداني أو تي متاهة 6 تقييم رائحة النفور أو الجاذبية السلوكيات، هو الانسب هذا النموذج لتقييم حساسية والكيميائي السلوكيات حاسة الشم.
العديد من المزايا الرئيسية تصاحب هذه أساذ. الأولى، فإنه يسمح سرعة اقتناء مجموعات كبيرة من البيانات، لجمع البيانات وتحليلها في الغالب الآلي. الثانية، وهذا الاختبار يقيس يعزل سلوك الذباب واحد، وبالتالي القضاء على العظة حاسة الشم الاجتماعية التي قد تؤثر على تصرفاتهم. الثالث، وبساطة من البروتوكول والتصميم التجريبي بسيطة تجعل الفحص فعالة وسهلة لتعليم الآخرين.
بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لتحقيق مزيد من الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوك البحث الغذائية، عن طريق الجمع بين ذلك مع أدوات الوراثية الواسعة المتاحة لذبابة الفاكهة السوداء البطن 8. التعبير المستهدفة من الجينات المحورة أن الصمت أو تثير الخلايا العصبية يمكن أن يتحقق مع أدوات مثل نظام GAL4-UAS فضلا عن TS1 UAS-shibire، UAS والكزاز والسم، وUAS-TrpA1 (B) الجينات المحورة 9-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ذبابة جمع والمجاعة
- الخلفية الذباب التجريبية تحت ظروف الحرارة والرطوبة (على سبيل المثال 21 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 50-60٪) التي تسيطر على ضوء لمدة 12 ساعة / دورة الظلام.
- جمع الذباب الإناث في يوم eclosion ووضعها، جنبا إلى جنب مع الذكور 4-5، في قارورة غذائية جديدة (الحد الأقصى 30 في قارورة). عمر الذباب 2-5 أيام.
- إعداد غرف لذبابة المجاعة.
- دفع الأنسجة واحد (4.8 × 8.4 بوصة) وصولا الى الجزء السفلي من قنينة بلاستيكية فارغة. نقع تماما الأنسجة مع الماء المقطر. استخدام كائن لدفع حملة على الأنسجة وبلطف استنزاف المياه الزائدة.
- عكس القارورة لتجاهل المياه الزائدة. ينبغي أن يكون هناك ما يكفي من الماء للحفاظ على الذباب رطب وغرفة رطبة المجاعة، ولكن ليس بما يكفي ليغرق الذباب.
- نقل الذباب من القارورة الطعام في غرفة التجويع والمكونات القارورة حوالي 18-24 ساعة قبل أن تبدأ التجربة. تخزينقارورة تحت ظروف الحرارة والرطوبة تسيطر بين عشية وضحاها حتى تبدأ التجربة في اليوم التالي.
2. إعداد رائحة الطعام
- إعداد الحل الاغاروز 1٪ عن طريق إضافة 0.1 غرام من انخفاض درجة حرارة انصهار الاغاروز إلى 10 مل من الماء المقطر في دورق زجاجي. تسخين الحل الاغاروز في الميكروويف فقط حتى يبدأ في الغليان ولكن جيدا قبل أن يغلي أكثر.
- وقف الميكروويف ودوامة القارورة مرة واحدة. كرر هذه الخطوة مرتين أكثر حتى يذوب تماما الاغاروز. تبقي الحل الاغاروز في حالة سائلة عن طريق الحفاظ على الحارة قارورة على موقد وضعت في 50 درجة مئوية.
- إضافة 990 ميكرولتر من الحل الاغاروز 1٪ و 10 ميكرولتر من خل التفاح إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف لجعل 1٪ التفاح حل الخل. دوامة الحل حتى مختلطة ومكان في حاضنة حمام الجافة تعيين إلى 50 درجة مئوية.
3. غرفة الاختبار وسلوك إعداد غرفة
- بدوره على لوحة الصمام (660 نانومتر).
- شطف والمناخل لوحات الاختبار مع الماء الساخن والحرارة لهم في فرن التجفيف حتى تبخرت كل الرطوبة. تبريد المناخل واللوحات وصولا الى درجة حرارة غرفة الاختبار قبل بداية التجارب.
- وضع طبق الضحلة على الجزء العلوي من لوحة الناشر وملئه بالماء لزيادة الرطوبة المحلية وتحجب الماء في قطرة الاغاروز.
