Summary
المصل المستخدمة في الثقافات الجنين يحتوي على مكونات غير معروفة يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب وخاصة في الدراسات التي تنطوي على إشارات التفاعلات. نحن هنا لاستخدام الاوكسيجين نظام الثقافة المصل خالية وتبين أن الأجنة منتصف الحمل الماوس تربيتها لمدة 16-40 ساعة تظهر التنمية المورفولوجية مماثلة لأجنة النامية في الرحم.
Abstract
تم تربيتها الأجنة منتصف الحمل مرحلة الماوس الاستفادة من مستنبت المصل خالية أعدت من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا المكملات الخلايا الجذعية في نظام الثقافة زجاجة المتداول الاوكسيجين. أجنة الفئران في E10.5 تم عزل بعناية من الرحم مع سليمة صفار الكيس وفي عملية تنطوي على المناورة جراحية دقيقة الأجنة وexteriorized بلطف من الكيس المحي مع الحفاظ على استمرارية الأوعية الدموية للجنين مع الكيس المحي. مقارنة مع الأجنة أعدت مع سليمة صفار الكيس أو الكيس المحي مع إزالتها، عرضت هذه الأجنة معدل البقاء على قيد الحياة متفوقة والتقدم التنموي عندما مثقف في ظل ظروف مماثلة. وتبين لنا أن هذه الأجنة الماوس، عندما مثقف في المتوسط المحدد في أجواء من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 16-40 ساعة، تظهر النمو المورفولوجية والتنمية مماثلة ل الأجنة النامية في الرحم. نعتقد الهو الأسلوب سوف تكون مفيدة للمحققين الذين يحتاجون إلى الاستفادة من ثقافة الجنين كله لدراسة التفاعلات إشارات هامة في توالد الأعضاء الجنينية.
Introduction
في المختبر باستخدام أساليب الثقافة الأجنة كلها هي مناسبة تماما لدراسة الآليات التي تشارك في إشارة توالد الأعضاء الجنينية التي يصعب الوصول إليها إلا في الرحم. توفير الأجنة الجامعة على سلامة الأنسجة والدعم المناسب للتفاعلات الأنسجة التي تعتبر حاسمة بالنسبة لحدوث الوقت المناسب مما يشير الآليات الأساسية للعمليات الخلوية المختلفة خلال توالد الأعضاء. بينما توفر الثقافات الجنين كله منبرا لمجموعة كبيرة من التطبيقات مثل دراسات الزرع، التلاعب الجيني والأنسجة، والدراسات حبة زرع والدراسات السمية، الخ.، ونظم الثقافة الجنين المستخدمة حاليا تعتمد بشكل أساسي على مصل للنمو السليم والحفاظ على الأجنة في الثقافة 1-9.
وقد استخدمت المصل باعتبارها واحدة من المكونات الرئيسية التي تتراوح 10-100٪ من وسائل الإعلام الثقافة 6-8، 10، 11.؛ ومع ذلك، فإن تركيبة المصل لم يتم تعريف بشكل جيد ويمكن أن تختلف من حيوان إلى حيوان وفي كل مرة يتم جمع المصل. في حين إعداد مختبر المصل هو مضيعة للوقت وينطوي على إجراءات صارمة، مصل شراؤها يسلك تجاريا تفاوتا كبيرا بين الكثير مختلفة ويرفع تكاليف التجريبية. تضاف إلى هذه، قد يحتوي المصل عوامل غير معروفة مثل عوامل النمو والهرمونات والبروتينات أو غيرها، والتي يمكن أن تؤثر على نتائج بعض التجارب، وخاصة تلك التي تنطوي على دراسة إشارات جزيئات مهمة في تفاعلات الأنسجة. وقد أظهرت الدراسات أن إضافة مصل للثقافة يمكن أن يحتمل تغيير مستويات الخلايا من بعض الجزيئات يشير الى مثل أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) والبروتينات المشاركة في إشارة مولد للتفتل وفسفوإينوزيتيد 3 (PI 3) كيناز مسارات إشارات 12-14. خلافا لهؤلاء، نظام الثقافة المصل خالية يوفر مزايا البيئة مستضد الحرة،الامتناع عن الانزيمات النشطة بيولوجيا التي يمكن أن تغير العمليات الخلوية ويتيح الاتساق بين التجارب.
في هذه الدراسة، ونحن تستخدم لمستنبت المصل خالية أعدت من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا المكملات الخلايا الجذعية لثقافة مرحلة منتصف الحمل الأجنة كله في جو من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 ° C 15،16. أجنة الفئران مثقف ل16-40 ساعة في ظل هذه الظروف المحددة عرضت التقدم في التنمية الصرفي من الجسم ومختلف الهياكل الشاملة الجنينية مثل القلب والأطراف والمخ والعينين تشير مستويات مناسبة من انتشار الخليوي، والهجرة، والتمايز والتفاعل الأنسجة. وكشف التحليل الجزيئي للالتطور الجنيني في الثقافة لأحد أنظمة جهاز معقد مثل العين تطور العين لتكون متسقة مع تلك التي لوحظت في أنسجة العين في EMBRيوس النامية في الرحم (Kalaskar وودرديل، قيد الإعداد). وهكذا تبين لنا أن أجنة الفئران مثقف في مرحلة منتصف الحمل، تظهر النمو المطرد والتنمية المورفولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في الأجنة النامية في الرحم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الماوس الثقافة الجنين:
وأجريت كافة الإجراءات التجريبية وفقا صارمة مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية التالية بروتوكول # A2010 07-119، الذي تم مراجعتها والموافقة عليها من قبل جامعة جورجيا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، التي تحافظ استمرت الرقابة التنظيمية.
