Summary
Serum i embryokulturer indeholder ukendte komponenter, der kan påvirke resultatet af eksperimenter især i undersøgelser med signalering interaktioner. Her udnyttede vi en serum-frit iltet kultur system, og vise, at midten af drægtigheden museembryoer dyrket for 16-40 hr udviser morfologiske udvikling sammenlignes med embryoner udvikler sig i livmoderen.
Abstract
Midten af drægtigheden fase musefostre blev dyrket udnytte et serumfrit dyrkningsmedium fremstillet ud fra kommercielt tilgængelige stamcelle medier kosttilskud i en oxygeneret rullende flaske dyrkningssystem. Museembryoer på E10.5 blev omhyggeligt isoleret fra livmoderen med intakt blommesæk og i en proces, der involverer præcis kirurgisk manøvre embryonerne blev forsigtigt eksterioriseret fra blommesækken og samtidig opretholde det vaskulære kontinuitet i foster med blommesækken. Sammenlignet med embryoner tilberedt med intakt blommesæk eller med blommesækken fjernet disse embryoner udstillet overlegen overlevelsesrate og udviklingsmæssige progression når de dyrkes under lignende forhold. Vi viser, at disse musefostre, når de dyrkes i et defineret medium i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C i 16-40 timer, udviser morfologiske vækst og udvikling kan sammenlignes med embryoner udvikler sig i livmoderen. Vi tror ther metode vil være nyttig for efterforskerne har brug for at udnytte hele embryo kultur for at studere signalsystemer interaktioner vigtige i embryonale organogenesis.
Introduction
In vitro-dyrkningsmetoder udnytter hele embryoner er velegnede til at studere signalering mekanismer involveret i embryonale organogenesis, som ellers er svært tilgængelige i livmoderen. Hele embryoner giver vævet integritet og støtte passende for væv interaktioner, der er afgørende for rettidig forekomst af signalering mekanismer væsentlige for forskellige cellulære processer under organogenesen. Mens hele embryokulturer skabe en platform for et væld af applikationer såsom transplantationscentre undersøgelser, genetiske og væv manipulationer, perle implantationsforsøg, toksikologiske undersøgelser osv., Som i øjeblikket anvendes embryo kultur systemer er primært afhængig af serum for korrekt vækst og vedligeholdelse af embryonerne i kulturen 1-9.
Serum er blevet udnyttet som en af de vigtigste komponenter, der spænder fra 10-100% af dyrkningsmediet 6-8, 10, 11.; Imidlertid sammensætningen af serum er ikke veldefineret og kan variere fra dyr til dyr, og hver gang serummet opsamles. Mens udarbejdelse af serum laboratorium er tidskrævende og indebærer strenge procedurer, serum indkøbt kommercielt udviser betydelig variation mellem forskellige partier og rejser eksperimentelle omkostninger. Tilføjet til disse, kan serummet indeholde ukendte faktorer såsom vækstfaktorer, hormoner eller andre proteiner, som potentielt kan påvirke resultatet af visse eksperimenter, især dem, der involverer undersøgelse af signalmolekyler er vigtige i vævsinteraktioner. Undersøgelser har vist, at tilsætning af serum til kulturen kan potentielt ændre de intracellulære niveauer af visse signalmolekyler, såsom cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) og proteiner involveret i mitogenisk signalering og phosphoinositid 3 (PI 3)-kinase signalveje 12-14. I modsætning til disse, et serumfrit dyrkningssystem tilvejebringer fordelene antigen frit miljø,afholdenhed fra biologisk aktive enzymer, som kan ændre de cellulære processer og giver sammenhæng mellem eksperimenter.
