Summary
Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.
Abstract
Embrioni metà della gestazione del mouse fase sono state coltivate utilizzando un mezzo di coltura privo di siero preparato da disponibili in commercio integratori multimediali cellule staminali in un sistema di coltura bottiglia di laminazione ossigenato. Embrioni di topo a E10.5 sono stati attentamente isolati dal dell'utero con intatta sacco vitellino e, in un processo che coinvolge manovra chirurgica precisione gli embrioni sono stati gentilmente esteriorizzato dal sacco vitellino, pur mantenendo la continuità vascolare dell'embrione con il sacco vitellino. Rispetto agli embrioni preparati con intatta sacco vitellino o con il sacco vitellino rimosso, questi embrioni esposti tasso di sopravvivenza superiore e progressione evolutiva quando coltivate in condizioni simili. Abbiamo dimostrato che questi embrioni di topo, quando coltivate in un mezzo definito in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C per 16-40 ore, mostrano crescita e sviluppo morfologico paragonabile a gli embrioni in via di sviluppo in utero. Crediamo thè il metodo sarà utile per gli investigatori che hanno bisogno di utilizzare tutta la cultura dell'embrione per studiare le interazioni di segnalazione importanti nell'organogenesi embrionale.
Introduction
In vitro metodi colturali che utilizzano embrioni integrali sono adatti a studiare meccanismi di segnalazione coinvolti nella organogenesi embrionale che sono altrimenti di difficile accesso in utero. Embrioni integrali forniscono l'integrità dei tessuti e un sostegno adeguato per le interazioni dei tessuti che sono cruciali per la tempestiva presenza di meccanismi di segnalazione essenziali per i diversi processi cellulari durante l'organogenesi. Mentre intere culture embrione di fornire una piattaforma per una pletora di applicazioni come gli studi di trapianto, manipolazioni genetiche e biologiche, studi tallone di impianto, gli studi tossicologici, ecc., Sistemi di coltura di embrioni attualmente utilizzati sono prevalentemente a carico del siero per la corretta crescita e il mantenimento degli embrioni nella cultura 1-9.
Il siero è stato utilizzato come uno dei principali componenti che vanno dal 10-100% dei terreni di coltura 6-8, 10, 11., Tuttavia, la composizione del siero non è ben definito e può differire da un animale all'altro e ogni volta il siero viene raccolto. Mentre la preparazione del laboratorio di siero molto tempo e comporta procedure rigorose, siero procurato esibisce in commercio una notevole variabilità tra i diversi lotti e aumenta i costi sperimentali. In aggiunta a questi, il siero può contenere incognite, quali fattori di crescita, ormoni o altre proteine, che possono potenzialmente influenzare l'esito di alcuni esperimenti, in particolare quelli che riguardano lo studio di molecole di segnalazione importanti nelle interazioni tissutali. Studi hanno dimostrato che l'aggiunta di siero di cultura può potenzialmente alterare i livelli intracellulari di alcune molecole di segnalazione come adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e proteine coinvolte nella segnalazione mitogenico e phosphoinositide 3 (PI 3)-chinasi vie di segnalazione 12-14. Contrariamente a questi, un sistema esente da siero fornisce i vantaggi di ambiente antigene libero,astinenza da enzimi biologicamente attivi che possono alterare i processi cellulari e permette la coerenza tra esperimenti.
Nel presente studio, abbiamo utilizzato un mezzo di coltura privo di siero preparato da integratori multimediali cellule staminali disponibili in commercio per cultura stadio intermedio di gravidanza embrioni interi in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia laminazione a 37 ° C 15,16. Embrioni di topo in coltura per 16 a 40 ore in queste condizioni definite esposti progressione in sviluppo morfologico delle strutture corporee e diversi embrionali quali il cuore, arti, cervello e occhi indicando adeguati livelli di proliferazione cellulare, la migrazione, la differenziazione e interazioni tissutali. Analisi molecolare dello sviluppo embrionale nella cultura di uno dei sistemi di organi complessi come l'occhio rivelato lo sviluppo oculare essere coerente con quello osservato nel tessuto oculare in embryos sviluppo in utero (Kalaskar e Lauderdale, in preparazione). Così dimostriamo che gli embrioni di topo coltivate in fase metà della gestazione, mostrano una progressiva crescita e sviluppo morfologico paragonabile a quella osservata negli embrioni di sviluppo in utero.
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Protocol
Cultura embrione di topo:
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con le linee guida del National Institutes of Salute seguente protocollo # A2010 07-119, che è stato esaminato e approvato dalla University of Georgia Institutional Animal Care ed uso commissione, che mantiene costante supervisione regolamentare.
