Summary
סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.
Abstract
עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית ניצול מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי במערכת תרבות בקבוק מתגלגל מחומצן. עוברי עכברים בE10.5 בודדו בקפידה מתוך הרחם עם שק חלמון בשלמות ובתהליך כרוך תמרון כירורגית מדויק עוברי exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על ההמשכיות וכלי הדם של העובר עם שק החלמון. בהשוואה לעוברים מוכנים עם שק חלמון ללא פגע או עם שק החלמון הוסר, עובר אלה הוצגו שיעור הישרדות מעולה והתקדמות התפתחותית כאשר בתרבית בתנאים דומים. אנו מראים כי עוברי עכברים אלה, כאשר בתרבית במדיום מוגדר באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה 16-40, מפגינים צמיחה והתפתחות מורפולוגית להשוות העוברים מתפתחים ברחם. אנו מאמינים ההשיטה תהיה שימושית עבור חוקרי צורך לנצל תרבות עובר שלמה כדי לחקור אינטראקציות איתות חשובות בorganogenesis העוברי.
Introduction
במבחנה שיטות תרבות ניצול כל העוברים מתאימות גם ללמוד איתות מנגנונים המעורבים בorganogenesis העוברי שקשים אחרת לגישה ברחם. עוברים שלמים לספק את שלמות הרקמות ותמיכה מתאימה לאינטראקציות רקמות, כי הם חיוניים להתרחשות בזמן של איתות מנגנונים חיוניים לתהליכים תאיים שונים במהלך organogenesis. בעוד תרבויות עובר כולו לתת במה לשפע של יישומים, כגון לימודי השתלה, מניפולציות גנטיות ורקמות, מחקרי השתלת חרוז, מחקרי טוקסיקולוגי, וכו '., מערכות תרבות עובר מנוצלים כיום הן בעיקר תלויות בסרום לצמיחה ולתחזוקה נאותות של העוברים בתרבות 1-9.
הסרום נוצל כאחד המרכיבים העיקריים הנעים 10-100% מהתקשורת והתרבות 6-8, 10, 11.; עם זאת, ההרכב של סרום אינו מוגדר היטב והוא יכול להיות שונה מבעלי החיים לבעלי חיים ובכל פעם הסרום נאסף. בזמן הכנת מעבדה של סרום היא זמן רב וכרוכה בנהלים מחמירים, סרום רכש מסחרי מציג שונות רבות בקרב הרבה שונים ומעלה את עלויות ניסוי. נוסף על אלה, בסרום עשוי להכיל גורמים בלתי ידועים כגון גורמי גדילה, הורמונים, או חלבונים אחרים, אשר יכול להשפיע על התוצאה של ניסויים מסוימים, בעיקר אלה הכרוכות במחקר של מולקולות איתות חשובות באינטראקציות רקמות. מחקרים הראו כי תוספת של סרום לתרבות עלולה לשנות את הרמות תאית של מולקולות איתות מסוימות, כגון monophosphate המחזורי אדנוזין (cAMP) וחלבונים מעורבים איתות וphosphoinositide 3 mitogenic (PI 3)-kinase איתות מסלולים 12-14. בניגוד לאלה, מערכת תרבות סרום ללא מספקת את היתרונות של סביבת אנטיגן חופשי,התנזרות מאנזימים פעילים ביולוגי, שיכול לשנות את התהליכים התאיים ומאפשרת עקביות בין ניסויים.
במחקר הנוכחי, אנו מנוצלים מדיום סרום ללא תרבות שהוכן מתוספי תקשורת תאי גזע זמינים באופן מסחרי לעוברי כל שלב אמצע הריון התרבות באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C 15,16. עוברי עכבר בתרבית למשך 16-40 שעות בתנאים המוגדרים אלה הציגו התקדמות בפיתוח צורני של גוף ושונה מבנים עובריים הכלליים כגון לב, גפיים, מוח ועיניים המצביעים על הרמות המתאימות של התרבות תאים, נדידה, התמיינות ואינטראקציות רקמות. ניתוח מולקולרי של ההתפתחות העוברית בתרבות לאחת ממערכות האיברים מורכבות כמו העין חשף את הפיתוח העיני להיות עקבי עם זה שנצפה ברקמת העין בembryos מתפתח ברחם (Kalaskar ולודרדייל, בהכנה). כך אנו מראים כי עוברי עכבר בתרבית בשלב אמצע הריון, מפגינים צמיחה מתקדמת ופיתוח מורפולוגיים דומה לזה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תרבות עובר עכבר:
כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם קפדן עם המכון הלאומי לבריאות ההנחיות הבאה # פרוטוקול A2010 07-119, שנבדק ואושר על ידי אוניברסיטת ג'ורג'יה המוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, השומר על פיקוח רגולטורים המשיך.