- وضع المناخل على طبق الماء.
4. يطير تحميل في لوحات اختبار
الرسوم البيانية للمواصفات لوحات اختبار يمكن العثور عليها في القسم ملفات إضافي. يتم إجراء اختبار لوحة الاكريليك واضحة ويتكون من 6 الساحات الاختبار. A المنزلق بسيط يحتوي عقد الغرف التي تسمح ذبابة التحميل والاحتواء مؤقتة، والإفراج المتزامن ل6 الذباب إلى غرف كل منها فيبداية التجربة. -عبر الشعر محفورا في قلب كل الساحة في لوحة تشير إلى حيث ينبغي pipetted عطر.
- إدراج المتزلجون في لوحة اختبار الاكريليك.
- الشريحة بلطف الشافطة في قارورة الماضية المكونات القطن والسماح حوالي 6 الذباب على السير في aspirator.it أمر بالغ الأهمية أن يكون لطيف ممكن في التعامل معها. يمكن للمرء الاستفادة من السلوك ذبابة ضوئية للحث على الذباب على الزحف نحو الشافطة بالإشارة افتتاح قارورة نحو مصدر ضوء خافت. إذا لزم الأمر، يمكن للمرء أيضا تطبيق لطيف لشفط نضح حوالي 6 الذباب الإناث.
- إدراج غيض من الشافطة في الحفرة الأولى من لوحة الاختبار. السماح لذبابة واحدة بالمرور إلى زنزانة وبلطف دفع التمرير إلى الأمام لتحميل ذبابة في حفرة المقبل. تستمر حتى الذباب يحتل كل 6 خلايا عقد من لوحة.
- ماصة 5 ميكرولتر من 1٪ عصير التفاح والخل الحل الاغاروز مباشرة على وسط كرOSS-الشعر على وجهه داخل لوحة الاختبار.
5. اختبار تحديد المواقع لوحة
- لتوسيط لوحة الاختبار، افتح الملف المسمى "تحديد المواقع Tool.vi." "ابفيف السادس لأداة لتحديد المواقع. سادسا يمكن العثور عليها في القسم ملفات إضافي. تشغيل الملف من خلال النقر على السهم الأبيض في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.
- وضع لوحة اختبار على رأس غربال بحيث افتتاح الساحة يواجه الطابق غربال والهدف هو رائحة على السقف من لوحة. محاذاة مرمى محفورا في الجزء الخلفي من لوحة الاختبار مع الشعر الصليب على شاشة العرض.
- عندما تم الانتهاء المحاذاة، إحباط التنفيذ من خلال النقر على النقطة الحمراء التي تقع بالقرب من الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.
6. تسجيل يطير المركز خلال التجربة
- لتتبع وتسجيل إحداثيات الطاير خلال كل محاكمة البحث الغذائية، فتح ملف برنامج الحصول على "فلوريداذ تتبع - ستة Zones.vi "فيس ابفيف ل" تتبع فلاي - ستة Zones.vi "يمكن العثور عليها في القسم ملفات التكميلي تشغيل ملف من خلال النقر على السهم الأبيض في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة. .
- تعيين اسم الملف وانقر على "موافق".
- دفع المتزلجون في غرف اختبار للافراج عن الذباب في الساحات الاختبار. يجب الحرص على عدم تحريك غرف الاختبار لأن هذا سوف يؤدي إلى محاذاة غير لائق مع الإحداثيات برامج التحليل.
- انقر على "ابدأ" (تبدأ تسجيل) والتأكد من أن المصدر الوحيد للضوء في غرفة الاختبار هو لوحة LED 660 نانومتر.
- عند الانتهاء من المحاكمة، وإزالة غربال وغرفة السلوك. رفع لوحة الاختبار من غربال وإزالة الذباب عن طريق غمر لوحة في الجليد. بلطف تنظيف لوحة مع الماء الساخن وإزالة أي حطام الاغاروز. وضع لوحات الاختبار في فرن التجفيف لإزالة الرطوبة.
- تهوية المنطقة من خلال تحويل التجارب على األصغرل مروحة لحوالي 2 دقيقة. بدوره قبالة المروحة وتحميل المجموعة التالية من الذباب في لوحة الاختبار القادم.
