Summary
Serum benyttes i embryo kulturer inneholder ukjente komponenter som kan påvirke utfallet av eksperimenter, spesielt i studier som involverer signal interaksjoner. Her har vi benyttet en serum-fri oksygenrikt kultur-systemet og viser at midten av svangerskapet mus embryoer dyrket i 16-40 hr morfologiske utviklingen sammenlignes med embryoer utvikler seg i livmoren.
Abstract
Midt på drektighetsstadiet museembryoer ble dyrket benytte et serum-fritt kulturmedium fremstilt fra kommersielt tilgjengelige stamcellemedie kosttilskudd i en oksygenert valseflaske kultur-system. Muse embryoer ved E10.5 ble nøye isolert fra livmoren med intakt plommesekken og i en prosess som involverer presis kirurgisk manøver embryoene ble forsiktig exteriorized fra plommesekken og samtidig opprettholde den vaskulære kontinuitet av embryoet med plommesekken. Sammenlignet med embryoer tilberedt med intakt plommesekken eller med plommesekken fjernet, disse embryoene utstilt overlegen overlevelse og utviklings progresjon når kultivert under lignende forhold. Vi viser at disse mus embryo, når dyrket i et definert medium i en atmosfære av 95% O2 / 5% CO2 i en valseflaske kultur apparat ved 37 ° C i 16 til 40 timer, oppviser morfologisk vekst og utvikling sammenlignes embryoene utvikler seg i livmoren. Vi tror ther metoden vil være nyttig for etterforskerne trenger for å utnytte hele embryo kultur for å studere signal interaksjoner viktige i embryonale organogenesen.
Introduction
In vitro kultur metoder utnytte hele embryoer er godt egnet til å studere signale mekanismene som er involvert i embryonale organogenesen som ellers er vanskelig tilgjengelig i utero. Hele embryo gi vevet integritet og støtte hensiktsmessig for de vev interaksjoner som er avgjørende for rettidig forekomst av signale mekanismer essensielle for ulike cellulære prosesser under organogenesen. Mens hele embryo kulturer gi en plattform for en mengde applikasjoner som transplantasjonsstudier, genetiske og vev manipulasjoner, perle implantasjon studier, toksikologiske studier, osv.., Som for tiden benyttes embryo kultur-systemer er i hovedsak avhengig serum for riktig vekst og vedlikehold av embryoene i kulturen 1-9.
Serum ble benyttet som en av de viktigste komponentene som strekker seg 10 til 100% av dyrkingsmedier 6-8, 10, 11.; Imidlertid sammensetningen av serumet er ikke godt definert, og kan variere fra dyr til dyr, og hver gang serum oppsamles. Selv om laboratorie-fremstilling av serum er tidkrevende og innebærer strenge prosedyrer, serum fremskaffet kommersielt oppviser betydelig variasjon mellom forskjellige partier og hever eksperimentelle kostnader. Tilsatt til disse, kan serumet inneholde ukjente faktorer slik som vekstfaktorer, hormoner eller andre proteiner, som potensielt kan påvirke utfallet av visse eksperimenter, spesielt de som involverer studiet av signalmolekyler viktige i vev-vekselvirkninger. Studier har vist at tilsetningen av serum til kultur potensielt kan endre de intracellulære nivåer av visse signalmolekyler som syklisk adenosinmonofosfat (cAMP), og proteiner som er involvert i mitogene signalisering og phosphoinositide 3 (PI 3)-kinase signalveier 12-14. I motsetning til dette, gir et serumfritt kultursystem fordelene med antigen fritt miljø,avholdenhet fra biologisk aktive enzymer som kan endre de cellulære prosessene og gjør det mulig konsistens mellom eksperimenter.