1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام
- تحضير مستنبت باستخدام وسائل الإعلام الخلايا الجذعية المتاحة تجاريا والمكملات الغذائية في المبالغ التالية: خروج المغلوب DMEM، خروج المغلوب المصل استبدال (KSR) (10٪)، N-2 الملحق (1X)، الزلال، من المصل البقري (2٪)، البنسلين ( 50 وحدة دولية / مل)، الستربتوميسين (50 ميكروغرام / مل) والامفوتريسين-B (1.25 ميكروغرام / مل). مستنبت أعدت مماثلة لتلك التي سبق وصفها 15 مع التغييرات التالية: إضافة لمكافحة mycotics واستخدام ضعف تركيز المضادات الحيوية (للاطلاع على تفاصيل الكواشف والمعدات محددة، انظر لىالحادي والمواد).
ملاحظة: تركيز المضادات الحيوية المستخدمة سابقا (. سكوت مور، 15 وآخرون) كان كافيا للثقافات الجنين حمل ما يصل إلى 24 ساعة الفترة الزمنية. ولكن عندما استمر ثقافة ما بعد 24 ساعة، عانينا من التلوث من الثقافة وهذه كانت تسيطر بنجاح من خلال مضاعفة تركيز المضادات الحيوية. - تخزين مكونات وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية أو في -20 درجة مئوية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. KSR وN-2 الملحق يجب أن يتم تخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية لتجنب تكرار تجميد والذوبان. خروج المغلوب DMEM فتحت مرة واحدة ينبغي أن تستخدم في غضون 30 يوما وفقا لتوصية الشركة الصانعة. قبل استخدامها، تدفئة المكونات في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد وسائل الإعلام تحت ظروف معقمة. تطهير السطح من جميع المعدات والزجاجات التي تحتوي على مكونات وسائل الإعلام مع 70٪ رذاذ الكحول قبل وضعها في الثقافة هود.
- مكونات وسائل الإعلام يمكن أن تكون مختلطة إما في كوب معقمة أو مباشرة في نظام تصفية (كورنينج). أولا إضافة مسحوق الزلال إلى خروج المغلوب DMEM. مزيج دقيق من قبل يهز بلطف حتى يذوب تماما الزلال. قم بإضافة الملحق N-2، KSR والمضادات الحيوية وتخلط جيدا باستخدام pipettor. ثم تصفية تعقيم وسائل الإعلام باستخدام 0.22 ميكرون حجم المسام تصفية فراغ مع الشفط. الاستغناء عن وسائل الاعلام في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها. أعدت وسائل الإعلام مرة واحدة وينبغي أن تستخدم في غضون 4-5 أيام للثقافة.
2. إعداد معدات الثقافة
- تعقيم الزجاجات الثقافة الزجاج والفلين والمطاط. التفاف زجاجات الثقافة في رقائق الألومنيوم ووضع الفلين زجاجة المطاط في كوب الماء وتعقيم بواسطة التعقيم.
- تعقيم غرفة الثقافة (وحدة حاضنة الدقة) مع 70٪ رذاذ الكحول ودافئة إلى 37 درجة مئوية قبل البدء في الثقافة. غرفة الثقافة الإلكترونيةساخرا مع قرص المتداول في المركز الذي يحمل زجاجات الثقافة. وينظم تدفق الغاز الى غرفة من قبل قياس الضغط، ويمكن تعديله معدل التدفق من خلال مراقبة تدفق فقاعات الهواء من خلال الماء في أنبوب زجاجي في نهاية المطاف. هذا المتداول زجاجة جهاز الثقافة هو نسخة معدلة من الجهاز الأصلي الذي عرضته جديد وكوكروفت 17.
- توصيل اسطوانة غاز تحتوي على خليط الغاز من 95٪ O 2/5٪ CO 2 إلى غرفة الثقافة وضبط تدفق الغاز إلى "فقاعة هواء واحد في الثانية الواحدة" الذي يعطي معدل تدفق 50 سم / دقيقة ويضمن امدادات كافية من الأوكسجين إلى الأجنة الثقافة.
3. الماوس الأجنة جمع وإعداد للثقافة
- للحصول على النوع البري أجنة الفئران، ونحن الاستفادة من الفئران C57BL/6J وCD-1 (مختبرات نهر تشارلز) سلالات الخلفية الوراثية.
- التحقق من إناث الفئران عن المقابس المهبل كل صباح اليوم. في ظهر يوم من العثور على الوينبغي النظر في المكونات الإلكترونية المهبل كما E0.5 DPC (آخر أيام الجماع).
