Summary
Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.
Abstract
Mitte der Schwangerschaft Bühne Maus-Embryonen kultiviert wurden unter Verwendung eines Serum-freien Kulturmedium aus kommerziell verfügbaren Stammzell Medien Ergänzungen in einer sauerstoffhaltigen Rollflaschenkultur System vorbereitet. Maus-Embryonen E10.5 wurden sorgfältig von der Gebärmutter mit intakten Dottersack isoliert und in einem Prozess, der eine präzise chirurgische Manöver wurden die Embryonen vorsichtig aus dem Dottersack nach außen gelegt, während die Gefäß Kontinuität der Embryo mit Dottersack. Im Vergleich zu Embryonen mit intakter Dottersack oder mit dem Dottersack entfernt vorbereitet, zeigten diese Embryonen überlegene Überlebensrate und Entwicklungsfortschritt unter ähnlichen Bedingungen, wenn kultiviert. Wir zeigen, daß diese Maus-Embryonen, wenn in einem definierten Medium in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C für 16-40 h kultiviert, morphologische Entwicklung und Wachstum vergleichbar die Embryonen in der Gebärmutter entwickeln. Wir glauben, thVerfahren ist nützlich für die Ermittler brauchen, um ganze Embryokultur nutzen, um Signal Wechselwirkungen in der embryonalen Organentwicklung wichtig zu studieren.
Introduction
In-vitro-Kultur Verfahren, die ganze Embryonen sind gut geeignet, um zu studieren Signalmechanismen in der embryonalen Organentwicklung beteiligt, die sonst nur schwer zugänglich sind, in utero. Ganze Embryonen bieten die Gewebeintegrität und Unterstützung für die Gewebe-Wechselwirkungen, die von entscheidender Bedeutung für die rechtzeitige Auftreten von Signalmechanismen unerlässlich sind angemessen für verschiedene zelluläre Prozesse während der Organogenese. Während ganze Embryokulturen bieten eine Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen, wie Transplantationsstudien, genetische Manipulationen und Gewebe-, Perl-Implantationsstudien, toxikologische Studien, etc. Sind derzeit genutzt Embryokultur-Systeme vor allem abhängig von Serum für die ordnungsgemäße Wachstum und die Erhaltung der Embryonen in der Kultur 1-9.
Serum wurde als einer der Hauptbestandteile im Bereich von 10-100% der Kulturmedien 6-8, 10, 11 genutzt., Aber die Zusammensetzung von Serum ist nicht gut definiert und können von Tier zu Tier verschieden, und jedes Mal das Serum gesammelt. Während Laborherstellung von Serum ist zeitaufwendig und erfordert strengen Verfahren, Serum beschafft im Handel weist erhebliche Variabilität zwischen verschiedenen Lose und wirft Versuchskosten. Hinzu kann das Serum unbekannte Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Hormonen oder anderen Proteinen, die potenziell beeinflussen kann das Ergebnis bestimmter Versuche, insbesondere jene, die die Untersuchung von Signalmolekülen in Gewebe Wechselwirkungen wichtig einschliessen. Studien haben gezeigt, dass die Zugabe von Serum zu Kultur kann möglicherweise die intrazellulären Niveaus von bestimmten Signalmoleküle, wie z. B. zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und Proteine in mitogene Signalgebung und Phosphoinositid-3 beteiligt (PI-3)-Kinase-Signalwege 12-14 zu verändern. Im Gegensatz zu dieser liefert ein serumfreies Kultursystem die Vorteile der Antigen freien Umgebung,Abstinenz von biologisch aktiven Enzyme, die die Zellprozesse verändern und ermöglicht Konsistenz zwischen Experimenten.
In der vorliegenden Untersuchung verwendeten wir ein serumfreies Kulturmedium aus kommerziell erhältlichen Stammzellkulturmedien Ergänzungen der Mitte der Schwangerschaft Stufe ganzen Embryos in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung hergestellt bei 37 ° C 15,16. Maus-Embryonen, die für 16 bis 40 Stunden unter diesen definierten Bedingungen kultiviert ausgestellt Progression in morphologische Entwicklung der gesamten embryonalen Körper und verschiedenen Strukturen wie Herz, Gliedmaßen, Gehirn und Augen anzeigt geeigneten Ebenen der zellulären Proliferation, Migration, Differenzierung und Gewebe-Wechselwirkungen. Die molekulare Analyse der embryonalen Entwicklung in der Kultur für eine der komplexen Organsystemen wie dem Auge zeigte die Augenentwicklung mit dem in dem Augengewebe in embr beobachtet, dassJos Entwicklung in utero (Kalaskar und Lauderdale, in Vorbereitung). So zeigen wir, dass Mäuseembryonen in der Mitte der Schwangerschaft Bühne kultiviert, zeigen progressive Wachstum und morphologische Entwicklung vergleichbar mit der in der Entwicklung Embryonen in utero beobachtet.
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Protocol
Maus-Embryokultur:
Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien folgende Protokoll # A2010 07-119, die überprüft und von der Universität von Georgia Institutional Animal Care und Verwenden Committee, das weiterhin Regulierungsaufsicht unterhält genehmigt wurde, durchgeführt.