7. تحليل البيانات باستخدام برمجيات مخصصة
"تحليل البيانات لتتبع يطير ستة والمناطق" يمكن العثور عليها في القسم ملفات إضافي. خلال الحصول على البيانات، وتنسق سجلات برنامج الحصول على موقف ذبابة الفردية لكل نقطة زمنية في ملف نصي. كاميرا رقمية واحدة وضعه فوق لوحات اختبار يكتسب الصور بمعدل إطارات قدره 0.5 هرتز. برنامج برامج التحليل "تحليل البيانات لتتبع يطير ستة والمناطق" مقتطفات من المعلومات من هذا الملف النص إلى) حساب متوسط السرعة، ب) تحديد نقطة الوقت الذي ذبابة تقع بنجاح مصدر الرائحة، وج) بناء النوافذ الرسومية التي تسمح للمستخدم لعرض: يطير الموقع، مسافة الطاير من مصدر الرائحة مع مرور الوقت ومتوسط سرعة الطيران مع مرور الوقت. فإنه أيضا تنسيقات البيانات لسهولة التصدير إلى spreبرنامج adsheet. في هذا الماكرو، يتم تعريف الأغذية البحث الكمون كنقطة الوقت الذي تنفق الذباب لا يقل عن 5 ثانية داخل دائرة نصف قطرها 5 ملم من وسط الساحة.
- فتح ملف برامج التحليل "تحليل البيانات لتتبع فلاي - ستة المناطق". تحت "ويندوز" علامة التبويب، انقر على "إنشاء جدول جديد." كرر هذه الخطوة حتى تم إنشاء ستة جداول.
- تحت عنوان "وحدات الماكرو" علامة التبويب، انقر على "Foodfinding". يجب أن تظهر لوحة رئيسية مع الخيارات التالية: ملف البيانات المفتوحة أولية للتخطيط؛ فتح ملف بيانات أولية للملف بيانات؛ يطير المكان؛ القطر؛ السرعة؛ تخطيط؛ FormatDataFile.
- لعرض البيانات الخام دون إلحاق القيم إلى ملف نصي، انقر على "فتح ملف بيانات أولية للتخطيط." حدد موقع ثم حدد ملف البيانات التجريبية في نافذة المتصفح التي تظهر. انقر على "فتح".
- انقر على "فلاي الموقع" لعرض الموقع كل الذبابة في كل من الساحتين ستة (ستة المؤامرات XY تصور كل ذبابة 'يجب أن تظهر و موقف مع مرور الوقت على الشاشة).
- انقر على "المسافة" لعرض كل مسافة الذبابة من مصدر الرائحة (يجب أن تظهر ستة المؤامرات التي تصور مسافة الذبابة من مصدر الرائحة مع مرور الوقت على الشاشة). الخط الأفقي في ص = 5 مم يدل على العتبة التي تعتبر الطاير أن يكون موجودا في مصدر الغذاء.
- انقر على "سرعة" لعرض معدل السرعة لكل الذبابة أثناء المحاكمة (يجب أن تظهر ستة المؤامرات التي تصور سرعة الذبابة مع مرور الوقت على الشاشة).
- انقر على "تخطيط" لعرض تخطيط مع كل موقع ذبابة، وبعد المسافة، والسرعة الرسوم البيانية بالإضافة إلى متوسط السرعة (خلال 50 ثانية الأولى) والكمون من العثور على مصدر الرائحة لكل ذبابة (الشكل 1). لعرض بشكل صحيح تخطيط، قد يكون من الضروري لضبط الهوامش. للقيام بذلك، انقر أولا على نافذة المخطط. تحت عنوان "ملف" التبويب، انقر على "إعداد الصفحة للتخطيط." إعادة تعيين الهوامش إلى0.2 بوصة وانقر على "موافق". غادر على الفور من كل مؤامرة الموقع طاولة صغيرة مع عناوين "السرعة" و "الكمون". القيم المدخلة تحت كل عنوان يشير إلى متوسط السرعة في ملم / ثانية والبحث الغذائي الكمون في ثوان. إدخالات فارغة تحت الكمون تشير إلى فشل الطاير لتحديد مصدر الرائحة. يعرف الغذاء البحث الكمون كنقطة الوقت الذي الذباب قضى ما لا يقل عن 5 ثانية ضمن دائرة نصف قطرها 5 ملم من وسط الغرفة.
