Summary
इस वीडियो लेख में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी वयस्क फल में घ्राण निर्भर खाद्य खोज व्यवहार पर भूख या तृप्ति के प्रभाव को मापने के लिए एक स्वचालित परख का वर्णन.
Abstract
कई जानवरों के लिए, भूख उपयुक्त खाद्य स्रोतों के लिए खोज की सुविधा है एक तरह से घ्राण प्रणाली में परिवर्तन को बढ़ावा देता है. इस वीडियो लेख में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी वयस्क फल में घ्राण निर्भर खाद्य खोज व्यवहार पर भूख या तृप्ति के प्रभाव को मापने के लिए एक स्वचालित परख का वर्णन. फल मक्खियों के लिए अदृश्य है कि लाल बत्ती से प्रकाशित एक हलका सा बॉक्स में, कस्टम डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से जुड़ा हुआ एक कैमरा एक साथ छह मक्खियों की स्थिति पर नजर रखता है. प्रत्येक मक्खी सेंटर में एक भोजन की गंध से युक्त व्यक्ति एरेनास में चलना तक ही सीमित है. परीक्षण एरेनास कार्यों गंध संचय को रोकने के लिए है कि एक झरझरा मंजिल पर आराम. गंध के स्रोत, विभिन्न शारीरिक राज्यों तहत घ्राण संवेदनशीलता को दर्शाता है कि एक मीट्रिक लगाने के लिए विलंबता, सॉफ्टवेयर विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है. यहाँ, हम इस व्यवहार प्रतिमान चलाने का महत्वपूर्ण यांत्रिकी चर्चा और मक्खी Loadi के बारे में विशिष्ट मुद्दों को कवरएनजी, गंध संदूषण, परख तापमान, डेटा की गुणवत्ता, और सांख्यिकीय विश्लेषण.
Introduction
खाद्य खोज और भोजन की खपत 1: भूख की अमेरिका भूख बढ़ाने वाला व्यवहार के दो प्रकार को बढ़ावा देने. इस सरल व्यवहार परख 2,3 foraging साथ जुड़े chemotactic व्यवहार के अध्ययन के लिए उपयोगी है. विशेष रूप से, यह एक खाना गंध लक्ष्य लगाने के लिए उड़ान भरने की स्थिति, चलने की गति और विलंबता पटरियों. भोजन खोजने के विलंबता अपने आंतरिक भूख बढ़ाने वाला राज्य में परिवर्तन के बहाव मक्खी की गंध पहचान प्रणाली की संवेदनशीलता में बदलाव को मापने के लिए के रूप में मैट्रिक में कार्य करता है. इस परख की एक पुस्तिका संस्करण पहले से GABA बी रिसेप्टर संकेतन 3 मक्खियों वयस्क में गंध स्थानीयकरण व्यवहार के लिए महत्वपूर्ण है दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. परख की वर्तमान स्वचालित संस्करण neuropeptide एफ (sNPF) संकेतन ड्रोसोफिला में घ्राण मानचित्र को नया स्वरूप दे और प्रभावों व्यवहार 2 भूख बढ़ाने वाला कैसे कम के अध्ययन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी.
परीक्षण एक काले, तापमान और आर्द्रता नियंत्रित कमरे में किया जाता है. डिजिटलस्पष्ट ऐक्रेलिक परीक्षण प्लेटों के ऊपर सेट वीडियो कैमरों 660 एनएम एलईडी रोशनी से backlit मक्खियों ट्रैक. कैमरे से जानकारी अगले परीक्षण क्षेत्र के लिए तैनात एक कंप्यूटर से वास्तविक समय में कार्रवाई की है. हम परीक्षण अवधि के दौरान उड़ान पदों के निर्देशांक रिकॉर्ड और बचाने के लिए डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
इस प्रतिमान में, विषय सेंटर में एक खाद्य गंध होता है कि एक क्षेत्र में जारी है, गंध वस्तु मक्खी में खाद्य खोज व्यवहार को प्रेरित करता है कि क्षेत्र के भीतर एक खाद्य गंध ढाल बनाता है. ऐसा ही एक गंध खोज प्रोटोकॉल एकल ड्रोसोफिला लार्वा 7 में chemosensation के अध्ययन की ओर लागू किया गया है. इस तरह के चार क्षेत्र olfactometer 4,5 या टी भूलभुलैया के रूप में 6 अन्य व्यवहार assays गंध घृणा या आकर्षण व्यवहार का मूल्यांकन करते हैं, इस प्रतिमान सबसे अच्छा घ्राण संवेदनशीलता और chemotaxis व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूल है.