1. Herstellung von Nährmedien
- Bereiten Kulturmedium unter Verwendung kommerziell verfügbarer Stammzellen Medien und Ergänzungen in folgenden Mengen: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2-Beilage (1x), Albumin aus Rinderserum (2%), Penicillin ( 50 IU / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und Amphotericin B (1,25 ug / ml). Das Kulturmedium hergestellt ist ähnlich dem vorher beschriebenen 15 mit den folgenden Änderungen: Zugabe von Antimykotika und unter Verdoppelung der Konzentration der Antibiotika (für Details der spezifischen Reagenzien und Geräte, siehe List des Materials).
Hinweis: Antibiotika-Konzentration wie zuvor verwendet (. Moore-Scott, et al 15) war ausreichend für die Embryokulturen durchgeführt bis zu 24 Stunden Zeitraum. Allerdings, wenn Kultur wurde über 24 Stunden fortgesetzt, erlebten wir eine Kontamination der Kultur, und dies wurde erfolgreich durch die Verdoppelung der Antibiotikakonzentration gesteuert. - Bewahren Sie die Media-Komponenten bei 4 ° C oder bei -20 ° C nach Herstellerempfehlungen. KSR-und N-2 Supplement sollten in Aliquots bei -20 ° C gelagert werden, um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. KnockOut DMEM einmal geöffnet sollte innerhalb von 30 Tagen nach der Empfehlung des Herstellers verwendet werden. Vor der Verwendung erwärmen die Komponenten in einem Wasserbad auf 37 ° C
- Bereiten Sie die Medien unter sterilen Bedingungen. Desinfizieren Sie die Oberfläche der gesamten Ausrüstung und Flaschen die Media-Komponenten mit 70% Alkohol Spray, bevor Sie sie in der Kultur Kapuze.
- Die Mediumkomponenten können entweder in einer sterilen Becher oder direkt in das Filtersystem (Corning) gemischt werden. Zuerst fügen Sie die Albuminpulver auf den KnockOut DMEM. Mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Schütteln, bis das Albumin vollständig auflöst. Dann fügen Sie die N-2-Beilage, KSR und die Antibiotika und mischen mit einer Pipette. Dann filtern sterilisieren die Medien mit einer Porengröße 0,22 um Filter mit Vakuumsauger. Verzichten die Medien in 50 ml konische Röhrchen und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Die einst vorbereitet Medien sollten innerhalb von 4-5 Tagen für die Kultur verwendet werden.
2. Vorbereitung der Kultur-Ausrüstung
- Sterilisieren der Glaskulturflaschen und Gummikorken. Wickeln Sie die Kulturflaschen in einer Aluminiumfolie und legen Sie die Gummiflaschenkorken in einem Wasserbecher und durch Autoklavieren sterilisieren.
- Sterilisieren Sie die Kulturkammer (Precision Incubator Unit) mit 70% Alkohol-Spray und warm bis 37 ° C vor dem Beginn der Kultur. Der Kulturraum ist emit einer rollenden Scheibe in der Mitte, die die Kulturflaschen hält witzelte. Gasstrom in die Kammer durch einen Druckmesser geregelt und die Strömungsrate kann durch Beobachten der Abfluss von Luftblasen durch das Wasser in eine Glasröhre an dem Ende eingestellt werden. Diese Rollflaschenkultur Gerät ist eine modifizierte Version des von Neu-und Cockroft 17 eingeführt Originalgerät.
- Verbinden einer Gasflasche mit einer Gasmischung aus 95% O 2/5% CO 2 in der Kulturkammer und der Gasströmung einzustellen, um "eine Luftblase pro Sekunde", der eine Strömungsgeschwindigkeit von 50 cc / min ergibt und gewährleistet eine ausreichende Sauerstoffversorgung die Kultur Embryonen.
3. Maus-Embryogewinnung und Vorbereitung für die Kultur
- Um Wildtyp-Maus-Embryonen zu erhalten, verwendeten wir Mäuse C57BL/6J und CD-1 (Charles River Laboratories) genetischen Hintergrund Stämme.
- Überprüfen Sie den weiblichen Mäusen für vaginale Stecker jeden Tag am Morgen. Die Uhr am Tag der Suche nach thE Vaginalpfropf als E0.5 dpc (Tage nach dem Koitus) berücksichtigt werden.
- Sammeln Maus-Embryonen bei E10.5 dpc von euthanizing die schwangeren Mäusen nach Standardprotokollen. Die Mäuse wurden mit einer CO 2-Inhalationsgerät wie von der American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien für die Euthanasie von Tieren (2013) angegeben eingeschläfert. Um den Tod zu gewährleisten, wurde Genickbruch nach Exposition mit CO 2 durchgeführt.