- جمع أجنة الفئران في E10.5 DPC بواسطة القتل الرحيم الفئران الحوامل التالية البروتوكولات القياسية. والموت الرحيم الفئران باستخدام جهاز الاستنشاق CO 2 كما هو محدد من قبل الجمعية الأميركية للطب البيطري (اخر احصاء) المبادئ التوجيهية للالقتل الرحيم للحيوانات (2013). لضمان الموت، تم تنفيذ خلع عنق الرحم بعد التعرض لأول أكسيد الكربون 2.
- رذاذ الايثانول 70٪ على السطح البطني البطن لتجنب التصاق الشعر في البطن لهذه الصكوك. ثم فتح تجويف البطن البطني باستخدام مقص حاد حادة التشغيل وزوج من 4-3/4 في microdissecting ملقط لتحديد موقع الرحم. باستخدام ملقط 4 في microdissecting رفع الرحم بالكامل وفصلها عن الجسم عن طريق قطع مع مقص التشغيل الضوء في جسم الرحم وعلى نصائح من قرون الرحم.
- شطف بسرعة الرحم بأكمله في برنامج تلفزيوني 1X تحسنت إلى 37 درجة مئويةلإزالة أي خلاف الدم إلى الرحم ووضع على الفور في DMEM تحسنت إلى 37 درجة مئوية في طبق بتري. تعقيم الأدوات بنسبة 70٪ رذاذ الايثانول قبل استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: التسخين الحلول بما في ذلك برنامج تلفزيوني، DMEM والمتوسطة الثقافة والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله من المستحسن. - تحت المجهر تشريح، الرحم ينبغي تشريح segmentally مع ضوء مقص التشغيل. هذه النتائج في فتحات صغيرة على جانبي الرحم مجزأة من خلالها زوج من تعديل (نهايات اضعافها) ملاقط microdissecting يمكن إدراج بلطف لتوسيع الافتتاح. هذا يسمح التعرض للالساقط المشيمة، ومن ثم يمكن إزالتها عن طريق تمزيق بلطف مع زوج من ملاقط microdissecting لفضح الكيس المحي الجداري (PYS) مع غشاء رايخرت. باستخدام حافة واحدة من ملاقط بلطف يخترق غشاء رايخرت جنبا إلى جنب مع PYS وفصل من اله الكامنة الحشوية الكيس المحي (VYS) طبقة لفضح الأجنة مع VYS سليمة. يمكن إزالة مخروط المشيمة الظاهر والمشتقات trophoectoderm إما مع الساقط المشيمة أو مع غشاء رايخرت. يجب توخي الحذر لتجنب تمزق VYS كما الأجنة تخرج فورا.
- وينبغي بعد ذلك يتم نقل الأجنة مع VYS سليمة إلى طبق بتري تحتوي على مستنبت تحسنت إلى 37 درجة مئوية باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
ملاحظة: نقل إلى مستنبت مباشرة بعد الانفصال عن الرحم يساعد على تنمية أفضل للجنين في الثقافة. - وينبغي بذل فتحة صغيرة في الكيس المحي مع زوج من ملاقط microdissecting تجنب الأوعية الدموية الرئيسية. ألف زوج من ملاقط حادة يمكن استخدامها لجعل الافتتاح ثقب بلطف في المنطقة المتاخمة لمنطقة الرأس. بدلا من اثنين من أزواج من ملاقط حادة يمكن أن تستخدم لعقد الكيس المحي وبلطف المسيل للدموع لجعل فتحة صغيرة.ثم توسيع بلطف افتتاح طريق توسيع مع ملاقط إلى حجم ما يكفي لتناسب الرأس الجنينية. الغشاء الذي يحيط بالجنين الذي يلف الجنين بشكل وثيق ينبغي أن تعقد بلطف بعيدا عن الجسم وممزقة باستخدام زوج من ملاقط. رئيس الجنينية والجنين في وقت لاحق كله ينبغي exteriorized بلطف من الكيس المحي مع الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية الجنينية مع أن من الكيس المحي 15.
ملاحظة: أي الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية الكيس المحي يمكن أن يؤثر على تطور الجنين في الثقافة. هذه الأجنة مع الأوعية الدموية التالفة لا ينبغي أن تستخدم للثقافة، ويمكن استخدامها لتنظيم الأجنة التي يمكن فيما بعد التخلص منها. - معايير التدريج الجنينية: فحص الأجنة تحت المجهر تشريح ومجموعة وفقا لمعايير شكلية بما في ذلك الجسم وحجم الرأس والأطراف والعين والتشكل المرحلة عن طريق عد عدد الجسيدة (ق) لمدة سنتين على الأقل الأجنة من كل مجموعة.
<قوية> ملاحظة: عادة الأجنة التي تم الحصول عليها من نفس المعرض القمامة الاختلافات في التنمية في الرحم وتختلف في حجم الجسم، وميزات المورفولوجية وعدد من somites. ومع ذلك، وجدنا أن الأجنة التي تم تجميعها حسب المعايير المورفولوجية لدينا عادة عرضت عدد الجسيدة مماثلة (± 1). لهذا السبب، ليس مطلوبا لحساب somites لكل الجنين لأن هذا من شأنه أن يؤخر الوقت للبدء في الثقافة.