1. הכנת תרבות מדיה
- הכן את מדיום תרבות באמצעות תקשורת בתאי גזע זמינה באופן מסחרי ותוספים בסכומים הבאים: נוקאאוט DMEM, החלפה בנוקאאוט סרום (KSR) (10%), N-2 מוסף (1x), אלבומין, משור הסרום (2%), פניצילין ( 50 IU / ml), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וAmphotericin-B (1.25 מיקרוגרם / מיליליטר). מדיום התרבות הכין דומה לזה שתואר קודם לכן 15 עם השינויים הבאים: תוספת של אנטי mycotics ובאמצעות פעמיים הריכוז של אנטיביוטיקה (לפרטים של חומרים כימיים וציוד מסוימים, ראה ליst של חומרים).
שים לב: ריכוז אנטיביוטיקה כהשתמש בעבר (. מור-סקוט, et al 15) היה מספיק לתרבויות עובר ביצעו עד 24 תקופת זמן שעה. עם זאת, כאשר התרבות נמשכה מעבר 24 שעות, שחווינו זיהום של התרבות וזה היה בשליטה בהצלחה על ידי הכפלת ריכוז האנטיביוטיקה. - אחסן את רכיבי תקשורת על 4 מעלות צלזיוס או ב-20 מעלות צלזיוס בהתאם להמלצות יצרן. יש לאחסן KSR ו-N-2 מוסף בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. נוקאאוט DMEM פתח פעם אחת צריך להיות מנוצל בתוך 30 ימים לפי המלצת יצרן. לפני השימוש, לחמם את המרכיבים באמבט מים עד 37 ° C.
- הכן את התקשורת בתנאים סטריליים. לחטא את פני השטח של כל הציוד והבקבוקים המכילים את מרכיבי תקשורת עם 70% ספריי אלכוהול לפני הצבתי במכסת המנוע בתרבית.
- ניתן לערבב את רכיבי התקשורת או בכוס סטרילית או ישירות במערכת הסינון (קורנינג). ראשון מוסיף את אבקת אלבומין לDMEM נוקאאוט. מערבבים היטב על ידי בעדינות רועדת עד אלבומין מתמוסס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף את תוספת N-2, KSR ואנטיביוטיקה ומערבבים היטב באמצעות pipettor. ואז לסנן לעקר את התקשורת באמצעות מסנן גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום. לוותר מדיה לתוך 50 צינורות מ"ל ולאחסן בצורת חרוט על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להשתמש באמצעי התקשורת מוכן פעם אחת בתוך 4-5 ימים לתרבות.
2. הכנה של תרבות ציוד
- לעקר את בקבוקי תרבות זכוכית ופקקי גומי. לעטוף את בקבוקי התרבות ברדיד אלומיניום ומניח את פקקי בקבוק גומי בכוס מים ולעקר ידי מעוקר.
- לעקר את חדר התרבות (Precision חממת יחידה) עם 70% ספריי אלכוהול וחם 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחיל התרבות. חדר התרבות הוא דוארהתלוצץ עם דיסק מתגלגל במרכז שמחזיק את בקבוקי התרבות. זרימת גז לתוך התא מוסדרת על ידי מד לחץ וקצב הזרימה יכול להיות מותאם על ידי התבוננות יצוא של בועות אוויר במים בצינור זכוכית בסוף. מנגנון תרבות זו מתגלגל בקבוק הוא גרסה שונה של המכשיר המקורי שהוצג על ידי בניו וCockroft 17.
- חבר בלון גז המכיל תערובת גז של 95% O 2/5% CO 2 לחדר התרבות ולהתאים את זרימת הגז ל" בועת אוויר אחת לשנייה ", שנותנת קצב זרימה של 50 סמ"ק / דקה ומבטיחה אספקת חמצן נאותה לעוברי התרבות.
3. עובר אוסף מאוס והכנה לתרבות
- כדי לקבל עוברי עכברי סוג בר, אנחנו מנוצלים עכברים של C57BL/6J ו-CD-1 (Charles River Laboratories) זני רקע גנטי.
- בדוק את נקבות העכברים לתקעים בנרתיק בכל יום בבוקר. בצהריים ביום של מציאת הדואר תקע נרתיק צריך להיחשב כE0.5 DPC (ימים שלאחר משגל).
- איסוף עובר עכבר בE10.5 DPC ידי הרדמת חסד העכברים בהריון הבא פרוטוקולים סטנדרטיים. עכברים מורדמים באמצעות מכשיר משאיפת CO 2 כמו שצוין על ידי האגודה האמריקנית לרפואת וטרינרית (AVMA) הנחיות להמתת החסד של בעלי חיים (2013). כדי להבטיח את המוות, נקע בצוואר הרחם בוצע לאחר החשיפה ל-CO 2.