I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt et serumfrit dyrkningsmedium fremstillet ud fra kommercielt tilgængelige stamcelle medier kosttilskud til kultur midten af drægtigheden stage hele embryoner i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C 15,16. Museembryoer dyrket for 16-40 timer under disse definerede betingelser udstillet progression i morfologiske udvikling af overordnede embryonale krop og forskellige strukturer såsom hjerte, lemmer, hjerne og øjne med angivelse af passende niveauer af cellulær proliferation, migration, differentiering og væv interaktioner. Molekylær analyse af den embryonale udvikling i kulturen for en af de komplekse organsystemer såsom øjet afslørede okulær udvikling at være i overensstemmelse med den observeret i øjenvæv i embryos udvikler sig i livmoderen (Kalaskar og Lauderdale, under udarbejdelse). Således viser vi, at museembryoer dyrkes ved midten af drægtigheden scene, udviser progressiv vækst og morfologiske udvikling sammenlignes med observeret i fostre udvikler sig i livmoderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus embryo kultur:
Alle eksperimentelle procedurer blev udført i nøje overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer følgende protokol # A2010 07-119, som blev gennemgået og godkendt af University of Georgia Institutional Animal Care og brug Udvalg, som opretholder fortsat tilsyn.
1.. Udarbejdelse af Kultur Medier
- Forbered dyrkningsmedium anvendelse af kommercielt tilgængelige stamceller medier og kosttilskud i følgende beløb: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Udskiftning (KSR) (10%), N-2 Supplement (1x), albumin, fra bovint serum (2%), penicillin ( 50 IE / ml), streptomycin (50 ug / ml) og amphotericin-B (1,25 ug / ml). Dyrkningsmediet fremstillet svarer til den tidligere beskrevne 15 med følgende ændringer: tilsætning af anti-mycotics og ved hjælp af det dobbelte af koncentrationen af antibiotika (for detaljer om specifikke reagenser og udstyr, se List of Materials).
Bemærk: Antibiotika koncentration som tidligere har brugt (. Moore-Scott m.fl. 15) var tilstrækkeligt for embryokulturer båret op til 24 timers periode. Men når kultur blev fortsættes ud over 24 timer, oplevede forurening af kultur, vi og dette blev bekæmpet med held ved at fordoble antibiotika koncentration. - Opbevar medier komponenter ved 4 ° C eller ved -20 ° C ifølge producentens anbefalinger. KSR og N-2 Supplement bør opbevares i portioner ved -20 ° C for at undgå gentagen nedfrysning og optøning. KnockOut DMEM engang åbnet bør udnyttes inden for 30 dage som pr fabrikantens anbefaling. Før brug opvarme komponenter i et vandbad til 37 ° C.
- Forbered medier under sterile forhold. Desinficer overfladen af alt udstyr og flasker, der indeholder de medier komponenter med 70% alkohol spray, før du lægger dem i kultur hætte.
- De medier komponenter kan blandes enten i et sterilt bægerglas eller direkte i filtersystemet (Corning). Først tilføje albumin pulver til knockout-DMEM. Bland grundigt ved forsigtigt at ryste, indtil albumin helt opløst. Derefter tilsættes de N-2 Supplement, KSR og antibiotika, og bland grundigt ved hjælp af en pipette. Derefter foretage steriliseres mediet ved anvendelse af en 0,22 um porestørrelse med vakuumsugning. Doser mediet i 50 ml koniske rør og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. Medierne engang forberedt skal bruges inden for 4-5 dage for kultur.
2. Udarbejdelse af Kultur Udstyr
- Sterilisere kultur flasker og gummi propper glas. Wrap kultur flasker i en aluminiumsfolie og placere gummi propper i en vand bægerglas og steriliseres ved autoklavering.
- Steriliser kultur kammer (Precision Incubator Unit) med 70% alkohol spray og varme til 37 ° C, inden kulturen. Kulturen kammer esarkastisk med et rullende skive i midten som holder kultur flasker. Gasstrømmen ind i kammeret er reguleret af en trykmåler, og strømningshastigheden kan indstilles ved at observere udstrømning af luftbobler gennem vand i et glasrør i slutningen. Det rullende flaske apparat kultur er en modificeret version af den oprindelige apparat indført ved Ny og Cockroft 17..