कई महत्वपूर्ण लाभ यह Assa के साथवाई. डेटा संग्रह और विश्लेषण ज्यादातर स्वचालित रहे हैं क्योंकि सबसे पहले, यह, बड़े डेटा सेट के तेजी से अधिग्रहण परमिट. दूसरा, इस परख आइसोलेट्स और इस प्रकार उनके व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं कि सामाजिक घ्राण cues को नष्ट करने, एकल मक्खियों के व्यवहार के उपाय. तीसरा, प्रोटोकॉल और सरल प्रयोगात्मक डिजाइन की सादगी परख कुशल और दूसरों को सिखाने के लिए आसान बनाते हैं.
इसके अलावा, इस परख आगे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 8 के लिए उपलब्ध व्यापक आनुवंशिक टूलकिट के साथ संयोजन से खाद्य खोज व्यवहार अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मौन या उत्तेजित न्यूरॉन्स ऐसे GAL4-यूएएस प्रणाली के साथ ही यूएएस shibire TS1, यूएएस टिटनेस विष, और यूएएस TRPA1 (बी) के रूप में उपकरणों के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि transgenes की लक्षित अभिव्यक्ति 9-12 transgenes.
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Protocol
1. फ्लाई संग्रह और भुखमरी
- रियर एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर नियंत्रित तापमान और नमी की स्थिति (जैसे 21 डिग्री सेल्सियस, 50-60% सापेक्ष आर्द्रता) के तहत प्रयोगात्मक मक्खियों.
- महिला eclosion के दिन पर मक्खियों लीजिए और (अधिकतम 30 शीशी प्रति) नई खाद्य शीशियों में, 4-5 पुरुषों के साथ साथ उन्हें जगह है. आयु 2-5 दिनों मक्खियों.
- मक्खी भुखमरी के लिए कक्षों की तैयारी.
- एक खाली प्लास्टिक की शीशी के नीचे तक एक भी ऊतक (4.8 x 8.4 इंच) पुश. पूरी तरह से आसुत जल से ऊतक लेना. ऊतक पर नीचे धक्का और धीरे अतिरिक्त पानी बाहर निचोड़ करने के लिए एक वस्तु का प्रयोग करें.
- अतिरिक्त पानी को रद्द करने की शीशी उलटें. वहाँ नम हाइड्रेटेड मक्खियों और भुखमरी कक्ष रखने के लिए पर्याप्त पानी हो सकता है, लेकिन मक्खियों डूब करने के लिए पर्याप्त नहीं होना चाहिए.
- एक भुखमरी चेंबर में भोजन शीशी से मक्खियों स्थानांतरण और प्रयोग शुरू होने से पहले शीशी के बारे में 18-24 घंटा प्लग. स्टोररातोंरात नियंत्रित तापमान और आर्द्रता परिस्थितियों में शीशियों प्रयोग अगले दिन शुरू होता है जब तक.
2. खाना गंध की तैयारी
- Agarose एक ग्लास कुप्पी में आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के लिए कम तापमान के पिघलने की 0.1 ग्राम जोड़कर एक 1% agarose समाधान तैयार करें. यह फोड़ा करने के लिए शुरू होता है, तो अभी तक एक माइक्रोवेव में agarose समाधान गर्मी है लेकिन इस पर फोड़े अच्छी तरह से पहले.
- माइक्रोवेव बंद करो और एक बार कुप्पी ज़ुल्फ़. Agarose पूरी तरह भंग कर दिया है जब तक दो बार अधिक इस चरण को दोहराएँ. 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक hotplate पर कुप्पी गर्म रखने के द्वारा एक तरल अवस्था में agarose समाधान रखें
- एक 1% सेब साइडर सिरका समाधान बनाने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब को 1% agarose समाधान के 990 μl और सेब साइडर सिरका के 10 μl जोड़ें. भंवर जब तक समाधान 50 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक सूखी स्नान इनक्यूबेटर में मिश्रित और जगह
3. परीक्षण कमरे और व्यवहार चैंबर सेटअप
- एलईडी पैनल (660 एनएम) चालू करें.
- गर्म पानी के साथ sieves और परीक्षण प्लेटों कुल्ला और सभी नमी हवा हो गया है जब तक एक सुखाने ओवन में उन्हें गर्मी. शुरुआत प्रयोगों से पहले परीक्षण के कमरे के तापमान को नीचे sieves और प्लेटें कूल.
- विसारक प्लेट के ऊपर एक उथले डिश स्थिति और स्थानीय नमी को बढ़ाने के लिए और agarose छोटी बूंद में पानी मुखौटा करने के लिए पानी के साथ भरें.
- पानी पकवान पर चलनी रखें.
4. परीक्षण प्लेटों में लोड हो रहा उड़ना
परीक्षण प्लेटों के लिए विनिर्देशों के साथ आरेख पूरक फ़ाइलें खंड में पाया जा सकता है. परीक्षण प्लेट स्पष्ट एक्रिलिक से बने और 6 परीक्षण एरेनास के होते है. एक साधारण स्लाइडर पर उनके संबंधित कक्षों में मक्खी लोड हो रहा है, अस्थायी रोकथाम, और 6 मक्खियों की एक साथ रिलीज की अनुमति है कि पकड़े कक्षों शामिलप्रयोग के शुरू. Odorants pipetted जाना चाहिए जहां थाली में प्रत्येक क्षेत्र के केंद्र में etched पार बाल संकेत मिलता है.