1. Preparazione of Culture Media
- Preparare terreno di coltura utilizzando supporti e integratori di cellule staminali disponibili in commercio nei seguenti importi: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplementare (1x), albumina, da siero bovino (2%), penicillina ( 50 UI / ml), streptomicina (50 mg / ml) e Amfotericina B-(1,25 mg / ml). Il mezzo di coltura preparato è simile a quello precedentemente descritto 15 con le seguenti modifiche: aggiunta di antimicotici e utilizzando due volte la concentrazione di antibiotici (per dettagli di reagenti e attrezzature specifiche, vedere List dei Materiali).
Nota: la concentrazione di antibiotici usati in precedenza (. Moore-Scott, et al 15) era sufficiente per le culture embrioni effettuate fino a 24 ore periodo di tempo. Tuttavia, quando la cultura era continuata oltre 24 ore, abbiamo sperimentato la contaminazione della cultura e questo è stato controllato con successo raddoppiando la concentrazione di antibiotico. - Conservare i componenti Media a 4 ° C oa -20 ° C secondo le raccomandazioni del produttore. KSR e N-2 Supplemento devono essere conservati in aliquote a -20 ° C per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento. KnockOut DMEM una volta aperto deve essere utilizzato entro 30 giorni secondo la raccomandazione del costruttore. Prima dell'uso, riscaldare le parti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Preparare il supporto in condizioni sterili. Disinfettare la superficie di tutte le apparecchiature e le bottiglie contenenti i componenti multimediali con il 70% spruzzo di alcol prima di metterli nel cofano cultura.
- I componenti media possono essere addizionate sia in un becher sterile o direttamente nel sistema di filtro (Corning). Primo aggiungere la polvere di albumina per il ko DMEM. Mescolare accuratamente scuotendo delicatamente fino a quando l'albumina si scioglie completamente. Quindi aggiungere il N-2 Supplement, KSR e gli antibiotici e mescolare accuratamente con una pipetta. Poi filtrare sterilizzare i media usando un filtro dimensione dei pori 0,22 micron con aspirazione a vuoto. Erogare i media in 50 ml provette coniche e conservare a 4 ° C fino all'uso. I media una volta preparati devono essere utilizzati entro 4-5 giorni per la cultura.
2. Preparazione delle attrezzature Cultura
- Sterilizzare le bottiglie di coltura di vetro e tappi di gomma. Avvolgere le bottiglie di coltura in un foglio di alluminio e mettere i tappi delle bottiglie di gomma in un bicchiere di acqua e sterilizzare in autoclave.
- Sterilizzare la camera di coltura (Precision Incubator Unit) con il 70% spruzzo alcol e riscaldare a 37 ° C prima dell'inizio della coltura. La camera di cultura escherzato con un disco di rotolamento al centro che tiene le bottiglie di coltura. Il flusso di gas nella camera è regolata da un manometro e la portata può essere regolata osservando la fuoriuscita di bolle d'aria attraverso l'acqua in un tubo di vetro alla fine. Questo rotolamento apparecchio di coltura bottiglia è una versione modificata dell'apparecchiatura originale introdotte dalla New Cockroft e 17.
- Collegare una bombola di gas contenente una miscela di gas di 95% O 2/5% di CO 2 alla camera di coltura e regolare il flusso di gas a "una bolla d'aria al secondo" che fornisce una portata di 50 cc / min e assicura un adeguato apporto di ossigeno per gli embrioni di cultura.
3. Mouse Embryo Raccolta e preparazione per la Cultura
- Per ottenere wild type embrioni di topo, abbiamo utilizzato topi di C57BL/6J e CD-1 (Charles River Laboratories) ceppi background genetico.
- Controllare i topi femmina per tappi vaginali ogni giorno mattina. Il mezzogiorno del giorno di trovare the spina vaginale dovrebbe essere considerato come E0.5 DPC (giorni dopo il coito).
- Raccogliere embrioni di topo a E10.5 DPC dai eutanasia topi in gravidanza seguenti protocolli standard. I topi sono stati sacrificati mediante un dispositivo di inalazione di CO 2, come specificato dalla American Veterinary Medical Association (AVMA) Linee guida per l'eutanasia degli animali (2013). Per assicurare morte, dislocazione cervicale è stata eseguita dopo esposizione a CO 2.