I den foreliggende undersøkelse, benyttet vi et serumfritt kulturmedium fremstilt fra kommersielt tilgjengelige stamcelle medietilskudd til kultur midten av svangerskapet trinns hele embryoer i en atmosfære av 95% O2 / 5% CO2 i en valseflaske kultur apparat ved 37 ° C 15,16. Mus embryoer dyrket i 16-40 timer under disse definerte vilkår utstilt progresjon i morfologiske utviklingen av samlede embryonale kropp og forskjellige strukturer som hjerte, lemmer, hjerne og øyne indikerer passende nivåer av celleproliferasjonstest, migrasjon, differensiering og vev interaksjoner. Molekylær analyse av embryoutvikling i kulturen etter en av de komplekse organ-systemer slik som øyet avslørte okulær utvikling for å være i samsvar med det som observeres i okulært vev i embrkastene utvikling i fosterlivet (Kalaskar og Lauderdale, i forberedelse). Dermed viser vi at mus embryoer dyrket på midten av svangerskapet scenen, stille ut progressiv vekst og morfologiske utviklingen sammenlignes med det som er observert i embryoer utvikler seg i livmoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus embryo kultur:
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer følgende protokoll # A2010 07-119, som ble gjennomgått og godkjent av Universitetet i Georgia Institutional Animal Care og bruk komité, som opprettholder fortsatt regulatoriske tilsyn.
En. Utarbeidelse av Kultur Media
- Forbered kulturmedium ved hjelp av kommersielt tilgjengelige stamcelle media og kosttilskudd i følgende beløp: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplement (1x), albumin, fra Bovine Serum (2%), Penicillin ( 50 IE / ml), streptomycin (50 pg / ml) og Amphotericin-B (1,25 ug / ml). Det kulturmedium fremstilt er lik den som tidligere er beskrevet 15 med de følgende forandringer: tilsetning av anti-mycotics og ved hjelp av det dobbelte av konsentrasjonen av antibiotika (for detaljer om bestemte reagenser og utstyr, se List of Materials).
Merk: Antibiotikum konsentrasjon som tidligere ble brukt (. Moore-Scott, et al 15) var tilstrekkelig for embryokulturer gjennomført opp til 24 timers periode. Imidlertid, når kulturen ble fortsatt utover 24 timer, opplevde vi kontaminering av kulturen, og dette ble med hell kontrolleres ved å doble den antibiotiske konsentrasjon. - Oppbevar mediekomponenter ved 4 ° C eller ved -20 ° C i henhold til produsentens anbefalinger. KSR og N-2-tillegg bør lagres i alikvoter ved -20 ° C for å unngå gjentatt frysing og tining. KnockOut DMEM gang åpnet bør benyttes innen 30 dager i henhold til produsentens anbefaling. Før bruk oppvarmes komponentene i et vannbad til 37 ° C.
- Forbered mediene under sterile forhold. Desinfiser overflaten av alt utstyr og flasker med innhold av mediekomponenter med 70% alkohol spray før du legger dem i panseret kultur.
- Den mediekomponenter kan blandes enten i et sterilt begerglass eller direkte inn i filtersystemet (Corning). Først legge til albumin pulver til KnockOut DMEM. Bland grundig ved forsiktig risting til albumin helt i oppløsning. Deretter legger N-2 Supplement, KSR og antibiotika og bland grundig med en pipette. Deretter filtrere sterilisere medier med en 0,22 mikrometer porestørrelse filter med vakumsug. Tilsett medier i 50 ml koniske rør og oppbevar ved 4 ° C til det brukes. Mediene gang utarbeidet bør brukes innen 4-5 dager for kultur.
2. Utarbeidelse av Kultur Utstyr
- Sterilisere glass kulturflasker og korker gummi. Pakk kulturflasker i en aluminiumsfolie og legg de korker gummi flaske i et vann beger og sterilisere ved autoklavering.
- Sterilisere kultur kammeret (Precision Inkubator Unit) med 70% alkohol spray og varm til 37 ° C før du starter kultur. Kulturen kammeret er evitset med en rullende plate i sentrum som holder kulturflasker. Gass-strøm-inn i kammeret blir regulert av en trykkmåler, og strømningshastigheten kan reguleres ved å observere den strøm av luftbobler gjennom vann i et glassrør på slutten. Dette rulle flaske kultur apparat er en modifisert versjon av den opprinnelige apparat introdusert av New og Cockroft 17.
- Koble en gassflaske som inneholder en gassblanding av 95% O2 / 5% CO2 til kulturen kammeret og å justere gasstilførselen til "en luftboble per sekund", som gir en strømningshastighet på 50 ml / min, og sikrer tilstrekkelig oksygenforsyning til kulturen embryoer.
Tre. Mouse Embryo Collection og klargjøring for kultur
- For å få villtype mus embryoer, vi utnyttet mus av C57BL/6J og CD-en (Charles River Laboratories) genetisk bakgrunn stammer.