ملاحظة: لا تستخدم الأجنة التي تم استخدامها لحساب و somites للثقافة. عد و somites بعد بدء الثقافة للأجنة أخرى من أجل تجنب تأخير الوقت في البدء في الثقافة. الأجنة التي تم تأجيلها للثقافة بعد الانفصال عن الرحم عادة ما تظهر سوء التنمية. - نقل الأجنة فورا إلى طبق بتري مع ثقافة جديدة المتوسطة تحسنت إلى 37 درجة مئوية، وأعتبر أن الثقافة هود مرة أخرى حيث يجب أن يتم نقل الأجنة إلى طبق بتري مع الثقافة العقيمةوسائل الإعلام الإلكترونية قبل وضعها في زجاجات الثقافة مع المتوسطة لبدء الثقافة.
ملاحظة: إن وسائل الإعلام المتعددة لنقل الأجنة قبل الثقافة يساعد في منع التلوث حيث تم تنفيذ الخطوات المختلفة لجمع الأجنة وتشريح تحت المجهر تشريح التي لم يتم تثبيت في الثقافة هود.
ملاحظة: عندما يكون حجم القمامة كبيرة (> 12 الأجنة)، عملية نصف الأجنة وبدء الثقافة أو وضعها في طبق مع مستنبت وضعه في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية. عندما تركت الأجنة خارج لفترات أطول (> 35-40 دقيقة) لاحظنا ضربات القلب لإبطاء، وهذا سوف يؤثر على تطور لاحق في الثقافة.
4. زراعة أجنة الفئران
- فتح زجاجات الثقافة تعقيمها في غطاء محرك السيارة والثقافة، وصحيح تسمية لهم. نقل 3 مل من مستنبت تحسنت إلى 37 درجة مئوية إلى كل من رانه الزجاجات ومن ثم ينبغي نقل الأجنة الماوس برفق في زجاجات معقمة الثقافة باستخدام الماصات البلاستيكية نقل. وينبغي بعد ذلك توج الزجاجات الثقافة مع الفلين زجاجة المطاط التي تساعد على الاستمرار على زجاجات الثقافة إلى القرص المتداول في الجهاز الثقافة.
ملاحظة: الزجاجات الثقافة مع وسائل الإعلام يمكن أن تكون على استعداد ووضعها على القرص المتداول من قبل جهاز ثقافة القتل الرحيم الفئران. هذا تقصير الوقت لنقل الأجنة في زجاجات الثقافة.
ملاحظة: أجنة الفأر يمكن تربيتها بشكل فردي أو كما cocultures مع اثنين أو ثلاثة أجنة في زجاجة الثقافة نفسها. - الزجاجات الثقافة ينبغي إجراء جو معقم و مطهر للجهاز الثقافة في 37 درجة مئوية، وربط بإحكام لهم الثقوب على القرص المتداول مع الفلين المطاط. بدوره على القرص المتداول لتدوير بسرعة ثابتة من 35 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة)، والتي تمكن التعويم الحر للEMBRيوس في وسائل الإعلام، وكذلك يساعد في تبادل الغازات المجاني من الأنسجة الجنينية. الغاز من اسطوانة متصلة غرفة الثقافة يتدفق عبر القرص المتداول والفلين والمطاط في زجاجات الثقافة.
- ثقافة الأجنة ل16-40 ساعة وبانتظام تحقق لتدفق الغاز ودرجة حرارة غرفة الثقافة.
ملاحظة: الفأر التلاعب الجنين في الثقافة: دعونا الحصول على تكييفها الأجنة لشروط الثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم الأجنة التي تظهر أداء ضعيفا واهنا ضربات القلب يمكن التخلص منها ويمكن استخدام الأجنة المتبقية لإجراء المزيد من الدراسات التلاعب. التلاعب الجنين مثل 5،9،16 التثقيب الكهربائي، إبر دقيقة جدا 18 حبة زرع 16، العلاج من تعاطي المخدرات وغيرها من الإجراءات لا يمكن أن يؤديها في هذا الوقت. أجرينا بنجاح زرع حبات الاغاروز افى جل تعامل مع بعض الجزيئات يشير الى دراسة دورها في التنمية العين في وقت مبكر. الأجنة بعديمكن إرجاع التلاعب مرة أخرى في وسيلة جديدة، واستمر في الثقافة. - استبدال سائل الإعلام والثقافة تماما مع وسائل الإعلام الجديدة على فترات محددة بعد 9-10 ساعة 18-19 ساعة والثقافة عندما استمر الثقافة لمدة 40 ساعة.
ملاحظة: قد لا تكون هناك حاجة الثقافة استبدال وسائل الإعلام إذا تم إيقاف الثقافة عن طريق 16-18 ساعة. - مقاييس النجاح في الثقافة: ينبغي أن تحدد بقاء الجنينية في الثقافة عن طريق نبضات القلب والدورة الدموية وضوحا في الجسم في حين ينبغي تقييم النمو الجنيني في الثقافة عن طريق الزيادة في حجم الجسم، وعدد الجسيدة والتنمية المورفولوجية للرئيس، وأطرافه والقلب والعينين.
- في الرحم وضعت الأجنة في E11.0 DPC (~ 40-41 ق) وE12.0 DPC (~ 49-50 ق) ينبغي أن تستخدم ضوابط لمقارنة الأجنة تربيتها لمدة 16-18 ساعة و38-40 ساعة، على التوالي.