- Spray etanolo al 70% sulla superficie addominale ventrale per evitare incollaggio di capelli addominale agli strumenti. Quindi aprire la cavità addominale ventrale utilizzando un tagliente-smussato forbici operativi e un paio di 4-3/4 in microdissecting pinze per individuare l'utero. Utilizzando una pinza 4 in microdissecting sollevare l'intero utero e separarlo dal corpo tagliando con una leggera forbici operativi al corpo uterino e alle punte delle corna uterine.
- Sciacquare rapidamente l'intero utero in 1x PBS riscaldato a 37 ° Cper rimuovere qualsiasi incollaggio sangue verso l'utero e collocare immediatamente in DMEM riscaldato a 37 ° C in una piastra di Petri. Sterilizzare gli strumenti del 70% di etanolo spray prima ulteriore utilizzo.
Nota: preriscaldamento soluzioni compresa la PBS, DMEM e mezzo di coltura e mantenendole a 37 ° C durante l'intera procedura è consigliata. - Sotto un microscopio da dissezione, l'utero deve essere segmentalmente sezionato con una leggera forbice operativi. Ciò si traduce in piccole aperture ai lati dell'utero segmentato attraverso la quale una coppia di modificati (estremità smussate) pinzette microdissecting può essere inserito delicatamente per allargare l'apertura. Ciò permette l'esposizione del decidua placentare, che può poi essere rimosso strappando delicatamente con una pinzetta microdissecting per esporre il sacco vitellino parietale (PYS) con membrana della Reichert. Utilizzando un bordo della pinzetta perforare delicatamente la membrana del Reichert insieme ai PYS e separare da the sottostante viscerale sacco vitellino (VYS) strato per esporre gli embrioni con VYS intatti. Il cono ectoplacental ei derivati trophoectoderm possono essere rimossi sia con la decidua placentare o con membrana di Reichert. Si deve prestare attenzione per evitare la rottura del VYS come gli embrioni pop immediatamente.
- Gli embrioni con VYS intatti dovrebbero essere trasferiti in una piastra Petri contenente il terreno di coltura riscaldata a 37 ° C con una pipetta di plastica trasferimento.
Nota: Trasferimento a mezzo di coltura subito dopo la separazione dall'utero aiuta per un migliore sviluppo dell'embrione nella cultura. - Una piccola apertura dovrebbe essere effettuato nel sacco vitellino con un paio di pinzette microdissecting evitando principali vasi sanguigni. Un forte pinzetta può essere usato per fare l'apertura forando delicatamente in una zona adiacente alla regione della testa. In alternativa, due paia di pinzette smussate possono essere utilizzati per tenere il sacco vitellino e delicatamente strappare a fare una piccola apertura.Poi allargare leggermente l'apertura espandendo con la pinzetta a una dimensione appena sufficiente per adattarsi alla testa embrionale. La membrana amniotica che è strettamente avvolgendo l'embrione dovrebbe essere tenuto delicatamente via dal corpo e strappata usando un paio di pinzette. La testa embrionale e poi dell'intera embrione dovrebbero essere esteriorizzato delicatamente dal sacco vitellino mantenendo l'integrità del sistema vascolare embrionale con quello del sacco vitellino 15.
Nota: Eventuali danni alla vascolarizzazione sacco vitellino potenzialmente in grado di influenzare lo sviluppo dell'embrione in coltura. Tali embrioni con vasi danneggiati non devono essere utilizzati per la coltura e possono essere utilizzati per mettere in scena gli embrioni che può essere successivamente scartati. - Criteri di stadiazione embrionali: esaminare gli embrioni sotto il microscopio da dissezione e di gruppo in base a criteri morfologici, tra cui corpo e la dimensione della testa, degli arti e la morfologia degli occhi e stage contando il numero di somite (s) per almeno due embrioni di ogni gruppo.
<strong> Nota: Solitamente embrioni ottenuti dalle stesse differenze lettiera mostra di sviluppo in utero e si differenziano per le dimensioni del corpo, caratteristiche morfologiche e il numero di somiti. Tuttavia, abbiamo scoperto che gli embrioni raggruppati per i nostri criteri morfologici solitamente esposte numero somite simile (± 1). Per questo motivo, non è necessario contare somiti per ogni embrione come questo sarebbe ritardare il tempo per avviare la coltura.
Nota: non utilizzare gli embrioni che sono stati utilizzati per contare i somiti per la cultura. Contare le somiti dopo aver avviato la coltura per altri embrioni per evitare il ritardo nell'iniziare la cultura. Gli embrioni che sono stati ritardati alla cultura dopo la separazione dall'utero di solito mostrano scarso sviluppo. - Trasferire gli embrioni immediatamente ad una piastra di Petri con coltura fresco medio riscaldato a 37 ° C e portarlo alla cappa cultura in cui gli embrioni devono ancora essere trasferiti ad una piastra di Petri sterile con culture supporti prima di metterle in bottiglie di coltura con terreno per iniziare la cultura.