- Kontroller hunnmus for vaginal plugger hver dag morgen. Den formiddagen på dagen for å finne the vaginal plug bør betraktes som E0.5 DPC (dager etter samleie).
- Samle mus embryoer ved E10.5 DPC ved euthanizing gravide mus etter standard protokoller. Mus ble avlivet ved hjelp av en CO 2 inhalator som angitt av American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for Avliving av dyr (2013). For å sikre død, ble halshugging utføres etter eksponering for CO 2.
- Spray 70% etanol på den ventrale abdominal overflate for å unngå klebing av abdominal hår til instrumentene. Deretter åpner bukhulen ventrally med en skarp-stump drifts saks og et par av 4-3/4 i microdissecting tang for å finne livmoren. Ved hjelp av en 4 i microdissecting tang løfte hele livmoren og skille det fra kroppen ved å kutte med en lys drifts saks på livmorkroppen, og på tuppen av livmor horn.
- Raskt skylle hele livmoren i 1x PBS varmet til 37 ° Cfor å fjerne en hvilken som helst blod klebing til livmoren og straks sette i DMEM oppvarmet til 37 ° C i en petriskål. Sterilisere instrumentene med 70% etanol spray før videre bruk.
Merk: Forvarming oppløsningene inklusive PBS, DMEM, og kulturmediet og å opprettholde dem ved 37 ° C under hele fremgangsmåten anbefales. - Under et disseksjonsmikroskop, bør livmoren være segmentally dissekert med en lys som opererer saks. Dette resulterer i små åpninger på hver side av den segmenterte uterus gjennom hvilken et par av modifiserte (avstumpet endene) microdissecting pinsett kan lett settes inn for å utvide åpningen. Dette tillater eksponering av placental decidua, som deretter kan fjernes ved å rive forsiktig med et par microdissecting pinsett for å eksponere parietal plommesekken (PYS) med Reichert membran. Ved hjelp av den ene kanten av pinsett forsiktig pierce Reichert membran sammen med PYS og atskilt fra the underliggende visceral plommesekken (VYS) lag å avsløre embryoene med intakte VYS. Den ectoplacental kjegle og trophoectoderm derivater kan fjernes enten med placental decidua eller med Reichert membran. Hensyn må tas for å unngå brudd på VYS som embryoene sprette ut umiddelbart.
- Embryoene med intakte VYS bør da bli overført til en petriskål inneholdende dyrkingsmedium oppvarmet til 37 ° C ved hjelp av en plast overføringspipetten.
Merk: Overføring til kultur medium umiddelbart etter separasjon fra livmoren bidrar til bedre utvikling av embryo i kultur. - En liten åpning bør gjøres i plommesekken med et par microdissecting pinsett unngå store blodkar. En skarp pinsett kan brukes for å gjøre åpningen ved forsiktig piercing i et område som grenser til hoderegionen. Alternativt kan to par butte pinsett kan brukes til å holde plommesekken og forsiktig rive å foreta en liten åpning.Deretter forsiktig utvide åpningen ved å utvide med pinsett til en størrelse akkurat nok til å passe den embryonale hodet. Den foster membran som er tett innpakning embryoet bør være forsiktig holdt bort fra kroppen og revet ved hjelp av en pinsett. Den embryoniske hode og senere hele embryoet bør være forsiktig exteriorized fra plommesekken og samtidig opprettholde integriteten til den embryoniske blodkar med det av plommesekken 15..
Merk: Eventuelle skader på plommesekken blodkar kan potensielt påvirke utviklingen av embryoet i kulturen. Slike embryoer med skadet blodkar skal ikke benyttes til kulturen, og kan brukes for staging embryoene som senere kan kasseres. - Embryonale staging kriterier: Undersøk embryoene under dissekere mikroskop og gruppen av morfologiske kriterier, inkludert kropp og hode størrelse, lem og øye morfologi og scene ved å telle antall somitt (er) for minst to embryoer fra hver gruppe.
<strong> Merk: Vanligvis embryoer hentet fra samme kull viser forskjeller i utviklingen i utero og ulik kroppsstørrelse, morfologiske funksjoner og antall somites. Imidlertid fant vi at embryoer gruppert etter våre morfologiske kriterier som regel utstilt lignende somitt nummer (± 1). Av denne grunn er det ikke nødvendig å telle somites for hvert embryo som dette ville forsinke tidspunktet for start av kulturen.