- لطباعة تخطيط، انقر على منطقة تخطيط (تخطيط التحديثات إلى الملف الحالي). انقر على "ملف" ثم انقر على "تخطيط الطباعة".
- لعرض الصورة التالى، ببساطة انقر على "فتح ملف بيانات أولية للتخطيط." انقر على ملف البيانات الخام القادمة التي ترغب في عرضها، ثم انقر على "موافق". انقر على نافذة تخطيط لتحديث الإطار مع ملف بيانات جديد.
- قد يتم حفظ الإعدادات في ملف التجربة لاستخدامها لاحقا.
8. تصدير البيانات منالبرنامج تحليل البيانات إلى برنامج جدول بيانات
- لتصدير البيانات السرعة والكمون لكل ملف، انقر على "فتح ملف بيانات أولية للملف بيانات." حدد ملف البيانات التجريبية وانقر على "فتح". سوف تظهر نافذة متصفح جديدة.
- في نافذة متصفح جديدة، انقر بالزر الايمن على "جديد"، ثم انقر على "مستند نص". تسمية مستند نصي جديد. حدد ملف نصي يدعى حديثا وانقر على "فتح". هذه مخازن البيانات من ملف البيانات الخام إلى ملف نصي.
- لتصدير البيانات من ملف آخر، انقر على "فتح ملف بيانات أولية للملف بيانات." انقر على ملف آخر وانقر على "فتح". حدد ملف النص من الخطوة 8.2). تستمر هذه العملية لملفات البيانات المتبقية التي ترغب في تصديرها.
- مرة واحدة تم إضافة كافة الملفات البيانات المطلوبة إلى ملف نصي، انقر على "ملف تنسيق البيانات." حدد مستند نص يستخدم لتخزين البيانات من الخطوات السابقة وانقر على "فتح" (أ يندو جديدةسوف تفتح تلقائيا ث).
- إنشاء مستند نص جديد في النافذة، وتعيين اسم ملف، وانقر على "حفظ". هذا بإنشاء ملف نصي يحتوي على اسم الملف، معدل السرعة، والكمون لكل يطير ويمكن استيرادها إلى برنامج جدول بيانات.
- هي التي شيدت المؤامرات التراكمي من البيانات على عدد من الذباب بلوغ الهدف رائحة الطعام بوصفها وظيفة من الوقت (الشكل 3).
- ويتم تحليل مجموعات البيانات التجريبية للدلالة إحصائية باستخدام اختبار ض للنسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
برنامج تحليل البيانات والتخطيط، مثالا وهو ما يمكن ملاحظته في الشكل 1، وتستخدم لتقييم أداء كل الذبابة لها خلال 10 دقيقة المحاكمة وفقا لمجموعة من المعايير التحليل. وتستخدم المعايير التالية لتحديد ما إذا كان سيتم استخدام البيانات من كل ذبابة لتحليل البيانات وتهدف إلى القضاء على تلك الذباب الذي غير قادر على أداء المهمة البحث الغذائية بسبب الاصابة والمرض، والإجهاد، أو عدم وجود الحافز.
تعتبر الذباب الذي غير نشطة لأكثر من 300 ثانية "غير نشطة" ويتم رفض من مجموعة البيانات إلا إذا كانت أ) نجحت بالفعل في تحديد مصدر الغذاء أو ب) يحمل بمتوسط سرعة> 10 ملم / ثانية لا يقل عن 100 ثانية بعد فترة غير نشط (أرقام 2A، 2B، 2C).
الذباب صحية يظهرون سلوكا بحث قوية فور خروجه من غرف عقد بهم. وبالتالي، لتحديد فقط تلك التي الذبابيحمل سرعات صحية أثناء المراحل الأولى من البحث النشط رائحة، والذباب الوحيد الذي تحرك داخل نطاق معين من سرعات للثانية 50 الأولى من المحاكمة وتقبل لتحليل البيانات. ويستند هذا المعيار على ملاحظاتنا أن) كما الذباب بالقرب من مصدر الرائحة، وبسرعة على خفض وب) قليلة الذباب بلوغ هدف رائحة داخل ثانية 50 الأولى من الفحص. يتم تحديد معايير سرعة من خلال تقييم متوسط سرعات لا يقل عن 100 الذباب التحكم في درجة حرارة تجريبية معينة. يتم تعيين حدود / انخفاض سرعة العلوي من متوسط السرعة + / - الانحراف المعياري، على التوالي. على سبيل المثال، في 21 ° C، والذباب الوحيد الذي تحرك بين 3،5 حتي 10،5 ملم / ثانية في 50 ثانية الأولى من المحاكمة وتستخدم لتحليل البيانات. هناك استثناءات لهذه القاعدة عن الذباب الذي يقع بنجاح مصدر الرائحة ضمن أول 50 ثانية، وبالتالي فهي أبطأ من الحد الأدنى للسرعة.