- Spray 70% Ethanol auf der ventralen Bauchoberfläche, um ein Anhaften von Bauchhaar auf die Instrumente zu vermeiden. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle ventral mit einer scharfen Schere-blunt Betriebs und ein Paar von 4-3/4 in microdissecting Zange, um die Gebärmutter zu finden. Mit einer 4 in microdissecting Pinzette heben Sie die gesamte Gebärmutter und trennen sie vom Körper durch Schneiden mit einer Schere am Betriebs Licht der Gebärmutterkörper und an den Spitzen der Uterushörner.
- Schnell spülen die gesamte Gebärmutter in 1x PBS auf 37 ° Cum das Blut Anhaften an der Gebärmutter zu entfernen, und sofort in DMEM platzieren erwärmt auf 37 ° C in einer Petrischale. Sterilisieren der Instrumente von 70% Ethanol Spray vor der weiteren Verwendung.
Hinweis: Vorwärmen der Lösungen einschließlich der PBS und DMEM Kulturmedium und Halten derselben bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens wird empfohlen. - Unter einem Binokular, sollte die Gebärmutter segment mit einem leichten Betriebs Schere zerschnitten werden. Dies führt zu kleinen Öffnungen auf jeder Seite des segmentierten Gebärmutter durch die ein Paar von modifizierten (stumpfe Enden) microdissecting Pinzette vorsichtig eingesetzt, um die Öffnung zu erweitern werden. Dies ermöglicht die Exposition der Plazenta decidua, die dann durch leichtes Reißen mit einem Paar microdissecting Pinzette, um die parietalen Dottersack (PYS) mit der Reichert-Membran aussetzen entfernt werden können. Mit einem Rand der Pinzette vorsichtig durchbohren das Reichert-Membran zusammen mit den PYS und getrennt von thE viszeralen Dottersack (VYS) zugrunde liegenden Schicht, um die Embryonen mit intakter VYS aussetzen. Der Konus und die ectoplacental Trophoektoderm Derivate können entweder mit der Dezidua oder der Plazenta mit der Reichert-Membran entfernt werden. Es muss darauf geachtet werden, um ein Bersten des VYS zu vermeiden, da die Embryonen sofort herausspringen.
- Die Embryonen mit intakter VYS sollte dann auf eine Petrischale mit Kulturmedium auf 37 ° C unter Verwendung eines Kunststofftransferpipette überführt werden.
Hinweis: Transfer zum Kulturmedium unmittelbar nach der Trennung vom Uterus hilft für eine bessere Entwicklung des Embryos in Kultur. - Eine kleine Öffnung ist in den Dottersack mit einem Paar Pinzetten microdissecting Vermeidung größerer Blutgefäße hergestellt werden. Eine scharfe Pinzette kann die Öffnung durch leichtes Piercing in einem Bereich neben dem Kopfbereich zu machen. Alternativ zwei Paare von stumpfen Pinzette kann der Dottersack zu halten und schonend zu reißen, um eine kleine Öffnung zu machen.Dann vorsichtig eine breitere Öffnung durch die Erweiterung mit der Pinzette zu einer Größe gerade genug, um die embryonale Kopf passen. Das Frucht Membran, die eng Wickeln wird der Embryo sollte sanft gehalten werden vom Körper gerissen und mit einer Pinzette. Die embryonale Kopf und später der ganze Embryo sollte vorsichtig aus dem Dottersack nach außen gelegt werden, während die Integrität der embryonalen Gefäßsystems mit der des Dottersack 15.
Hinweis: Jeder Schaden, den Dottersack Gefäßsystem kann potenziell Einfluss auf die Entwicklung des Embryos in der Kultur. Diese Embryonen mit beschädigten Gefäßsystem nicht für die Kultur verwendet werden, und können für die Ausrichtung der Embryonen, die später verworfen werden, verwendet werden. - Embryonale Inszenierung Kriterien: Untersuchen Sie die Embryonen unter dem Binokular und Gruppen durch morphologische Kriterien wie Körper-und Kopfgröße, Körper-und Augen Morphologie und Bühne, indem die Anzahl der Somiten (s) für mindestens zwei Embryonen aus jeder Gruppe.
<strong> Hinweis: In der Regel Embryonen aus den gleichen Wurf zeigen Unterschiede in der Entwicklung im Mutterleib erhalten und unterscheiden sich in der Körpergröße, morphologische Merkmale und die Anzahl der Somiten. Wir fanden jedoch, dass Embryonen, die durch unsere morphologischen Kriterien gruppiert ausgestellt in der Regel ähnlich Somitenzahl (± 1). Aus diesem Grund ist es nicht erforderlich, für jeden Somiten Embryo zu zählen, da dies die Zeit für den Beginn der Kultur zu verzögern.
Hinweis: Verwenden Sie nicht die Embryonen, die verwendet wurden, um die Somiten für Kultur zählen. Zählen der Somiten nach Beginn der Anzucht für andere Embryonen, um die Zeitverzögerung beim Starten der Kultur zu vermeiden. Die Embryonen, die Kultur nach der Trennung von der Gebärmutter verzögert wurden weisen in der Regel schlechte Entwicklung. - Übertragen Sie die Embryonen sofort in eine Petrischale mit frischem Kulturmedium auf 37 ° C und nehmen Sie an der Kultur Haube, wo die Embryonen wieder in eine Petrischale mit sterilem cultur übertragen werdenE Medien, bevor sie in den Kulturflaschen mit Medium, um die Kultur zu starten.