Nota: I trasferimenti multipli media per gli embrioni prima cultura aiuta a prevenire la contaminazione come le diverse fasi di prelievo e dissezione sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione che non è stato installato nella cappa coltura.
Nota: Quando la dimensione della cucciolata è di grandi dimensioni (> 12 embrioni), processo la metà degli embrioni e avvia la cultura o metterli in un piatto con terreno di coltura e collocarlo in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Quando gli embrioni sono stati lasciati fuori per periodi più lunghi (> 35-40 min) abbiamo osservato il battito cardiaco a rallentare e questo influenzerà il successivo sviluppo nella cultura.
4. Coltura di embrioni di topo
- Aprire le bottiglie di coltura in autoclave nel cofano cultura e correttamente li etichetta. Trasferire 3 ml di terreno di coltura riscaldata a 37 ° C per ciascuna di tegli bottiglie e poi gli embrioni di topo devono essere trasferite delicatamente le bottiglie di coltura utilizzando sterili pipette di plastica. Le bottiglie di coltura devono poi essere tappate con i tappi di bottiglia in gomma che aiutano a tenere le bottiglie di coltura per il disco di laminazione nell'apparato cultura.
Nota: Le bottiglie di coltura con i media possono essere preparati e immessi sul disco rotolamento dell'apparato cultura prima eutanasia topi. Questo riduce il tempo di trasferimento di embrioni in bottiglie di coltura.
Nota: embrioni di topo possono essere coltivate singolarmente o come co-colture con due o tre embrioni nella stessa bottiglia cultura. - Le bottiglie di coltura devono essere effettuate asetticamente all'apparecchio coltura a 37 ° C e strettamente agganciarli ai fori sul disco rotolamento con i tappi di gomma. Accendere il disco laminazione a ruotare ad una velocità costante di 35 giri al minuto (rpm), che consente il libero galleggiamento del embryos nei media e aiuta anche in cambio gas libero dal tessuto embrionale. Il gas dal cilindro collegato alla camera di coltura fluisce attraverso il disco di rotolamento e tappi di gomma nelle bottiglie di coltura.
- Cultura gli embrioni per 16-40 ore e controllare regolarmente per il deflusso dei gas e la temperatura camera di coltura.
Nota: la manipolazione degli embrioni Mouse in cultura: Lasciate che gli embrioni vengono adattate alle condizioni di coltura per almeno 30 min. Poi embrioni che eseguono male e mostra il battito cardiaco debole possono essere scartati e le restanti embrioni possono essere utilizzati per ulteriori studi di manipolazione. Manipolazioni Embrione come l'elettroporazione 5,9,16, microiniezioni 18, perlina impianto 16, il trattamento farmacologico e le altre procedure possono essere eseguite in questo momento. Abbiamo eseguito con successo l'impianto di affi-gel agarosio perle trattati con determinate molecole di segnalazione per studiare il loro ruolo nello sviluppo dell'occhio presto. Gli embrioni dopomanipolazioni possono essere restituiti indietro in un mezzo fresco e proseguite nella cultura. - Sostituire i terreni di coltura totalmente con mezzi freschi a intervalli specifici dopo 9-10 ore e 18-19 ore di cultura in cui la cultura è stata continuata per 40 ore.
Nota: Culture sostituzione supporto non può essere richiesta se la cultura viene fermato da 16-18 ore. - Misure di successo nella cultura: la sopravvivenza embrionali in coltura deve essere determinato dal battito cardiaco visibile e la circolazione del sangue nel corpo durante la crescita embrionale nella cultura dovrebbe essere valutata da aumento di dimensioni del corpo, il numero somite e sviluppo morfologico della testa, degli arti, cuore e gli occhi.
- In utero sviluppato embrioni a E11.0 DPC (~ 40-41 s) e E12.0 DPC (~ 49-50 s) dovrebbe essere utilizzato come controllo per il confronto embrioni coltivati per 16-18 ore e 38-40 ore, rispettivamente.
- Lo sviluppo embrionale in diversi momenti durante la cultura e per a tappe utero può essere Captrato sotto dissezione microscopio. Software di imaging spot è stato utilizzato per catturare le immagini e successivamente elaborati utilizzando il software di elaborazione delle immagini.