- التطور الجنيني في نقاط زمنية مختلفة خلال الثقافة وللفي مراحل الرحم يمكن الكابتنمحكم تحت مجهر تشريح. وقد استخدمت برامج التصوير بقعة لالتقاط الصور ومعالجتها في وقت لاحق باستخدام برامج معالجة الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطوير أجنة الفئران السابقين الرحم يعتمد على عوامل متعددة بدءا من الوقت الذي يتم عزل الرحم من الجسم إلى الوقت الأجنة هي مثقف. كما هو مبين في الشكل 1، الإجراء ينطوي على سلسلة من الخطوات بما في ذلك، والفصل بين الرحم حامل من الجسم (الشكل 1A)، عزل الأجنة سليمة مع الكيس المحي (الشكل 1B)، الاهتمام لأمور ظاهرية من الأجنة من الكيس المحي ( الشكل 1C) وزراعة الأجنة في وسائل الإعلام الحرة المصل في جو من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية. أظهرت الأجنة البقاء على قيد الحياة بنسبة 100٪ عند نقلها إلى وسائل الإعلام ثقافة فورا بعد الانفصال عن الرحم. في ظل هذه الظروف والثقافة، وأجنة الفئران عند تربيتها لمدة 16-40 ساعة عرضت النمو والتنمية المورفولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في الأجنة النامية في مرحلة ما يعادلهاالرحم (الشكل 2).
الأجنة في E10.5 (~ 34-35 ق) (الشكل 2A) عند تربيتها لمدة 16-40 ساعة على قيد الحياة ومتقدمة في مجال التنمية إلى ما وراء مرحلة 35 ق. وأضاف حوالي 5-6 ق اظهار معدل نمو الجسيدة واحد لكل ساعتين ونصف في الثقافة وكانت مماثلة شكليا لE11.0 (~؛ الأجنة بعد 16-18 ساعة في الثقافة (الجدول 1 الأرقام 2D و 3B) ق 40-41) وضعت الأجنة في الرحم (أرقام 2B و3A). على الرغم من تأخر التنمية من خلال حوالي ساعة، عرضت هذه الأجنة في الثقافة زيادة عامة في حجم الجسم والرأس متناسبة مع حويصلات الدماغ متميزة. أظهرت الأجنة أيضا على تطوير براعم الأطراف، تشكيل حجرات القلب بشكل جيد وظهور التصبغات في البشرة المصطبغة الشبكية. ومع ذلك، لوحظ هذا النوع من التنمية في حوالي 58٪ من الإدارة الانتخابيةمثقف ryos بينما 28٪ من الأجنة أظهرت تطورا المتوسطة (الشكل 3C). وأظهرت هذه الأجنة في وقت لاحق حجم أصغر الجسم على الرغم من أنها لديها عدد الجسيدة مماثلة مقارنة مع الأجنة في الرحم المتقدمة. كان لديهم رئيس أصغر نسبيا، على الرغم من ترسيم حويصلات الدماغ. كانت حجرات القلب لا متميزة وبراعم الأطراف في بعض الأجنة أظهرت المناطق المظلمة في الأطراف. في الطرف الآخر من الطيف، حوالي 14٪ من الأجنة أظهرت التنمية الفقراء في الثقافة (الشكل 3D). كان لهذه الأجنة الجسم والرأس أحجام أقصر وأظهرت المناطق المظلمة في بعض أجزاء الجسم يوضح التغيرات التنكسية. على الرغم من أن القلب كان الضرب كان سوء المتقدمة وتفتقر إلى التمايز إلى غرف في بعض الأجنة حين بدا الظلام والمتخلفين في النمو في بلدان أخرى أطرافه.
واصلت الأجنة في الثقافة ل38-40 ساعة (الشكل 2E؛ الجدول 1) شالمستحقة عن 49-50 ثانية وكانت مماثلة للأجنة E12.0 (الشكل 2C) وضعت في الرحم. على الرغم من تأخر 2-3 ساعة، عرضت هذه الأجنة في الثقافة زيادة متناسبة في حجم الجسم وأظهرت توالد والأنسجة المناسبة تمايز كما لوحظ في تطوير تصبغ في الظهارة الصباغية الشبكية وتشكيل خطم ترسيمها بشكل جيد في منطقة الرأس. على الرغم من بعض الأجزاء في الأطراف مثل براعم الأطراف والذيل يبدو أن المتخلفة، يبدو أن الأجنة النامية يضاهي في الرحم الأجنة. ومع ذلك، لوحظ هذا النوع من التنمية في 30-40٪ فقط من الأجنة مثقف (الجدول 1) في حين أن بقية منهم عرضت مجموعة من التقدم التنموي مع مجالات النمو المتخلفين أو التخلف في بعض أجزاء الجسم أو الجنين كله.