Merk: Du må ikke bruke embryoene som ble brukt til å telle somites for kultur. Telle somites etter start av kulturen for andre embryoer for å unngå den tidsforsinkelse som begynner i kulturen. Embryoene som ble forsinket til kultur etter separasjon fra livmoren vanligvis utviser dårlig utvikling. - Overfør embryoene umiddelbart til en petriskål med fersk kultur medium varmet til 37 ° C og ta det med til kultur panseret der embryoene skal igjen overføres til en petriskål med sterile kulturelte media før du setter dem inn i kulturflasker med medium for å starte kultur.
Merk: De mange medie overføringer for embryoene før kultur bidrar til å hindre forurensning som de ulike trinnene i embryo innsamling og disseksjon ble utført under et dissekere mikroskop som ikke ble installert i panseret kultur.
Merk: Når kullstørrelse er stor (> 12 befruktede egg), prosess halvparten av befruktede egg og starte kultur eller sette dem i en skål med kultur medium og legg den i en CO 2 inkubator ved 37 ° C. Når embryoene ble forlatt utenfor i lengre perioder (> 35-40 min) observerte vi hjerterytme å bremse ned og dette vil påvirke den senere utviklingen i kulturen.
4. Dyrking mus embryoer
- Åpne autoklaveres kulturflasker i panseret kultur og riktig merke dem. Overfør 3 ml kulturmedium oppvarmet til 37 ° C til hver av than flasker og deretter muse embryo bør overføres forsiktig inn i kulturflasker ved hjelp av sterile plast overføringspipetter. De kulturflasker bør da bli avkortet med gummi flaske korker som bidrar til å holde kulturflasker til den rullende plate i kulturen apparat.
Merk: De kulturflasker med media kan bli fremstilt og plassert på valse plate av kulturen anordningen før euthanizing musene. Dette forkorter tiden for overføring av embryoer inn i kulturflasker.
Merk: Muse embryoer kan dyrkes enkeltvis eller som cocultures med to eller tre befruktede egg i den samme kulturen flaske. - De kulturflasker skal utføres aseptisk til kulturapparat ved 37 ° C og tett feste dem til hullene på valseplate med gummikorker. Slå på valseplaten til å rotere med en konstant hastighet på 35 omdreininger per minutt (rpm), som muliggjør fri flotasjon av embrkastene i media og også bidrar i fri gassutveksling av embryonale vev. Gassen fra sylinderen koblet til kulturen kammeret strømmer gjennom den rullende platen og korker gummi inn i kulturflasker.
- Kultur embryoene for 16-40 hr og jevnlig sjekk for gassutstrømningen og kultur kammertemperatur.
Merk: Mus embryo manipulasjon i kultur: La embryoene bli tilpasset forholdene kultur i minst 30 min. Deretter embryoer som utfører dårlig og som viser svake hjerteslag kan kasseres og de gjenværende embryoene kan bli benyttet for videre manipulasjon studier. Embryo manipulasjoner som elektroporering 5,9,16, microinjections 18, perle implantasjon 16, medikamentell behandling og andre prosedyrer kan utføres på dette tidspunktet. Vi har med hell utført implantasjon av Affi-gel-agaroseperler ble behandlet med visse signalmolekyler for å studere deres rolle tidlig i utviklingen øyet. Embryoene ettermanipulasjoner kan returneres tilbake i et friskt medium og fortsatte i kultur. - Bytt kultur media helt med ferske media på bestemte intervaller etter 9-10 timer og 18-19 timer av kultur når kulturen ble fortsatt i 40 timer.
Merk: Kultur media erstatning kan ikke kreves dersom kulturen er stoppet av 16-18 timer. - Tiltak for å lykkes i kultur: Embryonale overlevelse i kultur bør bestemmes av synlig hjerterytme og blodsirkulasjonen i kroppen mens embryonale vekst i kultur bør vurderes av økning i kroppsstørrelse, somitt nummer og morfologiske utviklingen av hode, armer og ben, hjerte og øyne.