Anmerkung: Die unterschiedliche Medien Transfers für die Embryonen vor Kultur hilft bei der Verhinderung von Verunreinigungen ist, wie die verschiedenen Schritte der Entnahmeeinheit und Dissektion wurden unter einem Präpariermikroskop, die nicht im Kulturabzugshaube durchgeführt.
Hinweis: Wenn die Wurfgröße ist groß (> 12 Embryonen), Prozess die Hälfte der Embryonen und starten Sie die Kultur oder setzen Sie sie in eine Schüssel mit Kulturmedium und legen Sie sie in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C Wenn Embryonen wurden außerhalb für längere Zeiträume (> 35-40 min) links beobachteten wir den Herzschlag zu verlangsamen und dadurch die spätere Entwicklung in der Kultur beeinflussen.
4. Kultivierung Maus Embryonen
- Öffnen Sie die autoklaviert Kulturflaschen in der Kultur Kapuze und richtig beschriften. Übertragungs 3 ml Kulturmedium auf 37 ° C zu jedem ter Flaschen und dann die Maus-Embryonen sollte sanft in den Kulturflaschen mit sterilen Kunststofftransferpipetten übertragen werden. Die Kulturflaschen sollten dann mit den Gummiflaschenkorken, die die Kulturflaschen zur Walz Scheibe in der Kulturapparat halten helfen gekappt.
Hinweis: Die Kulturflaschen mit den Medien vorbereitet und auf der Rollscheibe der Kultur Gerät gestellt werden, bevor die Mäuse euthanizing. Dies verkürzt die Zeit für den Transfer von Embryonen in den Kulturflaschen.
Hinweis: Mäuseembryonen können einzeln oder als Co-Kulturen mit zwei oder drei Embryos in der gleichen Kulturflasche kultiviert werden. - Die Kulturflaschen aseptisch zu dem Kulturvorrichtung durchgeführt werden bei 37 ° C fest einrasten, um die Löcher in der Scheibe mit den Walzen Gummikorken. Schalten Sie den Rollscheibe mit einer konstanten Drehzahl von 35 Umdrehungen pro Minute (rpm), die das freie Aufschwimmen der embr ermöglicht drehenJos in den Medien und hilft auch bei der freien Gasaustausch durch die embryonalen Gewebe. Das Gas von dem Zylinder zu der Kulturkammer verbunden fließt durch den Rollscheibe und den Gummistopfen in den Kulturflaschen.
- Kultur die Embryonen für 16-40 h und regelmäßig für den Gasaustritt und Kultur Kammertemperatur.
Hinweis: Mouse Embryo Manipulation in der Kultur: Lassen Sie die Embryonen gehen zu den Kulturbedingungen für mindestens 30 min angepasst. Embryonen, die schlecht abschneiden und zeigt schwachen Herzschlag Dann kann verworfen werden und die restlichen Embryonen können zur weiteren Bearbeitung Studien genutzt werden. Embryo Manipulationen wie Elektroporation 5,9,16, 18 Mikroinjektionen, Perlen Implantation 16, medikamentöse Behandlung und andere Verfahren kann zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Wir erfolgreich durchgeführt Implantation von Affi-Gel-Agarose-Beads mit bestimmten Signalmoleküle behandelt, um ihre Rolle in der frühen Entwicklung des Auges zu studieren. Die Embryonen nachManipulationen wieder in ein frisches Medium zurückgegeben und in der Kultur fortgesetzt werden. - Ersetzen Sie die Kulturmedien vollständig mit frischem Medium in bestimmten Intervallen nach 9-10 h und 18-19 h der Kultur, als die Kultur wurde für 40 Stunden fortgesetzt.
Hinweis: Die Kulturmedien Ersatz möglicherweise nicht erforderlich, wenn die Kultur von 16-18 h gestoppt werden. - Messlatten für den Erfolg in der Kultur: Embryonale Überleben in Kultur sollte durch sichtbare Herzschlag und den Blutkreislauf im Körper bestimmt wird, während embryonale Wachstum in der Kultur sollte durch Erhöhung der Körpergröße, Somitenzahl und morphologische Entwicklung von Kopf, Gliedmaßen, Herz und Augen beurteilt werden.
- In utero entwickelten Embryonen E11.0 dpc (~ 40-41 s) und E12.0 dpc (~ 49-50 s) als Kontrollen für den Vergleich von Embryonen für 16-18 h und 38-40 h zuge kultiviert werden.
- Embryonalentwicklung zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur und in utero Stufen werden captunter Binokular gemessen. Spot-Imaging-Software wurde eingesetzt, um die Bilder zu erfassen und mit Hilfe von Bildbearbeitungssoftware später verarbeitet.