- Tilslut en gasflaske indeholdende en gasblanding af 95% O2 / 5% CO 2 til kulturen kammeret og justere gasstrømmen til "et luftboble per sekund", hvilket giver en strømningshastighed på 50 cc / min, og som sikrer en tilstrækkelig oxygentilførsel Kultur-embryoner.
3. Mouse Embryo og forberedelse for Kultur
- For at opnå vildtypemusen embryoner, vi udnyttet mus af C57BL/6J og CD-1 (Charles River Laboratories) genetisk baggrund stammer.
- Kontroller hunmus for vaginale propper hver dag morgen. Middagstid på dagen for at finde the vaginalprop bør betragtes som E0.5 DPC (dage efter coitus).
- Saml museembryoer på E10.5 DPC ved euthanizing de gravide mus efter standardprotokoller. Mus blev aflivet ved hjælp af en CO 2-inhalation som specificeret af American Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for aflivning af dyr (2013). For at sikre død blev cervikal dislokation udført efter udsættelse for CO 2.
- Spray 70% ethanol på den ventrale abdominale overflade for at undgå klæbning af abdominal hår til instrumenterne. Derefter åbne bughulen ventralt ved hjælp af en-stump skarp drifts saks og et par af 4-3/4 i microdissecting pincet til at lokalisere livmoderen. Ved hjælp af en 4 i microdissecting pincet løfte hele livmoderen og adskille den fra kroppen ved at skære med en lys drifts saks på livmoder kroppen og på spidserne af Uterushornene.
- Skylles hurtigt hele livmoderen i 1x PBS opvarmet til 37 ° Cat fjerne noget blod stikning af uterus og placer omgående i DMEM opvarmet til 37 ° C i en petriskål. Sterilisere instrumenter med 70% ethanol spray før yderligere brug.
Bemærk: Det anbefales Forvarmning de løsninger, herunder PBS DMEM og dyrkningsmediet og vedligeholde dem ved 37 ° C under hele proceduren. - Under et dissektionsmikroskop bør uterus segmentarisk dissekeret med et lys, der saks. Dette resulterer i små åbninger på begge sider af den segmenterede livmoderen, hvorigennem et par af modificerede (stumpe ender) microdissecting pincet kan forsigtigt indsat for at udvide åbningen. Dette tillader, at eksponeringen af placenta decidua, som derefter kan fjernes ved forsigtigt at rive med et par microdissecting pincet til at udsætte den parietale blommesæk (PYS) med Reichert membran. Ved at bruge en kant af pincet forsigtigt gennembore Reichert membran sammen med PYS og adskilt fra the underliggende visceral blommesæk (VYS) lag for at afsløre de embryoner med intakte VYS. Den ectoplacental kegle og trophoectoderm derivater kan fjernes enten med placenta decidua eller med Reichert membran. Der skal udvises omhu for at undgå brud på VYS da embryonerne pop ud med det samme.
- Embryonerne med intakte VYS skal derefter overføres til en petriskål indeholdende dyrkningsmediet opvarmet til 37 ° C under anvendelse af en plast overførselspipette.
Bemærk: Overførsel til dyrkningsmedium umiddelbart efter adskillelsen fra livmoderen hjælper til bedre udvikling af embryo i kultur. - En lille åbning bør foretages i blommesækken med et par microdissecting pincet undgå store blodkar. En skarp pincet kan anvendes til at gøre åbningen ved forsigtigt piercing i et område, der støder op til hovedet regionen. Alternativt kan to par stumpe pincet kan anvendes til at holde blommesækken og forsigtigt rive at gøre en lille åbning.Derefter forsigtigt udvide åbningen ved at udvide med en pincet til en størrelse lige nok til at passe den embryonale hoved. Fosterhinden som er tæt indpakning embryo skal forsigtigt holdes væk fra kroppen og revet ved hjælp af en pincet. Den embryoniske hoved og senere hele æg må forsigtigt blotlagt fra blommesækken og samtidig bevare integriteten af det embryoniske vaskulatur med den blommesækken 15.