- ऐक्रेलिक परीक्षण थाली में स्लाइडर्स डालें.
- धीरे कपास प्लग अतीत शीशी में वातशोषक स्लाइड और के बारे में 6 मक्खियों aspirator.it में चलने के लिए अनुमति देते हैं उन्हें संभालने में संभव के रूप में कोमल होना महत्वपूर्ण है. एक एक मंद प्रकाश स्रोत की ओर शीशी खोलने इंगित करके वातशोषक की ओर क्रॉल करने के लिए मक्खियों को प्रेरित करने के लिए phototactic मक्खी व्यवहार का लाभ उठा सकते हैं. यदि आवश्यक हो, एक भी लगभग 6 महिला मक्खियों निकालना कोमल चूषण लागू हो सकता है.
- परीक्षण थाली के पहले होल में वातशोषक की नोक डालें. एक मक्खी होल्डिंग सेल में प्रवेश करते हैं और धीरे अगले छेद में एक मक्खी लोड करने के लिए आगे स्लाइडर अग्रिम करने की अनुमति दें. मक्खियों प्लेट के सभी 6 पकड़े कोशिकाओं पर कब्जा जारी रखें जब तक.
- सीधे करोड़ के केन्द्र पर 1% सेब साइडर सिरका agarose समाधान के पिपेट 5 μlपरीक्षण प्लेट के अंदर चेहरे पर ओएसएस बाल.
5. परीक्षण प्लेट पोजिशनिंग
- परीक्षण प्लेट के केंद्र के लिए, "पोजिशनिंग Tool.vi." नामक फ़ाइल को खोलने पोजिशनिंग उपकरण के लिए "LabVIEW छठी. छठी से पूरक फ़ाइलें खंड में पाया जा सकता है. स्क्रीन के ऊपरी बाएँ कोने में सफेद तीर पर क्लिक करके फ़ाइल चलाएँ.
- अखाड़ा उद्घाटन चलनी मंजिल सामने है, और गंध लक्ष्य प्लेट की छत पर है कि इस तरह चलनी के शीर्ष पर परीक्षण प्लेट रखें. मॉनीटर स्क्रीन पर पार बाल के साथ परीक्षण प्लेट की पीठ में etched क्रॉसहेयर संरेखित करें.
- संरेखण पूरा हो चुका है, जब मॉनिटर के ऊपरी बाएँ कोने के पास स्थित लाल डॉट पर क्लिक करके निष्पादन को रद्द कर दें.
6. प्रयोग के दौरान फ्लाई स्थिति रिकॉर्ड
- प्रत्येक खाद्य खोज परीक्षण के दौरान उड़ान के निर्देशांक ट्रैक और रिकॉर्ड करने के लिए, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर फ़ाइल खोलने "FlY ट्रैकिंग -. छह Zones.vi "LabVIEW विज़ के लिए" फ्लाई ट्रैकिंग - छह Zones.vi "पूरक फ़ाइलें खंड में पाया जा सकता है पर नजर रखने के ऊपरी बाएँ कोने में सफेद तीर पर क्लिक करके फ़ाइल चलाएँ. .
- फ़ाइल नाम निर्दिष्ट करें "ठीक है."
- परीक्षण एरेनास में मक्खियों रिलीज करने के लिए परीक्षण कक्षों में स्लाइडर्स अग्रिम. इस विश्लेषण सॉफ्टवेयर निर्देशांक के साथ अनुचित संरेखण के लिए नेतृत्व करेंगे के रूप में परीक्षण कक्षों स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
- "प्रारंभ" (रिकॉर्डिंग शुरू होता है) पर क्लिक करें और परीक्षण कक्ष में प्रकाश का एकमात्र स्रोत 660 एनएम एलईडी पैनल है कि यह सुनिश्चित करें.
- परीक्षण समाप्त हो गया है, चलनी और व्यवहार कक्ष हटा दें. चलनी से परीक्षण प्लेट उठा और बर्फ में थाली submerging द्वारा मक्खियों को हटा दें. धीरे गर्म पानी के साथ प्लेट साफ और किसी भी agarose मलबे को हटा दें. नमी को दूर करने के लिए एक सुखाने ओवन में परीक्षण प्लेटें प्लेस.
- एक smal मोड़ से परीक्षण क्षेत्र हवादारलगभग 2 मिनट के लिए एल प्रशंसक. प्रशंसक बंद करें और अगले परीक्षण की थाली में मक्खियों के अगले समूह को लोड.
7. कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण
"फ्लाई ट्रैकिंग छह क्षेत्रों के लिए डेटा विश्लेषण" पूरक फ़ाइलें खंड में पाया जा सकता है. डाटा अधिग्रहण के दौरान, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर रिकॉर्ड व्यक्तिगत मक्खी स्थिति एक पाठ फ़ाइल में हर समय बिंदु के लिए निर्देशांक. परीक्षण प्लेटों ऊपर तैनात एक डिजिटल कैमरा 0.5 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर पर छवियों को प्राप्त कर लेता है. "फ्लाई ट्रैकिंग छह क्षेत्रों के लिए डेटा विश्लेषण" एक करने के लिए कि पाठ फ़ाइल से जानकारी निकालता विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम) औसत गति की गणना, ख) सफलतापूर्वक गंध के स्रोत स्थित है, और एक मक्खी ग) चित्रमय खिड़कियों का निर्माण समय पर जो बिंदु निर्धारित देखने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति है कि: समय के साथ समय और औसत मक्खी गति पर गंध के स्रोत से स्थान, मक्खी की दूरी उड़. यह भी एक spre में आसान निर्यात के लिए डेटा स्वरूपadsheet कार्यक्रम. इस मैक्रो में, खाद्य खोज विलंबता क्षेत्र के केंद्र के एक 5 मिमी की परिधि में कम से कम 5 सेकंड खर्च मक्खियों, जिस पर समय बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है.
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर फ़ाइल "- छह क्षेत्रों फ्लाई ट्रैकिंग डाटा विश्लेषण के लिए" खोलें. "विंडोज" टैब के तहत, "नया टेबल बनाए." पर क्लिक करें छह टेबल बनाया गया है जब तक इस चरण को दोहराएँ.
- "मैक्रो" टैब के तहत, पर क्लिक करें "Foodfinding." एक मुख्य पैनल निम्नलिखित विकल्पों के साथ प्रकट करना चाहिए: ओपन कच्चे डेटा लेआउट के लिए फ़ाइल, खुले कच्चे डेटा डेटा फ़ाइल के लिए फ़ाइल; फ्लाई स्थान, दूरी, स्पीड, लेआउट, FormatDataFile.
- , एक पाठ फाइल करने के लिए मान appending बिना कच्चे डेटा को देखने के लिए पर क्लिक करें "लेआउट के लिए ओपन कच्चे डेटा फ़ाइल." जानें और प्रतीत होता है कि ब्राउज़र विंडो में प्रयोगात्मक डेटा फ़ाइल का चयन करें. पर क्लिक करें "खोलें."
- छह एरेनास (प्रत्येक मक्खी चित्रण छह XY भूखंडों 'में से प्रत्येक में प्रत्येक मक्खी के स्थान देखने के लिए "फ्लाई स्थान पर क्लिक करें"समय के साथ स्थिति) स्क्रीन पर दिखाई देनी चाहिए.
- गंध स्रोत (समय के साथ गंध स्रोत से मक्खी की दूरी चित्रण छह भूखंडों स्क्रीन पर दिखाई देनी चाहिए) से प्रत्येक मक्खी की दूरी देखने के लिए "दूरी" पर क्लिक करें. Y = 5 मिमी में क्षैतिज रेखा मक्खी खाद्य स्रोत पर स्थित माना जाता है, जिस पर सीमा को इंगित करता है.
- परीक्षण (समय पर उड़ान भरने की गति चित्रण छह भूखंडों स्क्रीन पर प्रकट होना चाहिए) के दौरान एक मक्खी की औसत गति को देखने के लिए "स्पीड" पर क्लिक करें.
- औसत (पहले 50 सेकंड के दौरान) गति और प्रत्येक मक्खी के लिए गंध स्रोत (चित्रा 1) ढूँढने के लिए विलंबता के अलावा सभी मक्खी स्थान, दूरी, और गति रेखांकन के साथ एक लेआउट प्रदर्शित करने के लिए "लेआउट" पर क्लिक करें. ठीक से लेआउट देखने के लिए, यह हाशिये समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ऐसा करने के लिए, पहली लेआउट खिड़की पर क्लिक करें. "फाइल" टैब के तहत, पर क्लिक करें "लेआउट के लिए पृष्ठ सेटअप." को हाशिये रीसेट0.2 इंच और पर क्लिक करें "ठीक है." इसके तत्काल बाद प्रत्येक स्थान साजिश के बाएँ शीर्षकों "स्पीड" और के साथ एक छोटी सी मेज है "विलंबता." प्रत्येक शीर्षक के तहत दर्ज किए गए मानों मिमी / सेकंड और सेकंड में खाद्य खोज विलंबता में औसत गति से संकेत मिलता है. लेटेंसी के तहत रिक्त प्रविष्टियाँ मक्खी गंध के स्रोत का पता लगाने में विफल रही है संकेत मिलता है. खाद्य खोज विलंबता मक्खियों कक्ष के केन्द्र से 5 मिमी की परिधि में कम से कम 5 सेकंड बिताया, जिस पर समय बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है.