وبصرف النظر عن الاختلافات أعلاه في التنمية، لاحظنا اح كبيرة الامتحانات التنافسية الوطنية في مجال التنمية عندما تم cocultured الأجنة في زجاجة الثقافة نفسها. بالمقارنة مع غيرها من الجنين (أرقام 4A 4A و') في coculture، الجنين متطورة (أرقام 4B و 4B' عرضت) نمو أفضل في جميع جوانب التطور الجنيني. وقد لوحظت اختلافات كبيرة في حجم الجسم عموما وحجم الرأس وأحيانا في قلب والتنمية أطرافهم. في حين كان الجنين متطورة من coculture مقارنة شكليا إلى الأجنة النامية في الرحم، الجنين أخرى في coculture وقد ظهرت دائما إلى أن تكون أقل نموا مقارنة الجنين متطورة. وقد لوحظ هذا النوع من الفرق في التنمية في 45٪ من cocultures (N = 27)، في حين أظهرت بقية cocultures (N = 33) تطور مماثل تقريبا في كل من الأجنة في coculture.
ه 1 "لل: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
الشكل 1. خطوات في الماوس بروتوكول الثقافة الجنين. (A) حامل الرحم مع الأجنة المعزولة من الماوس الأم. (ب) أجنة سليمة مع الكيس المحي فصلها عن الساقط بعد تشريح قطعي من الرحم. (C) exteriorized الأجنة من الكيس المحي. (D) زجاجة المتداول جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية، والمتوفرة مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 لزراعة أجنة الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
<ر /> الشكل 2. الأجنة في الثقافة تكرار في التنمية الرحم. وفي تطور الرحم في E10.5 (A)، E11.0 (B) وE12.0 (C). التنمية في الثقافة بعد 18 ساعة (D) و 40 ساعة (E). ينطبق شريط النطاق في (E) لجميع لوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. التنمية الجنينية في الثقافة. وضعت الجنين في الرحم في E11.0 DPC (A). التنمية في الثقافة (B، C، D). (B) تمثيل التطور الجنيني جيدة في الثقافة. حوالي 58٪ من مجموع الأجنة مثقف المعرض التنمية مماثلة لفي الرحم وضعت الأجنة. (C) التمثيل التنمية المتوسطة في الثقافة. حوالي 28٪ من الأجنة مثقف المعرض التنمية المتوسطة. (D) تمثيل التطور الجنيني الفقراء في الثقافة. تظهر حوالي 14٪ الأجنة التنمية الفقراء في الثقافة. ينطبق شريط النطاق في (D) لجميع لوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الاختلافات التنموية في نظام الماوس الجنين coculture. الأجنة في بداية coculture (A B). التطور الجنيني بعد 16 ساعة من coculture (A '، B'). "يظهر تحت الحجم بالمقارنة مع غيرها من الجنين (B احدة من الأجنة في coculture (A) ') في coculture. ينطبق شريط النطاق في (B ') لجميع لوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مجموع الأجنة مثقف ل16-18 ساعة | التنمية بعد زراعة ل16-18 ساعة | مجموع الأجنة مثقف ل38-40 ساعة | التنمية بعد زراعة ل38-40 ساعة | |||
| جيد | متوسط | فقير | جيد | فقير | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
الجدول 1. تطوير الأجنة في جنين فأر نظام الثقافة. الأجنة تربيتها لمدة 16-18 ساعة أو إما 38-40 ساعة. من مجموع 112 مثقف الأجنة ل16-18 ساعة، 65 (58٪) مقارنة الأجنة أظهرت التنمية إلى الأجنة النامية في الرحم، 31 (28٪) وأظهرت المتوسطة وأظهرت 16 (14٪) تنمية الفقراء. من مجموع 12 الأجنة مثقف ل39-40 ساعة، وأظهرت فقط 4 (~ 35٪) الأجنة تطور جيد في حين أن الباقين أظهرت التنمية الفقراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تربيتها الأجنة منتصف الحمل مرحلة الماوس في وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل في جو من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية. كان تطور الجنين داخل الرحم السابقين اعتمادا كبيرا على عوامل متعددة في كل خطوة أثناء الإجراء من وقت عزل الرحم من الفئران الموت الرحيم لإتمام ثقافة (الشكل 1). كان أهم العوامل التي أثرت في تطور الوقت المستغرق لبدء الثقافة. وتشمل النقاط الحرجة الأخرى أثناء إجراء التي تتطلب الرعاية معظم الخطوات مثل فصل الأجنة سليمة مع الكيس المحي من الرحم والاهتمام لأمور ظاهرية من الأجنة من الكيس المحي. كما القوارض ديك المشيمة القرصية، لم تشريح قطعي الرحم لا يضر وصول الدم إلى الجنين حتى في حالة تلف الساقط المشيمة قليلا في الزوايا. في الواقع هذا ترك فتحة صغيرة في الصناعات الاستخراجيةذر تنتهي من خلالها زوج من ملقط حادة يمكن إدراج المسيل للدموع بلطف فتح الرحم والمشيمة الساقط تمكين العزلة سهلة للأجنة سليمة مع الكيس المحي. ومع ذلك، فإن الخطوة التالية من الاهتمام لأمور ظاهرية من الأجنة من الكيس المحي أمر بالغ الأهمية في هذا أن أي أضرار التي تلحق بالأوعية الدموية الرئيسية في الكيس المحي يحتمل أن تؤثر على تطور الجنين في الثقافة. وأيد التطور الجنيني السليم عندما تم exteriorized الأجنة من الكيس المحي الحفاظ على intactness من الأوعية الدموية في الكيس المحي. وقد أشارت دراسات سابقة افتتاح الكيس المحي عندما كانت أجنة الفئران تتجاوز المرحلة الجنينية E10 مثقف 1، 15، 18، 19. وفقا لذلك، لاحظنا التغيرات التنكسية والأجنة لا يمكن البقاء على قيد الحياة فترة عندما كانت الثقافة الأجنة E10.5 مثقف مع سليمة صفار الكيس. ونحن نفترض ان الاهتمام لأمور ظاهرية من الأجنة تسهيل فعالة المغذياتbsorption من خلال الأنسجة مع الحفاظ على الاستمرارية في الأوعية الدموية مع الكيس المحي. هذه الأجنة في الثقافة عرضت ضربات القلب والدورة الدموية الفعالة في أجزاء الجسم الجنينية مقارنة مع الأجنة مثقف دون الكيس المحي.