Bemærk: Enhver skade på blommesækken vasculature potentielt kan påvirke udviklingen af embryo i kultur. Sådanne embryoner med beskadiget vasculature bør ikke anvendes til kultur og kan bruges til at iscenesætte embryoner, der senere kan blive kasseret. - Embryonale mellemstationer kriterier: Undersøg embryoner under dissektionsmikroskop og gruppe ved morfologiske kriterier, herunder krop og hoved størrelse, lemmer og øjne morfologi og scene ved at tælle antallet af somite (r) i mindst to embryoner fra hver gruppe.
<strong> Bemærk: Normalt embryoner fra samme kuld vise forskelle i udviklingen i utero og adskiller sig i kroppens størrelse, morfologiske træk og antallet af somitter. Vi fandt imidlertid, at embryoner grupperet efter vores morfologiske kriterier normalt udstillet lignende somite nummer (± 1). Af denne grund er det ikke nødvendigt at tælle somitter for hvert embryo, da dette ville forsinke tid til at starte kulturen.
Bemærk: Du må ikke bruge embryoner, der blev brugt til at tælle somitter for kultur. Tæl somitter efter start af kulturen for andre embryoner for at undgå forsinkelse i at starte kulturen. De embryoner, der blev forsinket til kultur efter separation fra livmoderen normalt udviser dårlig udvikling. - Overfør embryoner straks til en petriskål med frisk dyrkningsmedium opvarmet til 37 ° C, og tage det til kulturen hætte hvor embryonerne skal igen overføres til en petriskål med sterilt kultue medier før du lægger dem i kultur flasker de med medium til at starte kulturen.
Bemærk: De mange medier overførsler for embryoner før kulturen hjælper med at forebygge forurening som de forskellige trin i indsamling og dissektion foster blev udført under et dissektionsmikroskop der ikke blev installeret i kulturen hætte.
Bemærk: Når kuldstørrelsen er stor (> 12 embryoner), proces halvdelen af embryonerne og start kultur eller sætte dem i et fad med dyrkningsmedium og placere den i en CO 2 inkubator ved 37 ° C. Når embryoer blev efterladt uden for i længere perioder (> 35-40 min) observerede vi hjerteslag til at bremse ned, og dette vil påvirke den senere udvikling i kulturen.
4.. Dyrkning musefostre
- Åbn autoklaveres kultur flasker i kulturen hætte og ordentligt mærke dem. Overfør 3 ml dyrkningsmedium opvarmet til 37 ° C til hver af than flasker og derefter museembryoer skal overføres forsigtigt ind i kulturen flasker ved hjælp af sterile plastik overførselspipetter. De kultur-flasker skal derefter udjævnet med gummi propper, som hjælper til at holde den kultur flasker til den rullende disk i kultur-apparatet.
Bemærk: Kultur-flasker med medierne kan være forberedt og placeret på rullende skive kultur apparatet før euthanizing mus. Dette forkorter den tid, til overførsel af embryoner i kultur flasker.
Bemærk: Mouse embryoner kan dyrkes individuelt eller som cokulturer med to eller tre æg i den samme kultur flaske. - De kultur-flasker skal aseptisk transporteres til kultur apparatet ved 37 ° C og stramt tilslutte dem til hullerne på rullende disk med gummi propper. Tænd rullende disk til at rotere med en konstant hastighed på 35 omdrejninger per minut (rpm), som giver den frie flydeevne af embryos i medierne og hjælper også i fri gas udveksling af embryonale væv. Gassen fra cylinderen er forbundet til kulturen kammeret strømmer gennem rullende disken og gummi propper i kultur flasker.
- Kultur embryoner til 16-40 timer og regelmæssigt at kontrollere for gas udstrømningen og kultur kammer temperatur.