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Representative Results
Entwicklung von Maus-Embryonen ex utero hängt von mehreren Faktoren ab dem Zeitpunkt der Uterus wird aus dem Körper zu der Zeit die Embryonen kultiviert isoliert. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, beinhaltet das Verfahren eine Reihe von Schritten, einschließlich Abtrennung der graviden Uterus von dem Körper (1A), Isolierung der Embryonen mit intakter Dottersack (1B), Exteriorisation der Embryonen aus dem Dottersack ( 1C) Kultivierung der Embryonen und in einem serumfreien Medium in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C Embryonen zeigten 100% Überleben, wenn unmittelbar nach der Trennung vom Uterus in das Kulturmedium überführt. Unter diesen Kulturbedingungen, Maus-Embryonen, wenn für 16-40 h zeigten Wachstum und morphologische Entwicklung kultiviert vergleichbar mit der in einer entsprechenden Stufe entwickelnden Embryonen beobachtetutero (Abbildung 2).
Embryonen bei E10.5 (~ 34-35 s) (2A), wenn für 16-40 h kultiviert überlebt und Fortgeschrittene in der Entwicklung weit über die Stufe der 35 s. Die Embryonen nach 16 bis 18 h in Kultur (Figuren 2D und 3B; Tabelle 1) hinzugefügt ca. 5-6 s zeigt eine Wachstumsrate von einem Somiten für jeweils zweieinhalb Stunden in Kultur und morphologisch vergleichbar E11.0 (~ 40-41 s) Embryonen in utero (2B und 3A) entwickelt. Obwohl die Entwicklung wurde durch etwa eine Stunde verzögert, diese Embryonen in Kultur zeigte einen Gesamtanstieg der Körpergröße und eine verhältnismäßige Kopf mit ausgeprägten Hirnbläschen. Die Embryonen zeigten auch Entwicklungsextremitätenknospen, die Bildung einer gut Kammerherz und Aussehen der Pigmentierung im retinalen Pigmentepithel. Allerdings wurde diese Art der Entwicklung in etwa 58% der emb beobachtetRYOS kultiviert, während 28% der Embryonen zeigten ein Zwischen Entwicklung (Fig. 3C). Diese späteren Embryonen zeigten eine geringere Körpergröße, obwohl sie einen ähnlichen Somitenzahl im Vergleich zu den entwickelten Embryos in utero. Sie hatten ein relativ kleiner Kopf, obwohl die Hirnbläschen wurden abgegrenzt. Die Herzkammern waren nicht eindeutig und die Extremitätenknospen in einigen Embryonen zeigten dunkle Bereiche an den Extremitäten. Am anderen Ende des Spektrums, etwa 14% der Embryos zeigten eine schlechte Entwicklung der Kultur (Fig. 3D). Diese Embryonen hatten kürzere Körper-und Kopfgrößen und zeigten dunkle Bereiche in einigen Teilen des Körpers anzeigt, degenerative Veränderungen. Obwohl das Herz schlug sie war krank, und es fehlte entwickelten Differenzierung in Kammern in einigen Embryonen während in anderen die Gliedmaßen erschien dunkel und verzögert in Wachstum.
Embryonen in Kultur weiter für 38-40 h (2E, Tabelle 1) shgeschuldeten etwa 49-50 s und waren vergleichbar mit E12.0 Embryonen (2C) in der Gebärmutter entwickelt. Obwohl von 2-3 Stunden verzögert, diese Embryonen in Kultur ausgestellt proportionalen Anstieg der Körpergröße und zeigte entsprechende Organogenese und Gewebedifferenzierung, wie in der Entwicklung der Pigmentierung der Netzhaut-Pigmentepithel und die Bildung einer gut abgegrenzten Schnauze im Kopfbereich beobachtet. Obwohl einige Teile an den Extremitäten wie die Extremitätenknospen und den Schwanz schien unterentwickelt zu sein, erschien die Embryonen sich zu entwickeln, vergleichbar mit den Embryonen in utero. Allerdings wurde diese Art von Entwicklung in nur 30-40% der Embryonen kultiviert (Tabelle 1) beobachtet, während der Rest von ihnen zeigten eine Reihe von Entwicklungsfort mit Bereichen verzögertes Wachstum oder Unterentwicklung in einigen Teilen des Körpers oder der ganzen Embryo.
Abgesehen von den oben genannten Unterschiede in der Entwicklung, beobachteten wir eine signifikante differe nce in der Entwicklung, wenn die Embryonen wurden in der gleichen Kulturflasche kokultiviert. Im Vergleich zu den anderen Embryos (4A und 4A ') in der Co-Kultur, die gut entwickelten Embryo (4B und 4B') zeigten ein besseres Wachstum in alle Aspekte der embryonalen Entwicklung. In der Gesamtkörpergröße und Kopfgröße und manchmal auch in der Herz-und Extremitätenentwicklung wurden große Unterschiede festgestellt. Während die gut entwickelten Embryos aus der Co-Kultur war morphologisch vergleichbar mit den Embryonen die Entwicklung im Mutterleib, hat der andere Embryo in der Co-Kultur immer weniger entwickelten erschienen zu sein im Vergleich zu den gut entwickelten Embryo. Diese Art von Unterschied in der Entwicklung wurde in 45% der Co-Kulturen beobachtet (N = 27), während der Rest des Co-Kulturen (n = 33) zeigten fast ähnlich Entwicklung in den Embryonen in der Co-Kultur.