- In utero utviklet embryoer ved E11.0 DPC (~ 40-41 s) og E12.0 DPC (~ 49-50 s) bør brukes som kontroller for å sammenligne embryoer dyrket i 16-18 timer og 38-40 timer, henholdsvis.
- Embryoutvikling ved ulike tidspunkt i løpet av kultur og for in utero stadier kan captfigurert i henhold dissekere mikroskop. Spot bildebehandlingsprogrammer ble brukt til å ta bildene og senere behandlet ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvikling av mus embryo ex utero avhenger av flere faktorer som starter fra det tidspunkt livmoren er isolert fra kroppen til den tid embryoene dyrkes. Som vist i figur 1, omfatter fremgangsmåten en serie trinn, inkludert, separering av gravid uterus fra kroppen (figur 1A), isolering av embryoene med intakt plommesekken (figur 1B), exteriorization av embryoene fra plommesekken ( Figur 1C), og dyrking av embryoene i et serum-fritt medium i en atmosfære av 95% O2 / 5% CO2 i en valseflaske kultur apparat ved 37 ° C. Embryoer utstilt 100% overlevelse når overført til kultur media umiddelbart etter separasjonen fra livmoren. Under disse kulturforhold, mus embryoer når dyrket i 16-40 hr utstilt vekst og morfologiske utviklingen sammenlignes med det som er observert i tilsvarende scene embryoer utvikler seg iutero (figur 2).
Embryoer ved E10.5 (~ 34-35 s) (Figur 2A) når dyrket i 16-40 hr levde og avanserte i utvikling langt utover det stadiet av 35 s. Embryoene etter 16-18 timer i kultur (Tall 2D og 3B, Tabell 1) lagt ca 5-6 s viser en vekst på én somitt for hver to og en halv time i kultur og var morfologisk sammenlignes med E11.0 (~ 40-41 s) embryo utviklet seg i livmoren (Tall 2B og 3A). Selv om utbyggingen ble forsinket med om lag en time, disse embryoene i kultur utstilt en generell økning i kroppsstørrelse og en forholdsmessig hodet med forskjellige hjerne blemmer. Embryoene viste også utvikle lem knopper, dannelsen av et godt kammer hjerte og utseende av pigmentering i retinal pigmentert epitel. Imidlertid ble en slik utvikling observert hos ca 58% av embryos dyrket mens 28% av embryoene utstilt en mellomliggende utvikling (Figur 3C). Disse senere embryoer viste en mindre kroppsstørrelse selv om de hadde en lignende somitt telle i forhold til de in utero utviklet embryoer. De hadde en relativt mindre hode, selv om hjernen vesikler ble avgrenset. De hjertekamrene var ikke distinkt og lem knopper i noen embryoer utstilt mørke områder på ekstremiteter. I den andre enden av spekteret, ca 14% av embryoene oppviste dårlig utvikling i kultur (figur 3D). Disse embryoene hadde kortere kropp og hodestørrelser og viste mørke områder i enkelte deler av kroppen som indikerer degenerative forandringer. Selv om hjerte slo det var syk utviklet og manglet differensiering inn i kammer i noen embryo, mens i andre lemmer dukket mørkt og tilbakestående i vekst.
Embryoer fortsatte i kultur for 38-40 timer (Figur 2E, Tabell 1) shskyldte ca 49-50 s og var sammenlign E12.0 embryoer (figur 2C) utviklet i utero. Selv om forsinket med 2-3 t, disse embryoene i kulturen viste forholdsmessige økning i kroppsstørrelse og viste hensiktsmessig organogenese og vev differensiering som observert i utviklingen av pigmentering i retinalt pigment-epitel, og dannelse av en godt avgrenset snute i hoderegionen. Selv om enkelte deler på ekstremiteter som lem knopper og halen så ut til å være underutviklet, embryoene ut til å utvikle sammenlignbare med de i utero embryoer. Imidlertid var denne type utvikling observert i kun 30-40% av embryoene dyrkes (tabell 1), mens resten av dem viste en rekke utviklings progresjon med områder av retardert vekst eller under-utvikling i enkelte deler av kroppen eller Hele embryo.