- ריסוס 70% אתנול על פני בטן הגחון, כדי למנוע הידבקות של שיער בבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrally באמצעות מספריים הפעלה חדים בוטים וזוג 4-3/4 בmicrodissecting מלקחיים כדי לאתר את הרחם. באמצעות 4 במלקחי microdissecting להרים את הרחם כולו ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך עם מספריים הפעלה אור בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם.
- מהר לשטוף את הרחם כולו ב1x PBS חימם ל37 מעלות צלזיוסכדי להסיר כל דבק דם אל הרחם ואת המקום באופן מיידי בDMEM לחמם 37 מעלות צלזיוס בצלחת פטרי. לעקר את המכשירים על ידי 70% תרסיס אתנול לפני שימוש נוסף.
הערה: Preheating הפתרונות כוללים PBS, DMEM ובינוני התרבות ושמירתם על 37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך כולו מומלץ. - תחת מיקרוסקופ לנתח, הרחם צריך להיות גזור segmentally עם מספריים הפעלת אור. התוצאה היא פתחים קטנים בכל צד של הרחם המפולח דרכו פינצטה microdissecting שונה (קצוות קהה) יכולה להיות מוכנסת בעדינות כדי להרחיב את הפתח. זה מאפשר החשיפה של decidua השליה, אשר לאחר מכן ניתן להסיר בעדינות על ידי קריעה עם פינצטה microdissecting לחשוף את שק החלמון הקודקודית (פיז) עם הקרום של רייכרט. שימוש בקצה אחד של פינצטה בעדינות לנקב את הקרום של רייכרט יחד עם פיז ונפרד מן הדואר בסיסי שק חלמון קרביים (VYS) שכבה לחשוף את העוברים עם VYS ללא פגע. קונוס ectoplacental ונגזרי trophoectoderm ניתן להסיר גם עם decidua השליה או עם הקרום של רייכרט. יש להקפיד להימנע מקרע של VYS כעוברים קופצים החוצה באופן מיידי.
- עובר עם VYS שלם אמורים להיות מועבר לצלחת פטרי שמכילה את מדיום תרבות לחמם 37 מעלות צלזיוס באמצעות פיפטה העברה פלסטיק.
הערה: העברה למדיום תרבות מייד לאחר פרידה מרחם מסייעת להתפתחות טובה יותר של העובר בתרבות. - פתח קטן צריכה להתבצע בצק החלמון עם פינצטה microdissecting הימנעות כלי דם גדולים. זוג חד של פינצטה יכול לשמש כדי להפוך את הפתיחה בעדינות על ידי הפירסינג באזור סמוך לאזור הראש. לחלופין שני זוגות של פינצטה הבוטה יכולים לשמש כדי להחזיק את שק החלמון ועדינות לקרוע כדי להפוך את פתח קטן.ואז בעדינות להרחיב את הפתח על ידי הרחבת עם פינצטה לגודל פשוט מספיק כדי להתאים את הראש העוברי. הקרום השפיר העוטף את העובר באופן הדוק צריך להתנהל בעדינות מהגוף וקרוע באמצעות פינצטה. הראש העוברי ולאחר מכן את כל העובר צריך להיות exteriorized עדינות מצק החלמון, תוך שמירה על שלמות כלי הדם העוברי עם זה של שק החלמון 15.
הערה: כל פגיעה בכלי דם שק החלמון עלול להשפיע על התפתחותו של העובר בתרבות. אין להשתמש בעוברים כזה עם כלי דם שניזוקו לתרבות ויכולים לשמש לאחסון הזמני העוברים אשר מאוחר יותר יכול להיות מושלך. - קריטריוני היערכות עובריים: בדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתח וקבוצתי על ידי קריטריונים מורפולוגיים, כולל גוף וגודל הראש, גפיים ומורפולוגיה העין ובמה על ידי ספירת מספר somite (ות) עבור לפחות שני עוברים מכל קבוצה.
<strong> הערה: בדרך כלל עוברים המתקבלים מהבדלי מופע ההמלטה זהים בפיתוח ברחם ושונה בגודל הגוף, תכונות מורפולוגיות ומספר somites. עם זאת, מצאנו כי עוברי מקובצים לפי הקריטריונים מורפולוגיים שלנו בדרך כלל הציגו מספר דומה somite (± 1). מסיבה זו, היא אינה נדרשת לספור somites לכל עובר כמו זה יעכב את הזמן להתחלת התרבות.
שים לב: אין להשתמש בעוברים ששמשו לספור somites לתרבות. ספירת somites לאחר תחילת התרבות לעוברים אחרים על מנת למנוע את השהיית הזמן במתחיל התרבות. העוברים שעוכבו לתרבות אחרי פרידה מהרחם בדרך כלל תערוכת פיתוח עני. - מעביר את העוברים מייד לצלחת פטרי עם תרבות טרי בינוני לחמם 37 מעלות צלזיוס ולקחת אותו למכסת מנוע התרבות שבה עובר שוב צריך להיות מועבר לצלחת פטרי עם cultur סטריליתקשורת דואר לפני שמכניסה אותם לבקבוקי התרבות עם מדיום כדי להתחיל את התרבות.
