Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.
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Methodenartikel
Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitte der Schwangerschaft Bühne Maus-Embryonen kultiviert wurden unter Verwendung eines Serum-freien Kulturmedium aus kommerziell verfügbaren Stammzell Medien Ergänzungen in einer sauerstoffhaltigen Rollflaschenkultur System vorbereitet. Maus-Embryonen E10.5 wurden sorgfältig von der Gebärmutter mit intakten Dottersack isoliert und in einem Prozess, der eine präzise chirurgische Manöver wurden die Embryonen vorsichtig aus dem Dottersack nach außen gelegt, während die Gefäß Kontinuität der Embryo mit Dottersack. Im Vergleich zu Embryonen mit intakter Dottersack oder mit dem Dottersack entfernt vorbereitet, zeigten diese Embryonen überlegene Überlebensrate und Entwicklungsfortschritt unter ähnlichen Bedingungen, wenn kultiviert. Wir zeigen, daß diese Maus-Embryonen, wenn in einem definierten Medium in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C für 16-40 h kultiviert, morphologische Entwicklung und Wachstum vergleichbar die Embryonen in der Gebärmutter entwickeln. Wir glauben, thVerfahren ist nützlich für die Ermittler brauchen, um ganze Embryokultur nutzen, um Signal Wechselwirkungen in der embryonalen Organentwicklung wichtig zu studieren.
Einleitung
In-vitro-Kultur Verfahren, die ganze Embryonen sind gut geeignet, um zu studieren Signalmechanismen in der embryonalen Organentwicklung beteiligt, die sonst nur schwer zugänglich sind, in utero. Ganze Embryonen bieten die Gewebeintegrität und Unterstützung für die Gewebe-Wechselwirkungen, die von entscheidender Bedeutung für die rechtzeitige Auftreten von Signalmechanismen unerlässlich sind angemessen für verschiedene zelluläre Prozesse während der Organogenese. Während ganze Embryokulturen bieten eine Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen, wie Transplantationsstudien, genetische Manipulationen und Gewebe-, Perl-Implantationsstudien, toxikolog....
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Protokoll
Maus-Embryokultur:
Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien folgende Protokoll # A2010 07-119, die überprüft und von der Universität von Georgia Institutional Animal Care und Verwenden Committee, das weiterhin Regulierungsaufsicht unterhält genehmigt wurde, durchgeführt.
1. Herstellung von Nährmedien
- Bereiten Kulturmedium unter Verwendung kommerziell verfügbarer Stammzellen Medien und Ergänzungen in folgenden Mengen: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2-Beilage (1x), Albumin aus Rinderserum (2%), Penicillin ( 50 IU / ml),....
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Ergebnisse
Entwicklung von Maus-Embryonen ex utero hängt von mehreren Faktoren ab dem Zeitpunkt der Uterus wird aus dem Körper zu der Zeit die Embryonen kultiviert isoliert. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, beinhaltet das Verfahren eine Reihe von Schritten, einschließlich Abtrennung der graviden Uterus von dem Körper (1A), Isolierung der Embryonen mit intakter Dottersack (1B), Exteriorisation der Embryonen aus dem Dottersack ( 1C) Kultivierung der Embryonen.......
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Diskussion
Mitte der Schwangerschaft Stufe Maus-Embryonen wurden in einem Serum-freien Kulturmedien in einer Atmosphäre von 95% O 2/5% CO 2 in einer Rollflaschenkultur Vorrichtung bei 37 ° C kultiviert Entwicklung des Embryos ex utero war bei jedem Schritt kritisch abhängig von mehreren Faktoren während des Verfahrens ab dem Zeitpunkt der Uterus der Maus euthanasiert zur Vervollständigung der Kultur (1) isoliert. Der wichtigste Faktor, der die Entwicklung beeinflusst war die Zeit, um.......
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Offenlegungen
Wir haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Wir möchten Dr. Julie Gordon und Dr. Nancy Manley für ihre hilfreiche Ratschläge mit der Kulturtechnik zu danken. Diese Arbeit wurde von der Kinder-Glaukom-Stiftung und Sharon-Stewart Aniridie Research Trust unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Ersatz | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Ergänzung | Invitrogen | 17502-048 | Bestand: 100x |
| Albumin, aus Rinderserum | Sigma | A9418-50G | Bestand: 100% |
| Antibiotikum - Antimykotische Lösung | Cellgro | 30-004-Cl | Bestand: Penicillin (10.000 IE/ml); Streptomycin (10.000 &Mikro; g/ml; Amphotericin (250 µ g/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Präzisions-Inkubatoreinheit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge | England Id.No. 840-374 | |
| Glasflaschen für rotierende Einheit | B.T.C. Engineering | ||
| Silikonkautschuk Kork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Zylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Präpariermikroskop | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Mikroskop | Zeiss | ||
| CO2 Inkubator mit Wassermantel | Forma Scientific | Modell: 3110 | |
| Kulturhaube | Nuaire Biologische Sicherheitswerkbänke Klasse II TypA2 | Modell: Nu-425-600 | |
| Wasserbad | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Waage | Mettler Toledo | AG285 | |
| Zentrifugenröhrchen, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Leichte Schere | zur Bedienung Roboz | RS-6702 | |
| Bedienung Scharf-stumpf Schere | Roboz | RS-6812 | |
| Mikrodisparierzange, 4 Zoll | Roboz | RS-5211 | |
| Mikrodisparierzange - Hudson (cWALD), 4-3/4 Zoll | Roboz | RS-5237 | |
| Mikrodisparierpinzette (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modifiziert - Scharfe Enden wurden stumpf gemacht |
| Mikrodisparierpinzette (5) | Roboz | RS-5060 | Modifiziert - Scharfe Enden wurden stumpf gemacht |
| Pinzette für Mikrodissektion (55) | Roboz | RS-5063 | Modifiziert - Scharfe Enden wurden stumpf gemacht |
| Instrumentenablage | Roboz | RT-1401S | |
| Instrumentenablage Deckel | Roboz | RT-1401L | |
| Petrischale-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petrischale-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petrischale-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filtersystem ( 0,22 & Mikro; m Celluloseacetat)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filtersystem (0,22 & Mikro; m Celluloseacetat)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filtersystem (0,22 & Mikro; m Celluloseacetat)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipettierhilfe | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serologische Pipette - 10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Serologische Einwegpipette - 25 ml | Corning | 4251 | |
| Transferpipette - 7,7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Referenzen
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