Bortsett fra de ovennevnte forskjeller i utvikling, observerte vi en betydelig differe NCE i utviklingen når embryoene ble cocultured i samme kultur flaske. Sammenlignet med andre embryo (Tall 4A og 4A ') i coculture, velutviklet embryo (Tall 4B og 4B') viste bedre vekst i alle aspekter av den embryoutvikling. Store forskjeller ble observert i den totale kroppsstørrelse og hode størrelse og noen ganger i hjertet og lemmer utvikling. Mens velutviklet embryo fra coculture var morfologisk sammenlignes med embryoene utvikler seg i livmoren, har den andre embryo i coculture alltid syntes å være mindre utviklet i forhold til den velutviklede embryo. En slik forskjell i utvikling ble observert hos 45% av de cocultures (N = 27), mens resten av de cocultures (N = 33) viste nesten lik utvikling både embryoene i coculture.
e en "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
Figur 1. Steps i mus embryo kultur protokollen. (A) Gravid livmor med embryoer isolert fra moren mus. (B) embryoer med intakt plommesekken skilt fra decidua etter segmental disseksjon av livmoren. (C) Embryoet exteriorized fra plommesekken. (D) Rolling flaske kultur apparat ved 37 ° C og leveres med 95% O 2/5% CO 2 for dyrking museembryoer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<br /> Figur 2. embryo i kultur gjenskape i utero utviklingen. In utero utviklingen på E10.5 (A), E11.0 (B) og E12.0 (C). Utvikling i kultur etter 18 timer (D), og 40 t (E). Scale bar i (E) gjelder for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Embryonale utvikling i kultur. Embryo utviklet i utero på E11.0 DPC (A). Utvikling i kultur (B, C, D). (B) Representasjon av god embryoutvikling i kultur. Om 58% av totalt antall embryoer dyrket utstillings sammenlignbar utvikling til i utero utviklet embryoer. (C) Representasjon av mellomprodukt utvikling i kultur. Om 28% av embryoer dyrket showet middels utvikling. (D) Representasjon av dårlig embryoutvikling i kultur. Om lag 14% embryo viser dårlig utvikling i kultur. Scale bar i (D) gjelder for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Utviklings forskjeller i mus embryo coculture system. Embryo ved starten av coculture (A B). Embryoutvikling etter 16 timer av coculture (A ', B'). En av embryoene i coculture (A ') vises under størrelse i forhold til den andre embryo (B') i coculture. Scale bar i (B ') gjelder for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Totalt antall embryoer dyrket i 16-18 timer | Utvikling etter Dyrking for 16-18 hr | Totalt antall embryoer dyrket i 38-40 timer | Utvikling etter Dyrking for 38-40 hr | |||
| God | Intermediate | Dårlig | God | Dårlig | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4 | 8 |
Tabell 1. Utvikling av embryo i mus embryo kultur system. Embryoet dyrket i enten 16-18 timer eller 38-40 timer. Av totalt 112 embryoer dyrket i 16-18 timer, 65 (58%) embryoer utstilt sammenlignbar utvikling til embryoer utvikler seg i livmoren, 31 (28%) viste middels og 16 (14%) viste dårlig utvikling. Av de totalt 12 embryoer dyrket i 39-40 timer, bare 4 (~ 35%) embryoer viste god utvikling, mens de resterende viste dårlig utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Midt på drektighetsstadiet museembryoer ble dyrket i et serum-fritt vekstmedium i en atmosfære av 95% O2 / 5% CO2 i en valseflaske kultur apparat ved 37 ° C. Embryo utvikling ex utero var kritisk avhengig av flere faktorer ved hvert trinn under prosedyren fra tidspunktet livmoren er isolert fra de avlives musene til gjennomføring av kulturen (figur 1). Den viktigste faktoren som påvirket utviklingen var den tid det tar å starte-kultur. De andre kritiske punkter under prosedyren som krever mest omsorg omfatter trinnene som separasjon av embryoer med intakt plommesekken fra livmor og exteriorization av embryoene fra plommesekken. Som gnagere har discoid placenta, ble segmental disseksjon av livmoren ikke skader blodtilførselen til embryoet selv om placental decidua er litt skadet ved hjørnene. Faktisk er dette igjen en liten åpning på either ende der et par av sløv tang kan settes inn for å forsiktig rive åpen livmor og placenta decidua muliggjør enkel isolering av embryoene med intakt plommesekken. Men, er neste trinn i exteriorization av embryoene fra plommesekken kritisk i at enhver skade på de store blodårene i plommesekken ville potensielt påvirke utviklingen av embryoet i kulturen. Riktig embryoutvikling ble støttet da embryoene ble exteriorized fra plommesekken opprettholde intactness av blodkar i plommesekken. Tidligere studier har indikert at åpningen av plommesekken når mus embryoer utover fosterstadiet E10 ble dyrket 1, 15, 18, 19. Følgelig, observerte vi degenerative forandringer og embryoene kunne ikke overleve kulturen perioden da E10.5 embryoer ble dyrket med intakt plommesekken. Vi antar at exteriorization av embryoene ville lette effektive næringsstoff enbsorption gjennom vev og samtidig opprettholde kontinuiteten i blodkar med plommesekken. Disse embryoene i kultur utstilt effektiv hjerterytme og blodsirkulasjonen i de embryonale kroppsdeler i forhold til embryoene dyrket uten plommesekken.