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Representative Results
Sviluppo di embrioni di topo ex utero dipende da molteplici fattori a partire dal momento in cui l'utero è isolato dal corpo al tempo gli embrioni sono coltivate. Come illustrato nella Figura 1, la procedura prevede una serie di operazioni, in particolare, la separazione di utero gravido dal corpo (Figura 1A), l'isolamento degli embrioni con intatta sacco vitellino (Figura 1B), esteriorizzazione degli embrioni dal sacco vitellino ( Figura 1C) e coltivando gli embrioni in un mezzo privo di siero in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C. Gli embrioni esposti 100% di sopravvivenza quando vengono trasferiti nella cultura dei media subito dopo la separazione dall'utero. In queste condizioni di coltura, embrioni di topo quando in coltura per 16-40 ore esibito crescita e sviluppo morfologico paragonabile a quella osservata negli embrioni stadio equivalenti in via di sviluppoutero (Figura 2).
Gli embrioni a E10.5 (~ 34-35 s) (Figura 2A), quando in coltura per 16-40 ore sopravvissero e avanzati nello sviluppo ben oltre la fase di 35 s. Gli embrioni dopo 16-18 ore di cultura (figure 2D e 3B; Tabella 1) aggiunti circa 5-6 s che presentano un tasso di crescita di un somite ogni due ore e mezzo di cultura ed erano morfologicamente paragonabili a E11.0 (~ 40-41 s) embrioni sviluppati in utero (Figure 2B e 3A). Anche se lo sviluppo è stato ritardato di circa un'ora, questi embrioni in coltura esposti un aumento complessivo della dimensione del corpo e una testa proporzionata con vescicole cerebrali distinte. Gli embrioni hanno anche mostrato lo sviluppo di gemme degli arti, la formazione di un cuore ben camerata e l'aspetto di pigmentazione dell'epitelio pigmentato retinico. Tuttavia, questo tipo di sviluppo è stata osservata in circa il 58% del embRyos coltura mentre il 28% degli embrioni esposto uno sviluppo intermedio (Figura 3C). Questi embrioni successivi hanno mostrato una corporatura più piccola se avevano un simile conteggio somite rispetto agli embrioni in utero sviluppato. Avevano una testa relativamente piccola, anche se le vescicole cerebrali sono state delimitate. Le camere cardiache non erano distinte e le gemme degli arti in alcuni embrioni esposti aree scure alle estremità. All'altra estremità dello spettro, circa il 14% degli embrioni esposto scarso sviluppo nella cultura (Figura 3D). Questi embrioni avevano dimensioni del corpo e la testa più brevi e ha mostrato le aree scure in alcune parti del corpo che indicano alterazioni degenerative. Anche se il cuore mi batteva era malato sviluppato e mancava di differenziazione nelle camere di alcuni embrioni, mentre in altri le arti apparivano buio e ritardo nella crescita.
Gli embrioni hanno continuato in coltura per 38-40 ore (Figura 2E, tabella 1) shdovuto circa 49-50 s ed erano paragonabili a E12.0 embrioni (Figura 2C), sviluppato in utero. Sebbene ritardato di 2-3 ore, questi embrioni in coltura esposte proporzionale aumento delle dimensioni del corpo e mostrato un'adeguata differenziazione organogenesi e tessuti come osservato nello sviluppo della pigmentazione dell'epitelio pigmentato retinico e formazione di un muso ben delimitata nella regione della testa. Anche se alcune parti alle estremità come le gemme degli arti e la coda sembravano essere sotto-sviluppati, gli embrioni sembravano essere in via di sviluppo paragonabile ai utero embrioni in. Tuttavia, questo tipo di sviluppo è stata osservata in solo il 30-40% degli embrioni coltivati (Tabella 1), mentre il resto di loro espone una gamma di progressione evolutiva con aree di crescita ritardata o lo sviluppo in alcune parti del corpo o l' intero embrione.
A parte le differenze di cui sopra in sviluppo, abbiamo osservato un significativo differe SNO nello sviluppo quando gli embrioni sono stati co-coltivate nello stesso flacone di coltura. Rispetto agli altri embrione (Figure 4A e 4A ') in co-coltura, l'embrione ben sviluppato (Figure 4B e 4B') espone migliore crescita in tutti gli aspetti dello sviluppo embrionale. Sono state osservate differenze nella dimensione complessiva del corpo e dimensioni della testa e, talvolta, nel cuore e sviluppo degli arti. Mentre l'embrione ben sviluppato dal co-coltura era morfologicamente comparabile agli embrioni di sviluppo in utero, l'altro embrione in co-coltura è sempre apparso essere meno sviluppati rispetto all'embrione ben sviluppato. Questo tipo di differenze di sviluppo è stata osservata nel 45% dei co-colture (N = 27), mentre il resto dei co-colture (N = 33) ha mostrato sviluppo quasi simile in entrambi gli embrioni in co-coltura.