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Abbildung 1. Schritte im Maus-Embryo-Kultur-Protokoll. (A) schwangeren Uterus mit Embryonen von der Mutter-Maus isoliert. (B) Embryonen mit intakter Dottersack aus Dezidua nach Segment Dissektion der Gebärmutter getrennt. (C) exteriorisiert Embryonen aus dem Dottersack. (D) Rollflasche Kulturapparat bei 37 ° C und mit 95% O 2/5% CO 2 für die Kultivierung von Maus-Embryonen geliefert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
<br /> Abbildung 2. Embryonen in Kultur replizieren in utero Entwicklung. In utero Entwicklung bei E10.5 (A), E11.0 (B) und E12.0 (C). Entwicklung in der Kultur nach 18 h (D) und 40 h (E). Balken in (E) gilt für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Embryonalentwicklung in der Kultur. Embryos in utero bei E11.0 dpc (A). Entwicklung in Kultur (B, C, D) entwickelt. (B) Darstellung gut embryonalen Entwicklung in der Kultur. Über 58% des Gesamt Embryonen kultiviert weisen vergleichbare Entwicklung in utero entwickelten Embryonen. (C) Darstellung von Zwischen Entwicklung in der Kultur. Über 28% der Embryonen kultiviert zeigen Zwischen Entwicklung. (D) Darstellung der armen embryonalen Entwicklung in der Kultur. Über 14% Embryonen zeigen schlechte Entwicklung in der Kultur. Balken in (D) gilt für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Entwicklungsunterschiede in Mausembryo-Cokultur-System. Embryonen zu Beginn der Co-Kultur (A B). Embryonale Entwicklung nach 16 h Kokultur (A ', B'). Einer der Embryos in der Co-Kultur (A ') wird unter Stand im Vergleich zu dem anderen Embryo (B') in der Co-Kultur. Balken in (B ') gilt für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Insgesamt Embryonen für 16-18 h kultiviert | Die Entwicklung nach Kultivierung für 16 bis 18 h | Insgesamt Embryonen für 38-40 h kultiviert | Die Entwicklung nach Kultivierung für 38 bis 40 h | |||
| Gut | Zwischen- | Arm | Gut | Arm | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Tabelle 1. Entwicklung von Embryonen in Maus-Embryo-Kultur-System. Embryonen entweder für 16-18 h oder 38-40 h kultiviert. Von den insgesamt 112 Embryonen für 16-18 h, 65 (58%) Embryonen eine vergleichbare Entwicklung zu Embryonen kultiviert Entwicklung in utero, 31 (28%) zeigten eine mittlere und 16 (14%) zeigte eine schlechte Entwicklung. Von den insgesamt 12 Embryonen für 39-40 h kultiviert, zeigten nur 4 (~ 35%) Embryonen gute Entwicklung, während die übrigen zeigte eine schlechte Entwicklung.
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Discussion
Mitte der Schwangerschaft Stufe Maus-Embryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C kultiviert Entwicklung des Embryos ex utero war bei jedem Schritt kritisch abhängig von mehreren Faktoren während des Verfahrens ab dem Zeitpunkt der Uterus der Maus euthanasiert zur Vervollständigung der Kultur (1) isoliert. Der wichtigste Faktor, der die Entwicklung beeinflusst war die Zeit, um die Kultur zu starten. Die anderen kritischen Stellen während des Verfahrens, das die meisten Sorgfalt erfordern die Schritte, wie die Abtrennung von Embryonen mit intakter Dottersack von Uterus und Exteriorisation der Embryonen aus dem Dottersack. Wie die Nagetiere haben scheibenförmige Plazenta, segmentale Dissektion der Gebärmutter nicht die Blutzufuhr zu den Embryo schädigen, selbst wenn die Plazenta-Dezidua wird an den Ecken leicht beschädigt. In der Tat hinterließ eine kleine Öffnung an either Ende, durch das ein Paar von stumpfen Pinzette eingesetzt, um sanft die Gebärmutter reißen offen und die Plazenta decidua ermöglicht die einfache Isolierung der Embryonen mit intakter Dottersack werden. Jedoch ist der nächste Schritt des Exteriorisation der Embryonen aus dem Dottersack kritisch, daß eine Beschädigung der Hauptblutgefäße in den Dottersack zu bewirken würde möglicherweise die Entwicklung des Embryos in der Kultur. Korrekte Embryonalentwicklung wurde unterstützt, wenn Embryonen wurden aus dem Dottersack exteriorisiert Aufrechterhaltung der Unversehrtheit des Gefäßsystems in den Dottersack. Frühere Studien haben die Öffnung des Dottersack angezeigt, wenn Maus-Embryonen über embryonalen Stadium E10 kultiviert wurden 1, 15, 18, 19. Dementsprechend beobachteten wir, degenerative Veränderungen und die Embryonen könnte die Kulturperiode nicht überleben, wenn E10.5 Embryonen mit intakter Dottersack kultiviert. Wir übernehmen die Entäußerung der Embryonen wäre eine effektive Nährstoff erleichternbsorption durch das Gewebe, während die Kontinuität in Gefäßsystem mit dem Dottersack. Diese Embryonen in Kultur zeigte effektive Herzschlag und Blutzirkulation in den embryonalen Körperteile im Vergleich zu den Embryonen ohne Dottersack kultiviert.