Opprettholdelse embryoene i dyrkningsmediet oppvarmet til 37 ° C helt fra det tidspunktet de blir isolert fra uterus til tidspunktet for kulturen umiddelbart ville gi best egnet miljø for å opprettholde deres evne for senere utvikling i kultur. Dette forhindrer også forurensning som skyldes nærvær av antibiotika i mediet og forhindrer inkorporering av selv små mengder av PBS / DMEM i kulturen. Det definerte medium vi har benyttet ga overlegne embryoutvikling, sammenlignet med andre etablerte definerte medier som tidligere er beskrevet i Wawersik et al. 20., 21 (data ikke vist). Forskjellen i embryoutvikling kan hovedsakelig skyldestil de unike komponentene i vår definert medium som, KnockOut Serum Replacement (KSR) og N-2 Supplement. Mens N-2-tillegg ble vist å understøtte vekst og ekspresjon av post-mitotiske neuroner, ble KSR vist seg å være en direkte erstatning for føtalt bovint serum 22, 23. KSR ble brukt i kulturer for å støtte veksten av udifferensierte pluripotente stamceller, samt mennesker og mus embryonale stamceller som ble vist seg å være stabil og germline kompetent 23-25. Bortsett fra dyrkningsmediet, oksygenkonsentrasjonen i flasken kultur spiller en kritisk rolle i fosterutviklingen. Befruktede egg ikke kunne overleve forholdene i 5% CO2 i en konvensjonell inkubator. Selv om vi ikke har testet andre oksygenkonsentrasjoner og forskjellige strømningshastigheter som tidligere antydet 5,9, har bruken av 95% O2 / 5% CO2 ved konstant strømningshastighet opprettholdes overlevelsesevnen av embryoene i kulturen. Mens rotasjonskulturflasker er det nødvendig, når embryoer dyrket under de samme betingelser, men uten noen rotasjon av kulturflasker ført nonsurvival av embryoene med ingen synlig hjerteslag. Vi antar at konstant rotasjon (35 rpm) i valseflaske kultur apparat aktivert fri suspensjon av embryoene i mediet, og i tillegg forbedret absorpsjon av næringsstoffer og oksygen gjennom den embryoniske vev. Veksten av disse embryoene i kulturen i form av generelle kropp og hode størrelse, morfologi, dannelsen av et godt kammer hjerte, hjerne vesikler og utvikling av synet var sammenlignbar med embryoer utvikler seg i livmoren. I våre hender, var vi i stand til å gjenskape den embryoutvikling som ble observert av Moore-Scott et al. 15
Embryoene i kultur oppviste en rekke vekst-og morfologiske utvikling avhengig av flere faktorer (figur 3, tabell 1). Under den definerte kulturforholdene vi brukte, embryoer dyrket i 16-18 hr viste sammenlignbar utvikling til det som er observert i embryoer utvikler seg i livmoren i ca 58% av befruktede egg, mens 28% viste middels og 14% viste en dårlig utvikling. Utvidelse av kulturen til 38 til 40 timers ytterligere redusert evne til å vise tilsvar utvikling til bare 30 til 40% av de totale embryoer dyrket. Bortsett fra de åpenbare faktorer som potensielt påvirker fosterutviklingen ex utero, kan mange eksterne faktorer som kan administreres til en viss grad spille avgjørende rolle når embryoene er dyrket i over lengre tid. En slik mulig faktor som kan styres er den tid det tar fra isoleringen av embryoer fra uterus til starten av kulturen. Det kan forstås at de første isolerte embryoene blir utsatt for mindre oksygen i dyrkningsskål i forhold til embryoene isolert ved enden som alle embryoene går inn i flaskekultur, og mottar 95% O2 / 5% CO2på samme tid. Men det oksygen som er tilgjengelig i blodet som er igjen i placenta etter segmental disseksjon støtter ikke for lengre tid, og av denne grunn har de fleste av kulturen utstyr og anordninger bør være satt opp klar til bruk før euthanizing musen. Vi pleier å få embryoene i kulturen i 