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Figura 1. Passi in embrione di topo protocollo di cultura. (A) Gravid dell'utero con embrioni isolati dal topo madre. (B) Gli embrioni con intatta sacco vitellino separato dalla decidua dopo la dissezione segmentale dell'utero. (C) Gli embrioni esteriorizzato dal sacco vitellino. (D) Bottiglia di Rolling apparecchio di coltura a 37 ° C e forniti con il 95% O 2/5% di CO 2 per la coltura di embrioni di topo. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
<br /> Figura 2. embrioni nella cultura replicare nello sviluppo utero. Nello sviluppo utero a E10.5 (A), E11.0 (B) e E12.0 (C). Sviluppo in coltura dopo 18 ore (D) e 40 ore (E). Bar Scala in (E) si applica a tutti i pannelli. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sviluppo embrionale nella cultura. Embrione sviluppato in utero a E11.0 DPC (A). Sviluppo in cultura (B, C, D). (B) Rappresentazione del buon sviluppo embrionale nella cultura. Circa il 58% degli embrioni totali coltivate mostre sviluppo comparabile a in utero sviluppato embrioni. (C) Rappresentazione dello sviluppo intermedio nella cultura. Circa il 28% degli embrioni coltura spettacolo sviluppo intermedio. (D) Rappresentazione di scarso sviluppo embrionale nella cultura. Circa il 14% degli embrioni mostrano scarso sviluppo della cultura. Bar Scala in (D) si applica a tutti i pannelli. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Differenze di sviluppo nel topo sistema di co-coltura di embrioni. Embrioni all'inizio della co-coltura (A B). Lo sviluppo embrionale dopo 16 ore di co-coltura (A ', B'). Uno degli embrioni in co-coltura (A ') appare sottodimensionato rispetto alle altre embrione (B'), in co-coltura. Bar Scala in (B ') si applica a tutti i pannelli. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Totale embrioni in coltura per 16-18 ore | Sviluppo dopo Coltura per 16-18 ore | Totale embrioni in coltura per 38-40 ore | Sviluppo dopo Coltura per 38-40 ore | |||
| Buono | Intermedio | Povero | Buono | Povero | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Tabella 1. Sviluppo degli embrioni nel topo sistema di coltura degli embrioni. Embrioni coltivati sia per 16-18 ore e 38-40 ore. Su un totale di 112 embrioni in coltura per 16-18 ore, 65 (58%) embrioni esposti sviluppo comparabile agli embrioni in via di sviluppo in utero, 31 (28%) ha mostrato intermedi e 16 (14%) ha mostrato scarso sviluppo. Su un totale di 12 embrioni in coltura per 39-40 ore, solo 4 (~ 35%) embrioni hanno mostrato un buon sviluppo mentre il restante scarso sviluppo ha mostrato.
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Discussion
Embrioni metà della gestazione topo fase sono state coltivate in un mezzo di coltura privo di siero in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C. Sviluppo embrionale ex utero è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento in cui il utero è isolato dai topi sacrificati al completamento della coltura (Figura 1). Il fattore più importante che influenza lo sviluppo è il tempo necessario per avviare la coltura. Gli altri punti critici durante la procedura che richiedono più cure comprendono le fasi come la separazione degli embrioni con intatta sacco vitellino dall'utero e l'esteriorizzazione degli embrioni dal sacco vitellino. Poiché i roditori hanno placenta discoide, dissezione segmentale dell'utero non danneggiare l'afflusso di sangue l'embrione, anche se la decidua placentare è leggermente danneggiato agli angoli. In realtà questo ha lasciato una piccola apertura a EIther fine, attraverso il quale un paio di pinze smussato può essere inserito a strappare delicatamente aperto l'utero e la decidua placentare consentendo un facile isolamento degli embrioni con intatta sacco vitellino. Tuttavia, il passo successivo dell'esteriorizzazione degli embrioni dal sacco vitellino è fondamentale in quanto eventuali danni ai principali vasi sanguigni nel sacco vitellino potrebbe potenzialmente influenzare lo sviluppo dell'embrione nella cultura. Sviluppo embrionale corretta è stata sostenuta quando gli embrioni sono stati esteriorizzato dal sacco vitellino mantenere l'integrità del sistema vascolare nel sacco vitellino. Precedenti studi hanno indicato l'apertura del sacco vitellino quando embrioni di topo di là stadio embrionale E10 sono stati coltivati 1, 15, 18, 19. Di conseguenza, abbiamo osservato cambiamenti degenerativi e gli embrioni non potrebbero sopravvivere il periodo di coltura in cui gli embrioni sono stati coltivati con E10.5 intatti sacco vitellino. Assumiamo l'esteriorizzazione degli embrioni agevolerebbe efficace nutriente unbsorption attraverso i tessuti mantenendo la continuità vascolare con il sacco vitellino. Questi embrioni in coltura esposte battito cardiaco efficace e la circolazione del sangue nelle parti del corpo embrionali rispetto agli embrioni coltivati senza il sacco vitellino.