- एक लेआउट मुद्रित करने के लिए, लेआउट क्षेत्र (वर्तमान फ़ाइल को अद्यतन लेआउट) पर क्लिक करें. "फाइल" पर क्लिक करें और फिर पर क्लिक करें "मुद्रण लेआउट."
- अगले फाइल देखने के लिए, बस पर क्लिक करें "लेआउट के लिए ओपन कच्चे डेटा फ़ाइल." तुम पर देखने के लिए क्लिक करें और इच्छा अगले कच्चे डेटा फ़ाइल पर क्लिक करें "ठीक है." नई डेटा फ़ाइल के साथ खिड़की को अद्यतन करने के लिए लेआउट खिड़की पर क्लिक करें.
- सेटिंग्स बाद में उपयोग के लिए एक प्रयोग फाइल में बचाया जा सकता है.
8. से निर्यात डेटाएक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर
- प्रत्येक फ़ाइल के लिए गति और विलंबता डेटा निर्यात करने के लिए, पर क्लिक करें "ओपन कच्चे डेटा डेटा फ़ाइल के लिए फ़ाइल." एक प्रयोगात्मक डेटा फ़ाइल का चयन करें "खोलें." एक नया ब्राउज़र विंडो दिखाई देगा.
- नई ब्राउज़र विंडो में, "नया" पर राइट क्लिक करें और फिर पर क्लिक करें "पाठ दस्तावेज़ नहीं." नया पाठ दस्तावेज़ का नाम. नए नाम पाठ फ़ाइल का चयन करें "खोलें." इस भंडार पाठ फ़ाइल में कच्चे डेटा फ़ाइल से डेटा.
- , अन्य फ़ाइल से डेटा निर्यात करने के लिए "डेटा फ़ाइल के लिए खुला कच्चे डेटा फ़ाइल." पर क्लिक करें एक और फाइल पर क्लिक करें और पर क्लिक करें "खोलें." ) कदम 8.2 से पाठ फ़ाइल का चयन करें. आप निर्यात करना चाहते हैं शेष डेटा फ़ाइलों के लिए इस प्रक्रिया को जारी रखें.
- सभी इच्छित डेटा फ़ाइलों पाठ फाइल करने के लिए जोड़ दिया गया है एक बार, पर क्लिक करें "स्वरूप डेटा फ़ाइल." पिछले चरण से डेटा की दुकान और एक नया windo ("ओपन" पर क्लिक करने के लिए इस्तेमाल किया पाठ दस्तावेज़ का चयनडब्ल्यू स्वतः) खुल जाएगा.
- खिड़की में एक नया पाठ दस्तावेज़ बनाएँ, फ़ाइल नाम निर्दिष्ट कर, और पर क्लिक करें "सहेजें." यह प्रत्येक उड़ान भरने और एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात किया जा सकता है के लिए फ़ाइल नाम, औसत गति, और विलंबता होता है कि एक पाठ फ़ाइल बनाता है.
- संचयी भूखंडों समय के एक समारोह (चित्रा 3) के रूप में खाना गंध लक्ष्य तक पहुँचने मक्खियों की कुल संख्या पर डेटा से निर्माण कर रहे हैं.
- प्रयोगात्मक डेटा सेट अनुपात के लिए एक z-परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व के लिए विश्लेषण कर रहे हैं.
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Representative Results
डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और लेआउट, चित्रा 1 में देखा जा सकता है एक उदाहरण है, जिनमें से विश्लेषण मापदंड का एक सेट के अनुसार अपने 10 मिनट की सुनवाई के दौरान प्रत्येक मक्खी के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है. निम्नलिखित मापदंड प्रत्येक मक्खी से डेटा डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और चोट के कारण, बीमारी, तनाव, या प्रेरणा की कमी के कारण खाद्य खोज कार्य करने में असमर्थ हैं कि उन मक्खियों को खत्म करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
300 से अधिक सेकंड के लिए निष्क्रिय हैं कि मक्खियों 'निष्क्रिय' माना जाता है और वे एक) पहले से ही खाद्य स्रोत का पता लगाने में सफल रहा है या ख) कम से कम 100 सेकंड के लिए एक औसत गति> 10 मिमी / सेक प्रदर्शन जब तक डेटा सेट से खारिज कर रहे हैं निष्क्रिय अवधि (आंकड़े 2A, 2B, -2 सी) के बाद.