أن الحفاظ على الأجنة في مستنبت تحسنت إلى 37 درجة مئوية الحق من الوقت الذي يتم عزل من الرحم إلى زمن ثقافة الفور توفير أفضل بيئة مناسبة للحفاظ على قدرتها للتنمية في وقت لاحق في الثقافة. هذا يمنع أيضا التلوث بسبب وجود مضادات حيوية في المتوسط ويتجنب إدراج كميات حتى اللحظة من برنامج تلفزيوني / DMEM في الثقافة. وسيلة محددة لدينا تستخدم أسفرت عن التطور الجنيني متفوقة بالمقارنة مع غيرها من وسائل الإعلام التي أنشئت تعريف موضح سابقا في Wawersik آخرون 20، 21 (لا تظهر البيانات). الفرق في التطور الجنيني يمكن أن تكون أساسا بسببإلى مكونات فريدة في منطقتنا المتوسطة محددة مثل استبدال خروج المغلوب المصل (KSR) و N-2 الملحق. بينما أظهرت N-2 الملحق لدعم النمو والتعبير من الخلايا العصبية بعد الإنقسامية، وقد تبين KSR أن تكون نتيجة مباشرة لاستبدال مصل بقري جنيني 22، 23. واستخدمت في الثقافات KSR لدعم نمو الخلايا الجذعية المحفزة غير متمايزة، وكذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفأر التي عرضت أن تكون مستقرة وسلالة الجرثومية المختصة 23-25. وبصرف النظر عن ثقافة المتوسط، وتركيز الأكسجين في زجاجة الثقافة تلعب دورا حاسما في التطور الجنيني. الأجنة لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف من 5٪ CO 2 في حاضنة التقليدية. على الرغم من أننا لم تختبر تركيزات الأكسجين الأخرى ومعدلات تدفق مختلفة كما اقترح سابقا 5،9، واستخدام 95٪ O 2/5٪ CO 2 في معدل تدفق ثابت حافظت على بقاء الأجنة في الثقافة. في حين تناوبزجاجات الثقافة أمر ضروري، الأجنة عند تربيتها في ظل نفس الظروف ولكن مع عدم وجود دوران زجاجات ثقافة أسفرت nonsurvival من الأجنة مع عدم وجود ضربات القلب مرئية. ونحن نفترض أن دوران مستمر (35 دورة في الدقيقة) في جهاز المتداول زجاجة الثقافة تمكين التعليق خالية من الأجنة في الأجلين المتوسط وكذلك تعزيز امتصاص المواد المغذية والأكسجين من خلال الأنسجة الجنينية. وكان نمو هذه الأجنة في الثقافة من حيث حجم الجسم والرأس عموما، مورفولوجيا، تشكيل حجرات القلب بشكل جيد، حويصلات الدماغ والتنمية العين مماثلة لتلك الأجنة النامية في الرحم. في أيدينا، كنا قادرين على تكرار التطور الجنيني الذي لوحظ من قبل 15 سكوت مور وآخرون.