הערה: העברות תקשורת מרובות עבור העוברים לפני התרבות מסייעת במניעת זיהום כצעדים השונים של אוסף עובר ונתיחה בוצעו תחת מיקרוסקופ לנתח שלא הותקן במכסת המנוע בתרבית.
הערה: כאשר גודל ההמלטה הוא גדול (> 12 עוברים), חצי מעוברי התהליך ולהתחיל את התרבות או לשים אותם בצלחת עם מדיום התרבות ולמקם אותו בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. כאשר עוברים הושארו מחוץ לתקופות ארוכות יותר (> דקות 35-40) שנצפינו קצב הלב להאט את קצב וזה ישפיע על ההתפתחות המאוחרת יותר בתרבות.
4. Culturing עוברי עכברים
- פתח את בקבוקי תרבות autoclaved בשכונה התרבות ולתייג אותם כמו שצריך. העברת 3 מיליליטר של מדיום תרבות לחמם 37 ° C לכל אחד tהוא בקבוקים ולאחר מכן את עוברי העכבר צריכים להיות מועברים בעדינות לתוך בקבוקי התרבות באמצעות טפטפות העברת פלסטיק סטרילית. בקבוקי התרבות אמורים להיות כתרים עם פקקי בקבוק גומי המסייעים להחזיק את בקבוקי התרבות לדיסק מתגלגל במנגנון התרבות.
הערה: אפשר להכין בקבוקי התרבות עם התקשורת והניחו על הדיסק מתגלגל של מנגנון התרבות לפני והרדמת חסד העכברים. זה מקצר את הזמן להעברת עוברים לתוך בקבוקי התרבות.
שימו לב: יכול להיות מתורבת עוברי עכבר בנפרד או כcocultures עם שניים או שלושה עוברים באותו בקבוק התרבות. - בקבוקי התרבות צריכים להתבצע סביבה נקיה מחיידקים למנגנון התרבות על 37 מעלות צלזיוס והדוקות חבר אותם לחורים שבדיסק מתגלגל עם פקקי הגומי. הפעל את הדיסק מתגלגל כדי לסובב במהירות קבועה של 35 סיבובים לדקה (סל"ד), המאפשרת ציפה החופשית של embryos בתקשורת וגם מסייע בחילוף גזים בחינם על ידי הרקמה העוברית. הגז מהצילינדר המחובר לחדר התרבות זורם דרך הדיסק מתגלגל ופקקי גומי לבקבוקי התרבות.
- התרבות עובר ל16-40 שעה ובאופן קבוע לבדוק את יצוא הגז וטמפרטורת חדר התרבות.
הערה: מניפולציה עובר מאוס בתרבות: בואו לקבל העוברים מותאמים לתנאי התרבות לפחות 30 דקות. לאחר מכן עובר עם ביצועים נמוכים ומראה דופק חלש יכול להיות מושלך ואת העוברים שנותרו יכולים להיות מנוצל עבור מחקרי מניפולציה נוספים. ניתן לבצע מניפולציות עובר כגון 5,9,16 electroporation, microinjections 18, השתלת חרוז 16, טיפול תרופתי והליכים אחרים בשלב זה. אנחנו ביצענו בהצלחה השתלה של חרוזים agarose Affi ג'ל שטופלו במולקולות איתות מסוימות כדי ללמוד את תפקידם בפיתוח העין מוקדם. העוברים לאחרניתן להחזיר מניפולציות בחזרה במדיום חדש והמשיכו בתרבות. - החלף את התקשורת והתרבות לגמרי עם מדיה חדשה במרווחי זמן מסוימים לאחר שעות 9-10 ו18-19 שעות של התרבות שבה התרבות הייתה נמשכה 40 שעה.
הערה: החלפת מדיה תרבות לא ייתכן שתידרש אם התרבות הוא נעצרה על ידי 16-18 שעה. - מדדי הצלחה בתרבות של: הישרדות עוברי בתרבות צריכה להיקבע על ידי קצב לב גלוי וזרימת דם בגוף, תוך צמיחה עוברית בתרבות צריכה להיות מוערכת על ידי עלייה בגודל גוף, מספר somite ופיתוח הצורני של ראש, גפיים, לב ועיניים.
- בעוברים ברחם שפותח בE11.0 DPC (~ 40-41 ים) וE12.0 DPC (~ 49-50 ים) אמורים לשמש כבקרה להשוואה בין עוברים בתרבית למשך 16-18 שעות ו38-40 שעות, בהתאמה.