الذباب التي لا تتحرك من خلال كل الأرباع الأربعة في الساحة ويتجهون مباشرةلمصدر الغذاء بعد المحاكمة تبدأ مرفوضة (الشكل 2D).
تعتبر الذباب الذي نسج نحو وبعيدا عن مصدر الغذاء داخل دائرة نصف قطرها 10 مم مدة لا تقل عن 50 ثانية لأنها وجدت بنجاح مصدر الغذاء. المسافة التي تصور مؤامرة من ذبابة من مصدر الرائحة مع مرور الوقت يمكن استخدامها لتقييم هذه الحالة نادرة. هذا هو المثال الوحيد من البحث الناجحة التي لم يتم الكشف عن تلقائيا بواسطة الماكرو تحليل البيانات الحالية ويجب أن يتم الكشف يدويا (الشكل 2E)
يتم رفض الساحات مع التحف وضوحا في الموقف أثر ذبابة. يمكن إنشاء القطع الأثرية من قبل أي حدث حيث البرنامج الحصول على البيانات بالكشف عن كائن آخر غير الطاير. أنها غالبا ما تظهر، وخطوط مستقيمة طالما أن تمتد عبر الساحة أو تشع من وسطها (الشكل 2F).
في الشكل 3، الذباب الكبار جوعا 18-24 ساعة المعرض على أعلى سحساسية lfactory إلى الروائح الغذائية ذات الصلة من نظرائهم فدان 1. مؤامرة رسومية من النسبة التراكمية من الذباب الذي حدد بنجاح مصدر رائحة الطعام يظهر 30٪ من جميع الذباب جوعا تنجح ضمن إطار 10 دقيقة، وفي المقابل، 7٪ فقط من جميع الذباب فدان القيام بذلك (الشكل 3). وقد تم هذا الرد السلوكية حاسة الشم زاد أظهرت سابقا أنها تتطلب هوائيات سليمة 1. عدم مراعاة فرق واضح بين الذباب السيطرة فدان وجوعا في هذا الاختبار يمكن حلها عن طريق فحص تربية البيئية واختبار الظروف.
استراتيجية واحدة مفيدة لظروف الاختبار استكشاف الأخطاء وإصلاحها لفحص ما إذا كان ينجذب الذباب إلى العظة إضافية أخرى من الهدف عن طريق قياس رائحة ذبابة جذب للمركبة رائحة، الاغاروز. يجب أن الذباب يحمل جوعا جذب أكبر بكثير من الخل إلى أن السيارة الاغاروز وحدها (الشكل 4B). الشكل 4Aالنتائج المعروضات من تجربة البحث الغذائية التي تم تنفيذها في 32 درجة مئوية مع رطوبة البيئية من 35٪ باستخدام الذباب نوع البرية. في هذه المجموعة بيانات، تم الكشف لا يوجد فرق كبير بين ذبابة الخل لجذب والسيطرة الاغاروز. وهذا هو الأرجح بسبب عامل جذب زيادة إلى الماء وجدت في قطرة الاغاروز تحت درجات حرارة أكثر دفئا الاختبار. عن طريق زيادة اختبار الرطوبة إلى 50-60٪، وكنا قادرين على تصحيح لهذا التحول السلوكي واستعادة فرق كبير بين لجذب الخل والسيارة الاغاروز (الشكل 4B، * يدل ف قيمة <0.05).