स्वस्थ मक्खियों तुरंत उनके होल्डिंग कक्षों से रिहाई पर मजबूत खोज व्यवहार दिखा रहे हैं. इस प्रकार, केवल उन मक्खियों का चयन करने के लिए किसक्रिय गंध खोज के प्रारंभिक दौर के दौरान स्वस्थ गति प्रदर्शन, केवल परीक्षण के पहले 50 सेकंड के लिए गति की एक निश्चित सीमा के भीतर है कि इस कदम मक्खियों डेटा विश्लेषण के लिए स्वीकार कर रहे हैं. इस मापदंड एक) गंध के स्रोत के पास मक्खियों के रूप में, उनकी गति कम होती है और ख) कुछ मक्खियों परख के पहले 50 सेकंड के भीतर गंध लक्ष्य तक पहुँचने कि हमारी टिप्पणियों पर आधारित है. गति मापदंड एक दिया प्रयोगात्मक तापमान पर कम से कम 100 नियंत्रण मक्खियों की औसत गति का मूल्यांकन द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. क्रमशः मानक विचलन, - ऊपरी / कम गति सीमा औसत गति + / द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, 21 डिग्री सेल्सियस पर, केवल डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं परीक्षण के पहले 50 सेकंड में 3.5-10.5 मिमी / सेकंड के बीच है कि इस कदम से मक्खियों. इस नियम के अपवाद को सफलतापूर्वक पहली बार 50 सेकंड के भीतर गंध के स्रोत स्थित है और कम गति सीमा से अधिक इस प्रकार धीमी कर रहे हैं कि मक्खियों के लिए बने हैं.
क्षेत्र में सभी चार quadrants के माध्यम से कदम और सिर नहीं है कि मक्खियों सीधेपरीक्षण के बाद खाद्य स्रोत के लिए शुरू होता है (चित्रा 2 डी) खारिज कर रहे हैं.
दिशा और दूर 50 सेकंड का एक न्यूनतम के लिए एक 10 मिमी त्रिज्या के भीतर खाद्य स्रोत से बुनाई मक्खियों कि सफलतापूर्वक खाद्य स्रोत मिल गया है माना जाता है. समय के साथ गंध स्रोत से मक्खी की साजिश का चित्रण दूरी इस दुर्लभ मामले का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह स्वतः मौजूदा डेटा विश्लेषण मैक्रो से पता नहीं है और मैन्युअल रूप से पता लगाया जाना चाहिए कि एक सफल खोज के ही उदाहरण (चित्रा 2 ई) है
मक्खी की स्थिति का पता लगाने में दिखाई कलाकृतियों के साथ एरेनास खारिज कर रहे हैं. कलाकृतियों डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर मक्खी के अलावा अन्य किसी ऑब्जेक्ट का पता लगाता है, जहां किसी भी घटना से बनाया जा सकता है. वे अक्सर एरेना में विस्तार या इसके केंद्र (चित्रा 2 एफ) से विकीर्ण कि जब तक, सीधे लाइनों दिखाई देते हैं.
चित्रा 3 में, वयस्क मक्खियों 18-24 घंटा प्रदर्शनी एक उच्च ओ भूखेउनके फेड समकक्षों की तुलना में 1 भोजन संबंधी odors के लिए lfactory संवेदनशीलता. सफलतापूर्वक एक खाद्य गंध के स्रोत का पता लगाने कि मक्खियों का संचयी प्रतिशत के एक ग्राफिक साजिश सभी भूखे मक्खियों के 30% एक 10 मिनट की खिड़की के भीतर सफल होने से पता चलता है, इसके विपरीत में, सभी फेड मक्खियों का केवल 7% (चित्रा 3) ऐसा करते हैं. बढ़ा हुआ ये घ्राण व्यवहार प्रतिक्रिया पहले से बरकरार एंटीना 1 की आवश्यकता के लिए दिखाया गया है. इस परख में खिलाया और भूखे नियंत्रण मक्खियों के बीच एक स्पष्ट अंतर का पालन करने में विफलता पर्यावरण के पालन की जांच और शर्तों का परीक्षण करके हल किया जा सकता है.
समस्या निवारण परीक्षण की स्थिति के लिए एक उपयोगी रणनीति मक्खियों agarose, गंध वाहन के लिए उड़ान भरने आकर्षण को मापने के द्वारा गंध लक्ष्य के अलावा अन्य अतिरिक्त cues के लिए आकर्षित कर रहे हैं कि क्या जांच करने के लिए है. भूखे मक्खियों अकेले agarose वाहन (चित्रा 4 बी) की तुलना में सिरका के लिए एक काफी बड़ा आकर्षण का प्रदर्शन करना चाहिए. चित्रा -4 एजंगली प्रकार मक्खियों का उपयोग कर 35% की एक पर्यावरण आर्द्रता के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया था कि एक खाद्य खोज प्रयोग से प्रदर्शन का परिणाम है. इस डेटा सेट में, मक्खी सिरका के लिए आकर्षण और agarose नियंत्रण के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया गया. इस वजह से गर्म परीक्षण तापमान के तहत agarose छोटी बूंद में पाया पानी के लिए एक बढ़ती आकर्षण की संभावना है. 50-60% करने के लिए परीक्षण नमी में वृद्धि करके, हम इस व्यवहार में बदलाव के लिए सही और सिरका और agarose वाहन के लिए आकर्षण के बीच महत्वपूर्ण अंतर बहाल करने में सक्षम थे (चित्रा 4 बी, * पी मूल्य <0.05 अर्थ).