- התפתחות עוברי בנקודות זמן שונות במהלך תרבות ובשלבי רחם יכולה להיות קפטןured תחת מיקרוסקופ לנתח. תוכנת ההדמיה ספוט נוצלה כדי ללכוד את התמונות ולאחר מכן תעובד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח של עוברי עכברים תלויים לשעבר רחם בגורמים רבים החל מרגע שהרחם הוא מבודד מהגוף לזמן את העוברים בתרבית. כמתואר באיור 1, ההליך כרוך בשורה של צעדים ביניהם, הפרדה של הרחם הרה להולדת מהגוף (איור 1 א), בידודו של עובר עם שק חלמון בשלמותה (איור 1), החצנה של העוברים מצק החלמון ( איור 1 ג) וculturing העוברים בסרום ללא מדיה באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. עוברים הציגו הישרדות 100% כאשר הועברו לתקשורת בתרבות מייד לאחר פרידה מהרחם. בתנאי תרבות, עוברי עכברים אלה, כאשר בתרבית למשך 16-40 צמיחת שעות הציגו ופיתוח מורפולוגיים דומה לזה שנצפה בעוברים בשווים ערך מתפתחים ברחם (איור 2).
עוברים בE10.5 (~ 34-35 ים) (איור 2 א) כאשר בתרבית ל16-40 שעה שרדה ומתקדם בפיתוח ומעבר לשלב של 35 ים. העוברים אחרי 16-18 שעות בתרבות (2D דמויות ו3B; טבלת 1) הוסיפו כ 5-6 שעות והציג שיעור צמיחה של somite אחד לכל שניים וחצי שעות בתרבות והיו מורפולוגית דומה לE11.0 (~ עוברי 40-41 ים) שפותחו ברחם (2B דמויות ו3A). למרות הפיתוח התעכב כבשעה, עובר אלה בתרבות הציג עלייה כללית בגודל גוף וראש יחסי עם שלפוחית מוח שונה. העוברים הראו גם בפיתוח ניצני גפיים, היווצרות לב תאיים היטב ומראה של פיגמנטציה באפיתל הפיגמנט ברשתית. עם זאת, סוג זה של התפתחות נצפה בכ 58% מEMBryos תרבית תוך 28% מהעוברים הציגו פיתוח בינוני (איור 3 ג). עוברים מאוחר יותר אלה הראו גודל גוף קטן יותר אם כי לא היה להם מניין somite דומה בהשוואה לעוברים ברחם שפותח ב. היה להם ראש קטן יחסית, אם כי שלפוחית המוח הייתה מסומנות. חדרי הלב לא היו ברורים וניצני גפיים בכמה עוברים הציגו אזורים כהים בקצוות. בקצה השני של הספקטרום, על 14% מהעוברים הציגו להתפתחות לקויה בתרבות (איור 3D). היו עובר אלה גדלי גוף וראש קצרים והראה אזורים כהים בחלקים מסוימים של הגוף מעידים על שינויים ניווניים. למרות שהלב פועם זה היה חולה מפותח וחסר הבחנה לתוך תאים בכמה עוברים ובאחרים הגפיים הופיעו חשוכים ומפגרים בצמיחה.
עוברים המשיכו בתרבות ל38-40 שעה (איור 2E; 1 הטבלה) shחב על 49-50 ים והיו דומים לעוברי E12.0 (איור 2 ג) שפותחו ברחם. למרות העיכוב של 2-3 שעות, עובר אלה בתרבות הציג גידול יחסי בגודל גוף והראה בידול organogenesis ורקמות מתאים כפי שנצפה בהתפתחות של פיגמנטציה באפיתל רשתית פיגמנט והיווצרות של חוטם מתוחם היטב באזור הראש. למרות כמה חלקים בגפיים כמו ניצני גפיים והזנב שנראה כמו תחת מפותח, העוברים נראה שפיתוח דומה לעוברים ברחם. עם זאת, פיתוח מסוג זה נצפה רק ב 30-40% מהעוברים בתרבית (טבלה 1) ואילו שאר הציגו מגוון של התקדמות התפתחותית בתחומי צמיחה מפגרת או תחת פיתוח בחלקים מסוימים של הגוף או כל עובר.
מלבד ההבדלים לעיל בפיתוח, צפינו differe משמעותי NCE בפיתוח, כאשר עוברי cocultured באותו בקבוק התרבות. בהשוואה לעובר האחר (איורים 4 א ו4A ') בcoculture, העובר המפותח (4B דמויות ו4B') הציג צמיחה טובה יותר בכל ההיבטים של ההתפתחות העוברית. הבדלים גדולים נצפו בגודל הגוף הכללי וגודל ראש ולפעמים בלב והתפתחות איבר. בעוד שהעובר המפותח מcoculture היה מורפולוגית דומה לעוברים המתפתחים ברחם, העובר האחר בcoculture תמיד נראה פחות מפותח בהשוואה לעובר המפותח. זה סוג של הבדל בפיתוח נצפה ב45% מcocultures (N = 27), בעוד שאר cocultures (N = 33) הראה התפתחות כמעט דומה בשני העוברים בcoculture.