Mantenere gli embrioni nel mezzo di coltura riscaldata a 37 ° C fin dal momento in cui sono isolati dall'utero al tempo di coltura fornirebbe immediatamente il miglior ambiente adatto per sostenere la loro capacità di successivo sviluppo nella cultura. Questo impedisce anche la contaminazione dovuta alla presenza di antibiotici nel mezzo ed evita incorporazione dei quantitativi di PBS / DMEM anche minute nella cultura. Il terreno specifico abbiamo utilizzato prodotto sviluppo embrionale superiore rispetto ad altri media stabilite definiti precedentemente descritte in Wawersik et al. 20, 21 (dati non mostrati). La differenza di sviluppo embrionale potrebbe essere dovuto principalmenteai componenti unici nel nostro medium definito come, siero sostituzione KnockOut (KSR) e N-2 Supplement. Mentre N-2 Supplemento è stato mostrato per sostenere la crescita e l'espressione dei neuroni post-mitotici, KSR ha dimostrato di essere una sostituzione diretta per fetale siero bovino 22, 23. KSR è stato utilizzato nelle culture per sostenere la crescita delle cellule staminali pluripotenti indifferenziate così come le cellule staminali embrionali umane e di topo che sono stati mostrati per essere stabile e linea germinale competente 23-25. Oltre al terreno di coltura, la concentrazione di ossigeno nella bottiglia cultura svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale. Gli embrioni non potrebbero sopravvivere alle condizioni del 5% di CO 2 in un incubatore tradizionale. Anche se non abbiamo verificato altre concentrazioni di ossigeno e portate diverse come precedentemente suggerito 5,9, l'uso di 95% O 2/5% di CO 2 a portata costante ha sostenuto la sopravvivenza degli embrioni nella cultura. Mentre rotazionebottiglie cultura è necessaria, embrioni quando coltivate nelle stesse condizioni ma senza alcuna rotazione delle bottiglie coltura comportato non sopravvivenza degli embrioni senza battito cardiaco visibile. Assumiamo che la rotazione costante (35 rpm) in apparecchio di coltura bottiglia rotolamento abilitato libera sospensione degli embrioni a medio e così migliorato l'assorbimento delle sostanze nutritive e ossigeno attraverso i tessuti embrionali. La crescita di questi embrioni nella cultura in termini di corpo e la testa dimensioni complessive, la morfologia, la formazione di un cuore ben camerata-, vescicole cerebrali e dello sviluppo oculare era paragonabile a quella degli embrioni in via di sviluppo in utero. Nelle nostre mani, siamo stati in grado di replicare lo sviluppo embrionale che è stato osservato da Moore-Scott et al 15.