الشكل 1. وتوضح البيانات تخطيط برامج التحليل نموذجية يطير الموقف مع مرور الوقت، ويطير مسافة من مصدر الرائحة مع مرور الوقت، وتطير بسرعة مع مرور الوقت. الجدول 2 عمود في الجانب الأيسر العلويزاوية كل الساحة يعرض متوسط السرعة (مم / ثانية) خلال أول 50 ثانية (العمود 1) والكمون لتقصي الأغذية في ثانية (العمود 2). بالإضافة إلى ذلك، يتم إلحاق اسم ملف نصي فتح إلى الزاوية اليسرى السفلى (كما هو موضح، "OZ120807_ORCODTKRi_1٪ _S4"). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. يتم قبول أمثلة على أنواع مختلفة من آثار تناولها في معايير التحليل. A.) يتم رفض يطير التي كانت خاملة لمدة 300 ثانية +. ب.) يطير التي كانت غير نشطة بعد تحديد مكان الطعام بنجاح. C.) يطير التي كانت خاملة ل 300 + ثانية ولكن يظهر النشاط القوي للا يقل عن 100 ثانية بعد قبول فترة غير نشط. D.) سافر عشر في رؤساء مباشرة لمصدر الغذاء بعد الإفراج مرفوض. E). الذباب الذي نسج نحو وبعيدا عن مصدر الغذاء داخل دائرة نصف قطرها 10 مم مدة لا تقل عن 50 ثانية تعتبر أن وجدت بنجاح مصدر الغذاء ومقبولة. F يتم رفض.) اريناس مع التحف واضحة في التخطيط. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الرقم 3. مؤامرة رسومية تظهر النسبة التراكمية من الذباب فدان والتجويع التي تجد مصدر الرائحة مع مرور الوقت باستخدام الكمون لتقصي الغذاء. (ن = 88-96 الذباب؛ * يدل ف قيمة <0.05، ** يدل ف قيمة <0.01).
ad/50801/50801fig4.jpg "/>
الشكل 4. شروط الاختبار استكشاف الأخطاء وإصلاحها A) مؤامرة الرسومية تظهر النسبة التراكمية من الذباب التي تجد 1٪ الخل أو مركبة الاغاروز مع مرور الوقت. تم الكشف عن أي اختلاف كبير في جذب ذبابة إما رائحة الهدف عندما كانت الظروف في اختبار 32 درجة مئوية، والرطوبة 35٪ (ن = 62-94 الذباب). B) مؤامرة الرسومية تظهر النسبة التراكمية من الذباب التي تجد 1٪ الخل أو مركبة الاغاروز مع مرور الوقت. كانت ظروف الاختبار في 32 درجة مئوية والرطوبة 50-60٪. في ظل هذه الظروف، والذباب بشكل ملحوظ أكثر جذبت إلى 1٪ من الخل إلى السيارة الاغاروز (ن = 55-71 الذباب؛ * يدل ف قيمة <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن تصف الإجراء خطوة بخطوة لفحص سلوك البحث الغذائية. بالإضافة إلى الروائح الغذائية ذات الصلة، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف لدراسة قدرة الذبابة لتحديد مواقع الأشياء رائحة أخرى. على سبيل المثال، فإنه يمكن تطبيقها تجاه دراسة السلوك توطين زميله في الذباب الذكور 3 وهناك عدة اعتبارات إضافية لهذا البروتوكول الذي سنذكر هنا بخصوص هذا الإجراء.:
أولا، يحدد درجة الحرارة تربية متى يجب أن تتراوح أعمارهم بين الذباب التجريبية قبل الاختبار. فمن المستحسن أن مجموعة من الأعمار فحصها لتحديد عمر الأنسب للتجربة. على سبيل المثال، في تجربتنا، وعندما تربى في 21 درجة مئوية، والاختلافات بين الاستجابات ذبابة فدان وجوعا هي أقوى بعد أن تم تتراوح أعمارهم بين 4-5 أيام.
الثانية، والمصابيح تضيء لوحة الزجاج الناشر الذي يعمل على خلق مستمر، حتى الإضاءة تحت الغرف الاكريليك ه. بما فيه الكفاية حتى، إضاءة ثابتة، ومشرق هو أمر حاسم لتتبع حركة الطيران الآلي. الإضاءة غير المستوية أو الخفقان مصادر الضوء قد يؤدي إلى أخطاء في تتبع الآلي للالطاير إما أن يؤدي إلى عدم القدرة على فترات متقطعة للكشف عن موقف ذبابة او تسبب البرنامج لخطأ التحف الخفيفة كما الطاير. وجدنا كلا من الإضاءة الخلفية LED المتاحة تجاريا أو LED مجموعة عمل مخصصة بنيت بشكل جيد على قدم المساواة في تلبية احتياجات الإضاءة لهذا الاختبار.