דואר 1 "עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
איור 1. צעדים בפרוטוקול תרבות עובר עכבר. () רחם הרה להולדת עם עוברים מבודדים מעכבר האם. (ב) עוברים עם שק חלמון שלם הופרד מdecidua לאחר נתיחה מגזרית של רחם. (ג) עוברים exteriorized מצק החלמון. (ד) מנגנון בקבוק רולינג תרבות על 37 מעלות צלזיוס ומסופק עם 95% O 2/5% CO 2 למשך culturing עוברי עכבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
<br /> איור 2. עוברים בתרבות לשכפל בפיתוח רחם. בפיתוח רחם בE10.5 (), E11.0 (B) וE12.0 (C). פיתוח בתרבות לאחר 18 שעה (ד ') ו40 שעה (E). בר הסולם ב (ה) חל על כל הפנלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. התפתחות עוברי בתרבית. עובר התפתח ברחם בE11.0 DPC (א) פיתוח. בתרבות (B, C, D). (Bייצוג) של התפתחות עוברית טובה בתרבות. אודות 58% מעוברים הכולל תרבית פיתוח דומה לתערוכה בעוברים ברחם מפותחת. ייצוג (C) של פיתוח ביניים בתרבות. אודות 28% מעוברים בתרבית פיתוח ביניים מופע. ייצוג (ד ') של התפתחות עוברית עני בתרבות. עוברים על 14% להראות להתפתחות לקויה בתרבות. בר הסולם ב (ד) חל על כל הפנלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הבדלים התפתחותית במערכת coculture עובר עכבר. עוברים בתחילת coculture ( ב '). התפתחות עוברי לאחר 16 שעות של coculture (א ', ב'). אחד מהעוברים בcoculture (א ') מופיע תחת בגודל בהשוואה לעובר האחר (ב') בcoculture. בר הסולם ב (ב ') חל על כל הפנלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| סה"כ עוברים בתרבית ל16-18 שעה | פיתוח לאחר Culturing ל16-18 שעה | סה"כ עוברים בתרבית ל38-40 שעה | פיתוח לאחר Culturing ל38-40 שעה | |||
| טוב | ביניים | עני | טוב | עני | ||
| 112 | 65 | ביום 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
טבלת 1. פיתוח של עוברים במערכת תרבות עובר עכבר. עוברים בתרבית למשך שעה או 16-18 או 38-40 לשעה. של 112 עוברי סך הכל בתרבית ל16-18 שעה, 65 (58%) עוברים הציגו פיתוח דומה לעוברים המתפתחים ברחם, ביום 31 (28%) הראו ביניים ו16 (14%) הראו התפתחות לקויה. של 12 עוברי סך הכל בתרבית ל39-40 שעה, רק עוברי 4 (~ 35%) הראו התפתחות טובה בזמן ההתפתחות הלקויה הראתה שנותרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עוברי עכברים בשלב אמצע הריון היו בתרבית בתקשורת ותרבות בסרום ללא באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 ° C. הרחם לשעבר התפתחות עובר היה תלוי באופן קריטי במספר גורמים: בכל שלב במהלך ההליך מרגע שהרחם בודד מהעכברים מורדמים ועד לסיומה של התרבות (איור 1). הגורם החשוב ביותר שהשפיע על ההתפתחות היה הזמן שנדרש כדי להתחיל את התרבות. נקודות קריטיות האחרות במהלך ההליך שדורשים רוב הטיפול כוללות צעדים כגון ההפרדה עובר עם שק חלמון בשלמותה מהרחם וההחצנה של העוברים מצק החלמון. כמו שיש לי המכרסמים שליה discoid, נתיחה מגזרית של הרחם לא פגעה באספקת הדם לעובר גם אם decidua השליה פגומה מעט בפינות. בעובדה זו השאירה פתח קטן בeiיס בסופו שדרכו זוג מלקחיים בוטים יכול להיות מוכנס לקורע את הרחם ואת השליה decidua מאפשר בידוד קל של עובר עם שק חלמון בשלמותה בעדינות. עם זאת, הצעד הבא של החצנה של העוברים מצק החלמון הוא קריטי בכך שכל פגיעה בכלי הדם הגדולים בצק החלמון הייתה פוטנציאל ההשפעה על התפתחות העובר בתרבות. התפתחות עוברית תקינה נתמכה כאשר עוברי exteriorized מצק חלמון שמירה על שלמותו של כלי הדם בצק החלמון. מחקרים קודמים הצביעו על פתיחתו של שק החלמון כאשר עכבר עובר מעבר לשלב עוברי E10 היו בתרבית 1, 15, 18, 19. בהתאם לכך, אנו נצפו שינויים ניווניים והעוברים לא יכולים לשרוד את תקופת התרבות כאשר עוברי E10.5 היו בתרבית עם שק חלמון ללא פגע. אנו מניחים ההחצנה של העוברים יקל תזונתי יעילbsorption דרך הרקמות תוך שמירה על ההמשכיות בכלי דם עם שק החלמון. עובר אלו בתרבות הציג פעימות לב יעילות וזרימת דם בחלקי הגוף העובריים בהשוואה לעוברים בתרבית, ללא שק החלמון.