चित्रा 1. एक ठेठ विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटा लेआउट, समय के साथ स्थिति उड़ समय के साथ गंध स्रोत से दूरी मक्खी, और समय के साथ गति के लिए उड़ान भरने को दिखाता है. ऊपरी बाएँ में 2 स्तंभ तालिकाप्रत्येक क्षेत्र के कोने पहली बार 50 सेकंड (स्तंभ 1) और सेकंड में खाना खोजने (स्तंभ 2) की विलंबता के दौरान औसत गति (मिमी / सेक) को प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, खोला पाठ फ़ाइल का नाम ("OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4", के रूप में सचित्र) निचले बाएँ कोने में जोड़ा जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. सफलतापूर्वक खाद्य लगाने के बाद निष्क्रिय कर दिया गया है कि निशान के विभिन्न प्रकार के उदाहरण विश्लेषण मापदंड में संबोधित किया. ए.) + 300 सेकंड के लिए निष्क्रिय कर दिया गया है कि फ्लाई खारिज कर दिया है. बी.) फ्लाई स्वीकार कर लिया है. सी.) के लिए निष्क्रिय कर दिया गया है कि फ्लाई निष्क्रिय अवधि. डी की स्वीकृति के बाद 300 + सेकंड लेकिन कम से कम 100 सेकंड के लिए मजबूत गतिविधि को दर्शाता है.) वें फ्लाई सीधे रिलीज के बाद खाद्य स्रोत के लिए सिर पर खारिज कर दिया है. ई.) की ओर और दूर 50 सेकंड का एक न्यूनतम के लिए एक 10 मिमी त्रिज्या के भीतर खाद्य स्रोत से बुनाई सफलतापूर्वक खाद्य स्रोत मिल गया है माना जाता है और स्वीकार किए जाते हैं कि मक्खियों. एफ लेआउट में दिखाई कलाकृतियों के साथ.) एरेनास खारिज कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. भोजन खोजने की विलंबता का उपयोग समय के साथ गंध के स्रोत को लगता है कि फेड और भूखे मक्खियों की एक संचयी प्रतिशत दिखा ग्राफिकल साजिश है. (एन = 88-96 मक्खियों, * पी मूल्य अर्थ <0.05, ** अर्थ पी मूल्य <0.01).
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चित्रा 4. समय के साथ 1% सिरका या agarose वाहन को लगता है कि मक्खियों का संचयी प्रतिशत दिखा समस्या निवारण परीक्षण की स्थिति ए) ग्राफिकल साजिश है. कोई महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण की स्थिति में 32 डिग्री सेल्सियस पर थे जब गंध लक्ष्य या तो मक्खी आकर्षण में पता लगाया है और 35% आर्द्रता (एन = 62-94 मक्खियों). बी) ग्राफिकल प्लाट 1% सिरका या agarose वाहन को लगता है कि मक्खियों का संचयी प्रतिशत दिखा रहा था समय के साथ. परीक्षण की स्थिति में 32 डिग्री सेल्सियस और 50-60% नमी में थे. इन शर्तों के तहत, मक्खियों काफी अधिक agarose वाहन को 1% से सिरका की ओर आकर्षित कर रहे हैं (एन = 55-71 मक्खियों, * पी मूल्य <0.05 अर्थ).
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम खाद्य खोज व्यवहार परख के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन. भोजन संबंधी odors के अलावा, यह भी अन्य गंध वस्तुओं का पता लगाने के लिए उड़ान भरने की क्षमता के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यह पुरुष मक्खियों 3 में दोस्त स्थानीयकरण व्यवहार के अध्ययन की ओर लागू किया जा सकता है कई अतिरिक्त विचार है कि हम इस प्रक्रिया के बारे में यहाँ का उल्लेख होगा कि इस प्रोटोकॉल के लिए कर रहे हैं.:
सबसे पहले, पालन तापमान प्रयोगात्मक मक्खियों के परीक्षण से पहले वृद्ध जाना चाहिए कितनी देर तक निर्धारित करता है. यह उम्र की एक श्रृंखला के प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त उम्र निर्धारित करने के लिए जांच की जा सिफारिश की है. 21 डिग्री सेल्सियस पर पाला जब उदाहरण के लिए, हमारे अनुभव में, फेड और भूखे मक्खी प्रतिक्रियाओं के बीच मतभेद वे 4-5 दिन की आयु के लिए किया गया है के बाद सबसे मजबूत कर रहे हैं.