Aufrechterhaltung der Embryonen im Kulturmedium auf 37 ° C direkt aus der Zeit werden sie aus dem Uterus in die Zeit der Kultur isoliert würde sofort die beste geeignete Umgebung, um ihre Fähigkeit zur späteren Entwicklung in der Kultur aufrechtzuerhalten. Dies verhindert auch Verschmutzung aufgrund der Anwesenheit von Antibiotika im Medium und vermeidet Einbau selbst kleinste Mengen an PBS / DMEM in der Kultur. Das definierte Medium, das wir genutzt haben ergab überlegen embryonalen Entwicklung im Vergleich zu bisher in 20 Wawersik et al. Beschriebenen anderen etablierten Medien definiert, 21 (Daten nicht gezeigt). Der Unterschied in der embryonalen Entwicklung konnte vor allem durch seinauf die einzigartigen Komponenten in unseren definierten Medium, wie KnockOut Serum Replacement (KSR) und N-2-Ergänzung. Während N-2-Beilage wurde gezeigt, dass das Wachstum und die Expression von post-mitotischen Neuronen zu unterstützen, wurde KSR gezeigt, dass ein direkter Ersatz für fetales Rinderserum 22, 23 sein. KSR wurde in Kulturen verwendet werden, um das Wachstum von undifferenzierten pluripotenten Stammzellen sowie menschliche und Maus embryonale Stammzellen, die gezeigt wurden stabile und Keimbahn kompetente 23-25 werden unterstützt. Zusätzlich zu dem Kulturmedium, spielt die Sauerstoffkonzentration in der Kulturflasche eine kritische Rolle in der embryonalen Entwicklung. Embryonen können die Bedingungen von 5% CO 2 in einem herkömmlichen Inkubator nicht überleben. Obwohl wir nicht getestet anderen Sauerstoffkonzentrationen und unterschiedlichen Flussraten, wie zuvor vorgeschlagen, 5,9, wurde die Verwendung von 95% O 2/5% CO 2 bei konstanter Zulaufgeschwindigkeit der Überlebensfähigkeit der Embryonen in der Kultur aufrechterhalten. Während DrehungKulturflaschen notwendig, Embryonen, wenn sie unter den gleichen Bedingungen, aber ohne Drehung der Kulturflaschen kultiviert in Folge Nichtüber der Embryonen ohne sichtbaren Herzschlag. Wir gehen davon aus, dass ständige Rotation (35 rpm) in der Walz Flasche Kulturapparat aktiviert freie Aufhängung der Embryonen in die mittel-und auch verbessert die Aufnahme von Nährstoffen und Sauerstoff durch die embryonalen Gewebe. Das Wachstum dieser Embryonen in der Kultur, in Bezug auf die gesamte Körper-und Kopfgröße, Morphologie, Bildung einer gut-Kammer-Herz, Gehirn-und Augenentwicklung Vesikel war vergleichbar mit der Entwicklung von Embryonen in utero. In unseren Händen, wir waren in der Lage, um die embryonale Entwicklung, die durch Moore-Scott et al. Beobachtet 15 replizieren
Die Embryonen in Kultur zeigte einen Bereich von Wachstum und morphologische Entwicklung, abhängig von verschiedenen Faktoren (3; Tabelle 1). Unter dem definierten KulturBedingungen, die wir verwendet, Embryonen für 16-18 h kultiviert zeigten eine vergleichbare Entwicklung wie in Embryonen in der Gebärmutter entwickeln in etwa 58% der Embryonen beobachtet, während 28% eine mittlere und 14% zeigten eine schlechte Entwicklung. Erweiterung der Kultur 38-40 h weiter vermindert die Fähigkeit, vergleichbare Entwicklung auf nur 30-40% der gesamten kultivierten Embryonen zu zeigen. Abgesehen von den inhärenten Faktoren, die möglicherweise Einfluss auf die embryonale Entwicklung ex utero, können viele externe Faktoren, die in gewissem Umfang verwaltet werden können entscheidende Rolle spielen, wenn die Embryonen für eine längere Zeitdauer kultiviert. Eine solche potentielle Faktor gesteuert werden kann, ist die Zeit von der Isolierung von Embryonen aus dem Uterus zu Beginn der Kultur gemacht. Es kann interpretiert werden, daß die ersten isolierten Embryonen werden auf weniger Sauerstoff in der Kulturschale gegenüber den Embryonen isoliert am Ende als alle Embryonen gehen in die Kulturflasche erhalten und 95% O 2/5% CO 2 freizur gleichen Zeit. Doch die in das Blut, das in der Plazenta nach der segmentalen Dissektion links wird Sauerstoff unterstützt möglicherweise nicht für längere Zeit und aus diesem Grund die meisten der Kultur Einrichtung und Ausstattung sollte bereit sein, vor euthanizing die Maus verwendet werden, festgelegt werden. Wir in der Regel die Embryonen in der Kultur, in 25-30 min zu bekommen aus der Zeit, die Maus getötet wurde. Diese kurze Zeitspanne, um die Kultur