שמירה על העוברים במדיום תרבות לחמם 37 ° C תקין מרגע שהם מבודדים מהרחם לזמן של התרבות הייתי לספק את הסביבה המתאימה ביותר כדי לקיים את היכולת שלהם לפיתוח מאוחר יותר בתרבות באופן מיידי. זה גם מונע זיהום בשל נוכחותם של אנטיביוטיקה בטווח הבינוני וימנע שילוב של כמויות אפילו דקות של PBS / DMEM לתרבות. הבינוני המוגדר יש לנו מנוצלים הניב התפתחות עוברית טובה יותר בהשוואה להוקמה מדיה אחרת מוגדרת שתוארה קודם לכן בWawersik et al. 20, 21 (מידע לא מוצג). ההבדל בהתפתחות עוברית יכול בעיקר להיות בגלללרכיבים הייחודיים במדיום המוגדר, כגון, החלפת סרום נוקאאוט (KSR) ו-N-2 מוסף. בעוד N-2 מוסף הוצג כדי לתמוך בצמיחה והביטוי של נוירונים לאחר mitotic, KSR הוצג להיות תחליף ישיר בסרום שור העובר 22, 23. KSR היה בשימוש בתרבויות כדי לתמוך בצמיחה של תאי גזע pluripotent מובחנים, כמו גם תאי גזע עובריים אנושיים ועכבר שהוצגו להיות יציב וgermline מוסמך 23-25. מלבד התרבות בינונית, ריכוז החמצן בבקבוק התרבות משחק תפקיד קריטי בהתפתחות עוברית. עוברים לא יכולים לשרוד בתנאים של 5% CO 2 באינקובטור קונבנציונלי. למרות שאנחנו לא צריכים לבדוק את ריכוזי חמצן אחרים וספיקות שונות כפי שהוצע בעבר 5,9, השימוש ב95% O 2/5% CO 2 בקצב זרימה קבוע ספג השרידות של העוברים בתרבות. בעוד סיבוב שלבקבוקי תרבות הוא הכרחיים, עוברים כאשר בתרבית בתנאים זהים אך ללא סיבוב של בקבוקי התרבות הביאו nonsurvival של העוברים ללא דופק גלוי. אנו מניחים שרוטציה קבועה (35 סל"ד) במנגנון תרבות הבקבוק מתגלגל אפשרה השעיה חופשית של העוברים בטווח הבינוני וגם שפר את הספיגה של חומרי מזון וחמצן דרך הרקמות העוברית. הצמיחה של עוברים אלה בתרבות במונחים של גודל כולל גוף והראש, מורפולוגיה, היווצרות לב תאיים היטב, שלפוחית המוח ופיתוח עיני הייתה דומה לזו של עוברים מתפתחים ברחם. בידיים שלנו, היינו יכול לשכפל את ההתפתחות העוברית שנצפתה על ידי מור-סקוט et al. 15
העוברים בתרבות הציגו מגוון של צמיחה והתפתחות מורפולוגית בהתאם לגורמים מרובים (איור 3; טבלת 1). תחת התרבות המוגדרתתנאים היינו, עובר בתרבית למשך 16-18 שעות הראו התפתחות דומה לזה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם בכ 58% מעוברים, ואילו 28% הראו ביניים ו14% הראו התפתחות לקויה. שלוחה של התרבות ל38-40 שעה ירדה עוד יותר את היכולת להראות פיתוח דומה לרק 30-40% מהעוברים בסך הכל בתרבית. מלבד הגורמים הטבועים שאולי אף להשפיע על הרחם לשעבר התפתחות העוברי, גורמים חיצוניים רבים שניתן הצליחו במידה מסוימת עשויים לשחק תפקיד קריטי כאשר הם עובר בתרבית למשך אורך זמן ממושך. גורם פוטנציאלי אחד כזה שניתן לשלוט הוא הזמן שלוקח מהבידוד של עוברים מהרחם לתחילתה של התרבות. זה יכול להתפרש שהעוברים המבודדים הראשונים נחשפים פחות חמצן בצלחת התרבות בהשוואה לעוברים מבודדים בסוף כמו כל העוברים להיכנס לבקבוק התרבות ולקבל 95 O% 2/5% CO 2באותו הזמן. עם זאת החמצן זמין בדם שנשאר בשליה לאחר נתיחה מגזרית עשוי שלא לתמוך לתקופה ארוכה של זמן ומהסיבה זו מרבית הציוד ואבזרים לתרבות יש להגדיר מוכן לשימוש לפני והרדמת חסד העכבר. בדרך כלל אנחנו מקבלים את העוברים לתוך התרבות ב25-30 דקות מרגע שהעכבר היה מורדמים. פרק זמן קצר זה כדי להתחיל בתרבות לא יהיה אפשרי אם עוברים היו להיות מעובד אחד בכל פעם כפי שהוצע בZeeb, מ 'ואח'. 