Gli embrioni nella cultura mostravano una gamma di crescita e sviluppo morfologico seconda molteplici fattori (Figura 3, Tabella 1). Sotto la cultura definitacondizioni che abbiamo usato, embrioni coltivati per 16-18 ore hanno mostrato sviluppo paragonabile a quello osservato negli embrioni di sviluppo in utero in circa il 58% degli embrioni, mentre il 28% ha mostrato intermedio e il 14% ha mostrato un scarso sviluppo. Estensione della cultura per 38-40 ore diminuita ulteriormente la capacità di mostrare lo sviluppo comparabile a solo il 30-40% degli embrioni totali coltivate. Oltre ai fattori intrinseci che influenzano potenzialmente embrionale di sviluppo ex utero, molti fattori esterni che possono essere gestiti in qualche misura possono svolgere ruolo fondamentale quando gli embrioni sono coltivati per la lunghezza di tempo prolungato. Uno di questi fattori potenziale che può essere controllato è il tempo impiegato dall'isolamento di embrioni dall'utero all'inizio della cultura. Può essere interpretato che i primi embrioni isolati sono esposti a meno ossigeno nella capsula di Petri rispetto agli embrioni isolato alla fine come tutti gli embrioni vanno nella bottiglia cultura e ricevono 95% O 2/5% di CO 2Allo stesso tempo. Tuttavia l'ossigeno disponibile nel sangue che rimane nella placenta dopo dissezione segmentale non può sostenere per lungo periodo di tempo e per questo motivo la maggior parte delle attrezzature e apparecchio di coltura deve essere impostato pronto per essere utilizzato prima eutanasia il mouse. Noi di solito ottenere gli embrioni nella cultura in 25-30 minuti dal momento in cui il mouse è stato eutanasia. Questo breve periodo di tempo per avviare la coltura non sarebbe possibile se gli embrioni dovessero essere trattati uno alla volta come suggerito in Zeeb, M. et al. 18 Quando gli embrioni sono trattati singolarmente, raggruppamento di embrioni non è possibile e ogni embrione deve essere contato per il numero di somite. Questa procedura richiederà almeno 5-6 minuti per ogni embrione per isolare, esteriorizzarmi dal sacco vitellino, contare somiti e trasferire alla bottiglia cultura. Per una dimensione cucciolata di 10-12 embrioni, che di solito riceviamo dai nostri CD-1 nei topi, l'intero processo avrebbe preso 60-72 minuti per gli ultimi embrioni per entrare nel culture. Questo è abbastanza lungo periodo e abbiamo osservato il battito cardiaco a rallentare e quasi fermarsi quando gli embrioni sono stati esteriorizzato e lasciato in PBS e ritardo alla cultura. Un altro fattore potenziale potrebbe essere la manipolazione o manomissione degli embrioni durante la procedura. Durante la movimentazione, si può indurre un danno accidentale ad una parte del corpo o vasi sanguigni dell'embrione o del sacco vitellino che non viene facilmente rilevato. Questo può influenzare lo sviluppo di quella parte del corpo o talvolta l'intero embrione come è stato osservato che anche un embrione ben sviluppata volte mostra un tipo di sviluppo sotto-alle estremità come le gemme degli arti e la coda indica insufficiente apporto di sangue. E 'meglio scartare tali embrioni che sembrano essere compromessi o danneggiati durante la procedura. L'altro problema generalmente presenti durante la procedura è, alcuni degli embrioni con sacco vitellino intatte prop fuori bruscamente da decidua dopo una dissezione segmentale dell'utero. Ciò a volte si traduce in mori perdita di sangue nel punto di separazione dalla placenta sebbene il sistema vascolare con il sacco vitellino rimane intatto. Questa perdita di sangue può influenzare il successivo sviluppo dell'embrione a causa della minore quantità di sangue trattenuto nel corpo embrionale durante la separazione.
Oltre ai fattori sopra determinate condizioni, come la fase di embrione al momento di iniziare la coltura influenzato lo sviluppo della cultura. Noi con successo in coltura di embrioni metà gestazione del mouse a partire con stadi che spaziavano tra 28-37 s per 16-40 ore e osservate alcune differenze di sviluppo. Embrioni in 34-36 s fase esposti migliore sviluppo nella cultura rispetto alle embrioni a 30-33 s fase indicano un aumento della capacità di adattamento alle condizioni di coltura in embrioni coltivati in fasi successive. L'altro fatto sorprendente che è stata osservata durante la coltura è stato lo sviluppo di embrioni quando sono stati messi in coltura due o più embrioni (Figura 4). Coculture resulted miglioramento significativo nello sviluppo in uno degli embrioni rispetto agli altri embrione nel 45% dei co-colture. Anche se gli embrioni dallo stesso utero sembrano simili morfologicamente e della conta somiti, intrinsecamente presenti due embrioni possono essere allo stesso stadio di sviluppo e questo potrebbe essere una delle ragioni per differenza sviluppo in uno degli embrioni rispetto all'altro in co-coltura sistema.
Così dimostriamo che embrioni di topo stadio intermedio di gravidanza coltivate ex utero in un mezzo privo di siero in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C crescita mostre e sviluppo morfologico paragonabile a quello osservato negli embrioni di sviluppo in utero. Crediamo che questo metodo di mouse di sistema cultura embrione sarà utile per i laboratori che necessitano di utilizzare gli embrioni interi per studiare le interazioni di segnalazione importanti nei primi mesi del organogenesi embrionale.
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Disclosures
Noi non abbiamo interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Julie Gordon e il Dr. Nancy Manley per il loro consiglio utile con la tecnica cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da Glaucoma Fondazione dei Bambini e Sharon-Stewart aniridia Research Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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