ثالثا، إذا كان البرنامج عن طريق الخطأ بالكشف عن التغيرات الصغيرة في الإضاءة أو الأشياء الاغاروز اضافية كما وإعدادات الكشف عن وجوه في "ذبابة تتبع-ست مناطق" البرمجيات الاستحواذ يمكن تعديل لعتبة وكذلك حجم الكائن. ضبط إعدادات الكشف يضمن أن يتم الكشف عن كائن واحد فقط في كل الساحة. لعرض عدد من الكائنات التي يتم تعقبها في كل الساحة، انقر فوق "عتبة" من علامة التبويب "يطير تتبع-ستة زونوفاق "البرمجيات الاستحواذ. إذا كان يتم تعقب أكثر من كائن واحد، يمكن للمرء أن ضبط حجم مين، ماكس الحجم، مين عتبة، عتبة ماكس أو حتى يختفي قطعة أثرية تم اكتشافها.
الرابعة، ويطير ينبغي isogenized الأسهم المستخدمة في هذه التجارب. الأداء السلوكي في هذا النموذج هي حساسة للغاية للاختلافات في خلفيات وراثية. وتستخدم الإناث تزاوج للحد من التقلبات السلوكية المحتملة المرتبطة بوضع التزاوج أو الجنس. ليس هناك سبب للاعتقاد أن هذا الاختبار لن تكون فعالة على قدم المساواة في دراسة سلوك الذكور أو الإناث البكر.
الخامس، غربال ينبغي وقف قليلا فوق لوحة الناشر ضوء لمنع رائحة تشبع التدرج رائحة (تعليق ما يقرب من 2 سم مع نموذجنا شراؤها تجاريا). نستخدم المناخل متاحة تجاريا لخلق أرضية مسامية تحت لوحات الاختبار.
أخيرا، من أجل إنتاج بيانات موثوق بها مجموعات، مطلوب الاتساق في تربية واختبار الظروف التجريبية. أي فشل لنرى اختلافات كبيرة بين استجابات فدان وتجويع الذباب في السيطرة يمكن حلها عن طريق فحص للتأكد من وتربى 1) الذباب تحت ظروف الحرارة والرطوبة مستقرة، ويتم تغذية 2) الذباب مع الأغذية الطازجة وليس وتربى في ظروف مزدحمة، 3) eclosed حديثا يطير التعرض لأول أكسيد الكربون 2 يتم تصغير، 4) الذباب تجربة نفس طول المجاعة، 5) ويتم اختبار الذباب تحت ظروف الحرارة والرطوبة مستقرة، و6) لا تلوث البيئة اختبار وغرف مع الروائح من التجارب السابقة أو التجارب. بالإضافة إلى المعلمات المذكورة آنفا، isogenization الأسهم ذبابة لا يقل أهمية عن خلفيات وراثية مختلفة يمكن أن تؤثر على أداء ذبابة في هذا الاختبار. وعلاوة على ذلك، إذا تم استخدام الخل كمصدر رائحة، يجب توخي الحذر لضمان أن لا يفقد فعاليته عن طريق الحفاظ على مغلقة بإحكام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
= "jove_content"> في شكلها الحالي، هذه الرائحة البحث مقايسة هو الانسب لدراسة الكيميائي وتقييم الاختلافات في حاسة الشم عبر المورثات الحساسيات المختلفة أو الظروف التجريبية. الكيميائي يتطلب بطبيعته الحساسية للرائحة، لجذب تلك الرائحة، والدافع إلى السعي للحصول على رائحة الهدف. جاذبية رائحة أو النفور في حد ذاته، ولكن، من الأفضل تقاس المقايسات السلوكية التي تقدم الطاير مع الخيارات رائحة مثل تي متاهة 6 أو حقل أربعة olfactometer 4،5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق المنح البحثية لJWW من المعهد الوطني للصحة (R01DK092640) والمؤسسة الوطنية للعلوم (0920668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 708-712 (1974).
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