18 כאשר עוברים מעובדים בנפרד, הקיבוץ של עוברים אינו אפשרי וכל עובר צריך להיות נספר למספר somite. הליך זה ייקח לפחות 5-6 דק 'לכל עובר לבודד, exteriorize מצק חלמון, לספור somites ולהעביר לבקבוק התרבות. לגודל המלטה של 10-12 עוברים, שאנחנו בדרך כלל מקבלים מעכברי CD-1 שלנו, כל התהליך היה לוקח 60-72 דקות לכמה העוברים האחרונים להיכנס לגulture. זו תקופה די ארוכה ואנחנו נצפו פעימות הלב להאט וכמעט לעצור כאשר עוברי exteriorized ועזבו ב PBS ועיכבו לתרבות. גורם אפשרי אחר אחת יכול להיות הטיפול או טיפולו הכושל של העוברים במהלך ההליך. במהלך הטיפול בו, אתה עלול לגרום לניזק תאונתי לחלק מסוים של הגוף או כלי דם בצק העובר או חלמון שאינו מזוהה בקלות. זה יכול להשפיע על התפתחותו של אותו חלק של הגוף או לפעמים כל העובר כפי שהיה ציין כי אפילו עובר מפותח לפעמים מראה סוג של פיתוח תחת בגפיים כמו ניצני גפיים והזנב המצביע על אספקת דם מספקת. עדיף להשליך עוברים כזה שמופיעים להיות בסכנה או ניזוקו במהלך ההליך. הבעיה אחרת נתקלה בדרך כלל במהלך ההליך הייתה, חלק מהעוברים עם שק חלמון שלם לתמוך החוצה בפתאומיות מdecidua על נתיחה מגזרית של הרחם. לפעמים זה גורם למומחדש איבוד דם בנקודת ההפרדה מהשליה למרות בכלי הדם עם שק החלמון נשאר שלם. איבוד דם זה יכול להשפיע על ההתפתחות המאוחרת של העובר עקב פחות כמות הדם נשמרת בגוף העוברי במהלך הפרדה.
מלבד הגורמים הנ"ל תנאים מסוימים כמו, השלב של עובר בזמן שמתחיל התרבות השפיעו על ההתפתחות בתרבות. אנו עוברי עכברים באמצע הריון בתרבית בהצלחה מתחילים עם שלבים שנעו בין 28-37 של ל16-40 שעות ונצפו כמה הבדלים בפיתוח. עוברים בשלב של 34-36 הציגו התפתחות טובה יותר בתרבות בהשוואה לעוברים בשלב של 30-33 מעידים על עלייה ביכולת הסתגלות לתנאי תרבות בעוברים בתרבית בשלבים מאוחר יותר. העובדה המפתיעה נוספת שנצפתה במהלך התרבות הייתה ההתפתחות של עוברים כאשר שניים או יותר עוברי cocultured (איור 4). resulte Cocultureד בשיפור משמעותי בפיתוח באחד מהעוברים בהשוואה לעובר האחר ב45% מcocultures. למרות שהעוברים מאותו הרחם נראים דומים מורפולוגית ובספירת somite, מיסודו אין שני עוברים יכולים להיות באותו השלב של התפתחות וזה יכול להיות אחת הסיבות לפער ההתפתחותי באחד מהעוברים בהשוואה לאחרים בcoculture מערכת.
כך אנו מראים כי עוברי עכברים בשלב אמצע הריון רחם לשעבר בתרבית במדיום סרום ללא באווירה של 95% O 2/5% CO 2 במנגנון תרבות בקבוק מתגלגל על 37 צמיחת ° C תערוכה ופיתוח מורפולוגיים דומה זה שנצפה בעוברים מתפתחים ברחם. אנו מאמינים בשיטה זו של מערכת תרבות עובר עכבר תהיה שימושית עבור מעבדות צורך לנצל כל עוברים כדי לחקור אינטראקציות איתות חשובות בorganogenesis העוברי המוקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר ג'ולי גורדון וד"ר ננסי מנלי לעצות מועילות שלהם עם טכניקת התרבות. עבודה זו נתמכה על ידי הגלאוקומה הקרן לילדים ושרון-סטיוארט Aniridia אמון מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