25-30 min fra den gang musa ble avlivet. Denne korte tidsperiode for å starte kulturen ikke ville være mulig hvis embryoer skulle behandles en av gangen som antydet i Se'eb, M. et al. 18. Når embryoer er behandlet hver for seg, er gruppering av embryoer ikke er mulig, og hvert embryo bør telles for somitt nummer. Denne prosedyren vil ta minst 5-6 min for hver embryo å isolere, eksteriorisere fra plommesekken, telle somites og overføre til flasken kultur. For en kullstørrelse på 10-12 embryo, som vi vanligvis får fra våre CD-en mus, ville hele prosessen tar 60-72 min for de siste embryoene å komme inn på culture. Dette er ganske lang periode, og vi observerte hjerteslag å bremse ned og nesten stoppe når embryoene ble exteriorized og venstre i PBS og forsinket til kultur. En annen mulig faktor kan være håndteringen eller mishandling av embryoene under prosedyren. Under håndtering, kan du fremkalle en utilsiktet skade på noen del av kroppen eller blodårer i embryo eller plommesekken som ikke lett oppdages. Dette kan påvirke utviklingen av den del av legemet, eller av og til hele embryoet som det ble observert at selv en velutviklet embryo noen ganger viser en form for under-utvikling ved ytterpunktene som lem knopper og halen som indikerer utilstrekkelig blodtilførsel. Det er bedre å forkaste slike embryoer som synes å bli svekket eller skadet under inngrepet. Det andre problem som vanligvis påtreffes under prosedyren var noen av embryoene med intakte plommesekken prop seg brått fra decidua ved segmental disseksjon av livmoren. Dette noen ganger resulterer i more blodtapet ved separasjonspunktet fra placenta selv blodkar med plommesekken forblir intakt. Denne blodtap kan påvirke den senere utvikling av embryoet på grunn av mindre mengder blod beholdes i embryonale legeme under separasjonen.
Bortsett fra de ovennevnte faktorer visse forhold som, stadium av embryo ved tidspunktet for start av kulturen påvirket utviklingen i kulturen. Vi vellykket kultur midten av svangerskapet mus embryoer starter med etapper som varierte mellom 28-37 s for 16-40 hr og observert noen forskjeller i utviklingen. Embryoer ved 34-36 s stadium utstilt bedre utvikling i kulturen i forhold til embryoene på 30-33 s stadium som indikerer en økning i tilpasning til kultur vilkår i embryoer dyrket på senere stadier. Den andre overraskende faktum som ble observert i løpet av kulturen var utviklingen av embryo når to eller flere embryoer ble cocultured (figur 4). Coculture resulted i en betydelig forbedring i utviklingen av en av embryoene i forhold til den andre embryo i 45% av cocultures. Skjønt embryoene fra samme uterus ligne morfologisk og i somitt count, iboende ikke to embryoer kan være på samme utviklingstrinn, og dette kan være en av grunnene for utviklingsmessig forskjell i ett av embryoene i forhold til den andre i coculture system.
Således viser vi at mellomtrinn drektighet mus embryoer dyrket ex utero i et serumfritt medium i en atmosfære av 95% O2 / 5% CO2 i en valseflaske kultur apparat ved 37 ° C utstillings vekst og morfologisk utvikling sammenlignes som ble observert hos fostre utvikler seg i livmoren. Vi tror denne metoden for mus embryo kultur systemet vil være nyttig for laboratorier som trenger å utnytte hele embryoer å studere signal interaksjoner viktige i tidlig embryo organogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ikke noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke dr. Julie Gordon og Dr. Nancy Manley for deres nyttige råd med kulturen teknikk. Dette arbeidet har vært støttet av Barnas Glaukom Foundation og Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