الأجنة في الثقافة عرضت مجموعة من النمو والتنمية المورفولوجية تبعا لعوامل متعددة (الشكل 3؛ الجدول 1). تحت ثقافة المعرفةوأظهرت الظروف كنا أجنة مثقف ل16-18 ساعة تطوير مماثلة لتلك التي لوحظت في الأجنة النامية في الرحم في حوالي 58٪ من الأجنة، بينما أظهر 28٪ متوسطة و 14٪ أظهرت تطورا الفقراء. تمديد الثقافة إلى 38-40 ساعة انخفضت كذلك القدرة على إظهار التطور يضاهي 30-40٪ فقط من مجموع الأجنة مثقف. وبصرف النظر عن العوامل الكامنة التي تؤثر يحتمل أن الجنينية السابقين التنمية الرحم، والعديد من العوامل الخارجية التي يمكن أن تدار إلى حد معين قد تلعب دورا حاسما عند الأجنة هي مثقف لمدة طويلة من الزمن. واحد هذه العوامل المحتملة التي يمكن السيطرة عليها هو الوقت الذي يستغرقه من عزل الأجنة من الرحم إلى بدء الثقافة. ويمكن أن تفسر التي يتعرض لها أول أجنة معزولة إلى أقل من الأوكسجين في صحن الثقافة مقارنة مع الأجنة المعزولة في نهاية حيث أن جميع الأجنة الخوض في زجاجة الثقافة وتلقي 95٪ O 2/5٪ CO 2في نفس الوقت. ولكن الأكسجين المتاحة في الدم التي يتم بثها في المشيمة بعد تشريح قطعي قد لا تدعم لفترة طويلة من الزمن، ولهذا السبب يجب أن يتم تعيين معظم المعدات والأجهزة الثقافة حتى جاهزة للاستخدام قبل القتل الرحيم الماوس. نحن عادة الحصول على الأجنة في الثقافة في 25-30 دقيقة من وقت الموت الرحيم الماوس. أن هذه الفترة الزمنية القصيرة لبدء ثقافة لا يكون ممكنا إذا كانت الأجنة التي سيتم تجهيزها في وقت واحد كما اقترح في ذئب، M. وآخرون 18 عندما تتم معالجة الأجنة بشكل فردي، مجموعة من الأجنة غير ممكن ويجب أن يكون كل جنين عد لعدد الجسيدة. أن هذا الإجراء يستغرق ما لا يقل عن 5-6 دقائق لكل الجنين لعزل والداخل للظاهر من الكيس المحي، عد somites ونقل إلى زجاجة الثقافة. لحجم القمامة من 10-12 الأجنة، ونحن عادة ما تحصل من وجهة نظرنا CD-1 الفئران، فإن العملية برمتها تأخذ 60-72 دقيقة للأجنة القليلة الماضية للوصول الى جulture. هذا هو فترة طويلة جدا ونحن لاحظ ضربات القلب لإبطاء ووقف تقريبا عندما تم exteriorized الأجنة وترك في برنامج تلفزيوني وتأخر في الثقافة. أحد العوامل المحتملة الأخرى يمكن أن تكون المناولة أو سوء الأجنة أثناء العملية. خلال المناولة، قد تحفز على التلف العرضي لجزء من الجسم أو الأوعية الدموية في الجنين أو الكيس المحي التي لم يتم الكشف بسهولة. وهذا يمكن أن يؤثر على تطور ذلك الجزء من الجسم أو في بعض الأحيان الجنين كله كما لوحظ أنه حتى الجنين متطورة يظهر في بعض الأحيان نوع من التنمية تحت الحدود القصوى في مثل براعم الأطراف والذيل يدل عدم كفاية إمدادات الدم. فمن الأفضل أن تجاهل مثل هذه الأجنة التي تظهر أن خطر أو التالفة أثناء العملية. مشكلة أخرى واجهت عادة أثناء إجراء كان، وبعض من الأجنة مع الكيس المحي سليمة من دعم فجأة من الساقط على تشريح قطعي الرحم. هذه النتائج في بعض الأحيان في موإعادة فقدان الدم عند نقطة الانفصال عن المشيمة على الرغم من أن الأوعية الدموية مع الكيس المحي لا تزال سليمة. هذا فقدان الدم يمكن أن تؤثر على تطور لاحق للجنين بسبب كمية أقل من الدم الاحتفاظ في الجسم خلال فصل الجنينية.
وبصرف النظر عن العوامل المذكورة أعلاه ظروف معينة مثل، مرحلة الجنين في وقت بدء ثقافة أثرت على التنمية في الثقافة. نحن مثقف بنجاح أجنة فئران في منتصف الحمل بدءا من المراحل التي تراوحت بين 28-37 ثانية ل16-40 ساعة، ولاحظ بعض الاختلافات في التنمية. الأجنة في مرحلة 34-36 ق عرضت أفضل للتنمية في الثقافة مقارنة مع الأجنة في مرحلة 30-33 ق مما يشير إلى زيادة في القدرة على التكيف مع الظروف الثقافة في أجنة مثقف في مراحل لاحقة. كان من المستغرب حقيقة أخرى أن لوحظ خلال ثقافة تطوير الأجنة عندما تم cocultured اثنين أو أكثر من الأجنة (الشكل 4). Coculture resulteد في تحسن كبير في التنمية في واحدة من الأجنة بالمقارنة مع غيرها من الجنين في 45٪ من cocultures. على الرغم من أن الأجنة من نفس الرحم تبدو مشابهة شكليا والعد في الجسيدة، بطبيعتها لا يمكن أن يكون اثنين من الأجنة في نفس المرحلة من التطور، وهذا يمكن أن يكون واحدا من أسباب الاختلاف التنموية في واحدة من الأجنة بالمقارنة مع غيرها في coculture النظام.
وهكذا تبين لنا أن الأجنة مرحلة منتصف الحمل الماوس مثقف الرحم السابقين في وسط المصل خالية في جو من 95٪ O 2/5٪ CO 2 في المتداول زجاجة جهاز الثقافة في 37 درجة مئوية نمو المعرض والتنمية المورفولوجية مماثلة ل تلك التي لوحظت في الأجنة النامية في الرحم. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب من الماوس نظام الثقافة الجنين تكون مفيدة للمختبرات الحاجة إلى استخدام الأجنة كلها لدراسة التفاعلات إشارات مهمة في وقت مبكر توالد الأعضاء الجنينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا أي مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور جولي غوردون والدكتورة نانسي مانلي للحصول على المشورة المفيدة مع تقنية الثقافة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الزرق الأطفال وشارون ستيوارت انعدام القزحية تراست البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