zu starten wäre nicht möglich, wenn Embryonen zu einem verarbeitet werden zu einer Zeit, als in Zeeb vorgeschlagen waren, 18 M. et al. Wenn Embryonen werden einzeln verarbeitet wird, ist Gruppierung von Embryonen nicht möglich und jeder Embryo sollte für Somitenzahl gezählt. Dieses Verfahren würde mindestens 5-6 min für jeden Embryo zu isolieren nehmen, exteriorize vom Dottersack, zählen Somiten und Transfer in der Kulturflasche. Für eine Wurfgröße von 10 bis 12 Embryonen, die wir in der Regel von unserer CD-1-Mäusen bekommen, wäre der gesamte Prozess von 60 bis 72 min für die letzten paar Embryonen nehmen, um in die c erhaltenulture. Das ist ziemlich lange Zeit, und wir beobachten den Herzschlag zu verlangsamen und zu stoppen, wenn fast Embryonen wurden nach außen gelegt und in PBS links und Kultur verzögert. Eine andere mögliche Faktor könnte die Handhabung oder falsche Handhabung der Embryonen während des Verfahrens sein. Während der Handhabung, kann eine Unfallschäden an einem Teil des Körpers oder der Blutgefäße in der Embryo oder Dottersack, die nicht leicht erkannt wird induzieren. Dies kann die Entwicklung dieser Teil des Körpers oder manchmal der ganze Embryo beeinflussen, wie es wurde beobachtet, dass selbst eine gut entwickelte Embryo zeigt manchmal eine Art von Unterentwicklung an den Extremitäten wie die Extremitätenknospen und der Schwanz zeigt unzureichende Blutversorgung. Es ist besser, diese Embryonen, die während des Verfahrens beeinträchtigt oder beschädigt erscheinen verwerfen. Das andere Problem in der Regel während der Prozedur festgestellt wurde, einige der Embryonen mit intakter Dottersack stützen sich abrupt von decidua auf Segment Dissektion der Gebärmutter. Dies führt manchmal zu moWiederblutverlust an der Trennstelle aus der Plazenta obwohl die Vaskulatur mit Dottersack erhalten bleibt. Dieser Blutverlust können die spätere Entwicklung des Embryos durch weniger Blutmenge im Körper während der embryonalen Trennung beibehalten beeinflussen.
Abgesehen von den oben genannten Faktoren bestimmten Bedingungen, wie die Stufe des Embryos zum Zeitpunkt des Startens der Kultur beeinflusst die Entwicklung in der Kultur. Wir haben erfolgreich kultiviert Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen, beginnend mit Stufen, die zwischen 28 bis 37 s für 16 bis 40 Stunden reichten und beobachteten einige Unterschiede in der Entwicklung. Embryonen im Stadium 34-36 s zeigten eine bessere Entwicklung in der Kultur im Vergleich zu den Embryonen im Stadium 30-33 s was auf eine Zunahme der Anpassungsfähigkeit an den Kulturbedingungen in Embryonen in späteren Phasen kultiviert. Die andere überraschende Tatsache, die während der Kultur beobachtet wurde, war die Entwicklung von Embryonen, wenn zwei oder mehrere Embryonen kokultiviert wurden (Abbildung 4). Cokultur resulted zu einer signifikanten Verbesserung in der Entwicklung in einer der Embryonen gegenüber dem anderen Embryo in 45% der Co-Kulturen. Obwohl die Embryonen aus der gleichen Gebärmutter ähnlich morphologisch und in Somitenzahl betrachten, von Natur aus kann keine zwei Embryonen im gleichen Entwicklungsstadium sein, und das könnte einer der Gründe für die Entwicklungsunterschied in einem der Embryonen im Vergleich zu den anderen in der Co-Kultur sein System.
So zeigen wir, dass der Mitte der Schwangerschaft Bühne Maus-Embryonen kultiviert ex utero in einem Serum-freien Medium in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflasche Kulturapparat bei 37 ° C zeigen Wachstum und morphologische Entwicklung vergleichbar dass Embryonen in der Entwicklung in utero beobachtet. Wir glauben, dass diese Methode der Maus-Embryo-Kultur-System nützlich für Labors benötigen, um ganze Embryonen nutzen, um Signal Interaktionen in der frühen embryonalen Organentwicklung wichtig zu studieren.
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Disclosures
Wir haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir möchten Dr. Julie Gordon und Dr. Nancy Manley für ihre hilfreiche Ratschläge mit der Kulturtechnik zu danken. Diese Arbeit wurde von der Kinder-Glaukom-Stiftung und Sharon-Stewart Aniridie Research Trust unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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