दूसरा, एल ई डी भी वीं के नीचे रोशनी, स्थिर बनाने के लिए कार्य करता है जो एक गिलास विसारक थाली रोशनई ऐक्रेलिक कक्षों. पर्याप्त भी, स्थिर, और चमकदार रोशनी मक्खी आंदोलन की स्वचालित ट्रैकिंग के लिए महत्वपूर्ण है. असमान प्रकाश या प्रकाश स्रोतों चंचल मक्खी की स्थिति का पता लगाने या मक्खी के रूप में प्रकाश कलाकृतियों गलती करने के लिए सॉफ्टवेयर पैदा करने के लिए रुक - रुक कर असमर्थता में परिणाम है कि या तो मक्खी की स्वचालित ट्रैकिंग में त्रुटियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलईडी या एक कस्टम निर्मित एलईडी सरणी काम समान रूप से अच्छी तरह से इस परख के लिए रोशनी की जरूरत को पूरा करने में दोनों पाया है.
सॉफ्टवेयर गलती से प्रकाश में छोटे परिवर्तन या agarose के रूप में अतिरिक्त वस्तुओं, "फ्लाई ट्रैकिंग छह जोन" अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में वस्तु का पता लगाने सेटिंग्स का पता लगाता है, तो तीसरा, सीमा के साथ ही वस्तु के आकार के लिए समायोजित किया जा सकता है. पता लगाने सेटिंग समायोजित करने के लिए केवल एक वस्तु के प्रत्येक क्षेत्र में पता चला है कि यह सुनिश्चित करता है. प्रत्येक क्षेत्र में पता लगाया जा रहा है वस्तुओं की संख्या को देखने के लिए, "फ्लाई ट्रैकिंग छह Zon की" सीमा "टैब पर क्लिक करेंतों "अधिग्रहण सॉफ्टवेयर. से अधिक वस्तु पर नज़र रखी जा रही है, तो पता चला विरूपण साक्ष्य गायब हो जाता है, जब तक एक न्यूनतम आकार, अधिकतम आकार, न्यूनतम सीमा, या अधिकतम सीमा को समायोजित कर सकते हैं.
चौथा, इन प्रयोगों में इस्तेमाल शेयरों isogenized जाना चाहिए उड़. इस प्रतिमान में व्यवहार प्रदर्शन आनुवंशिक पृष्ठभूमि में अंतर करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं. Mated महिलाओं संभोग स्थिति या लिंग के साथ जुड़े संभावित व्यवहार परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस परख पुरुषों या कुंवारी महिलाओं के व्यवहार का अध्ययन करने में समान रूप से प्रभावी नहीं होगा विश्वास करने का कोई कारण नहीं है.
पांचवां, चलनी गंध ढाल (निलंबन हमारे वाणिज्यिक खरीदा मॉडल के साथ लगभग 2 सेमी है) की गंध संतृप्ति को रोकने के लिए थोड़ा प्रकाश विसारक प्लेट के ऊपर निलंबित किया जाना चाहिए. हम परीक्षण प्लेटों के नीचे एक झरझरा मंजिल बनाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चलनी का उपयोग करें.
अंत में, क्रम में विश्वसनीय आंकड़े का उत्पादन करने के लिएसेट, स्थिरता प्रयोगात्मक पालन और परीक्षण की स्थिति में आवश्यक है. नियंत्रण मक्खियों में खिलाया और भूखे प्रतिक्रियाओं के बीच काफी अंतर देखने के लिए किसी विफलता 1) मक्खियों स्थिर तापमान और आर्द्रता परिस्थितियों में पाला रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए जाँच करके हल किया जा सकता है, 2) मक्खियों, ताजा भोजन के साथ खिलाया जाता है और भीड़ की स्थिति में उनका पालन नहीं कर रहे हैं 3) नव eclosed सीओ 2 के लिए जोखिम उड़ान भरने के कम से कम है, 4) अनुभव भुखमरी का एक ही लंबाई मक्खियों, 5) मक्खियों स्थिर तापमान और आर्द्रता परिस्थितियों में परीक्षण कर रहे हैं, और 6) परीक्षण पर्यावरण और कक्षों पिछले परीक्षण से odors के साथ दूषित नहीं कर रहे हैं या प्रयोगों. विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि इस परख में मक्खी प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में aforementioned मापदंडों के अलावा, मक्खी शेयरों की isogenization महत्वपूर्ण है. सिरका गंध के स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है इसके अलावा, अगर, देखभाल यह कसकर 4 डिग्री सेल्सियस पर सील और संग्रहीत इसे रखने के द्वारा अपनी शक्ति खो नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए
6 या चार क्षेत्र olfactometer 4,5 के रूप में गंध विकल्प के साथ उड़ कि वर्तमान व्यवहार assays से मापा जाता है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01DK092640) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (0920668) से JWW के लिए अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
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