Bemærk: Mus embryo manipulation i kultur: Lad embryoner bliver tilpasset de dyrkningsbetingelser i mindst 30 minutter. Derefter embryoner, der udfører dårligt og viser svage hjerteslag kan kasseres, og de resterende embryoner kan udnyttes til yderligere manipulation studier. Embryo manipulationer såsom elektroporation 5,9,16, microinjections 18, perle implantation 16, behandling og andre procedurer kan udføres på dette tidspunkt. Vi har med held foretaget implantation af Affi-gel agarosekugler behandlet med visse signalmolekyler at studere deres rolle i udviklingen tidligt øje. De embryoner eftermanipulationer kan returneres tilbage i en frisk medium og fortsatte i kultur. - Udskift dyrkningsmedier helt med friske medier med bestemte intervaller efter 9-10 timer og 18-19 hr af kultur, når kulturen blev fortsat i 40 timer.
Bemærk: kan ikke kræves Kultur medier udskiftning, hvis kulturen stoppet af 16-18 timer. - Foranstaltninger for succes i kultur: Embryonale overlevelse i kultur bør bestemmes af synligt hjerteslag og blodcirkulationen i kroppen, mens embryonale vækst i kultur bør vurderes af stigning i kroppens størrelse, somite nummer og morfologiske udvikling af hoved, lemmer, hjerte og øjne.
- In Utero udviklede embryoner ved E11.0 DPC (~ 40-41 s) og E12.0 DPC (~ 49-50 s) bør anvendes som kontrol til sammenligning embryoner dyrket i 16-18 timer og 38-40 timer, hhv.
- Embryonale udvikling på forskellige tidspunkter i løbet af kultur og for In Utero etaper kan captmålt under dissektionsmikroskop. Spot imaging software blev anvendt til at fange billeder og senere behandles ved hjælp af billedbehandling software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvikling af museembryoer ex utero afhænger af flere faktorer startende fra det tidspunkt, hvor livmoderen er isoleret fra kroppen til det tidspunkt, hvor embryonerne dyrkes. Som afbildet i figur 1, den procedure indebærer en række trin, herunder adskillelse af gravide uterus fra kroppen (figur 1A), isolering af embryonerne med intakt blommesæk (figur 1B) eksteriorisering af embryonerne fra blommesækken ( Figur 1C), og dyrkning af embryoner i et serum-frit medium i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C. Embryoner udviste 100% overlevelse, når de overføres til dyrkningsmediet umiddelbart efter adskillelse fra livmoderen. Under disse dyrkningsbetingelser museembryoer når dyrket i 16-40 hr udstillet vækst og morfologiske udvikling sammenlignes med observeret i embryoer tilsvarende udviklingslande ilivmoderen (Figur 2).
Embryoner på E10.5 (~ 34-35 s) (figur 2A), når de dyrkes for 16-40 hr overlevede og avancerede i udvikling langt ud over den fase af 35 sek. De embryoner efter 16-18 hr i kultur (figur 2D og 3B, tabel 1) tilføjet omkring 5-6 s udviser en vækst på én somite for hver to og en halv time i kultur og var morfologisk sammenlignes med E11.0 (~ 40-41 s) embryoner udviklet i livmoderen (figur 2B og 3A). Selvom udviklingen blev forsinket med omkring en time, disse embryoner i kultur udviste en samlet stigning i kroppens størrelse og en forholdsmæssig hoved med forskellige hjerne blærer. De embryoner viste også udvikle Lemanlæggene, dannelsen af et godt hjerte kamre og udseende pigmentering i retina pigmenterede epitel. Men denne form for udvikling observeret i omkring 58% af EMBryos dyrket mens 28% af embryonerne udviste en mellemliggende udvikling (figur 3C). Disse senere embryoner viste en mindre kropsstørrelse selvom de havde en lignende somite tæller i forhold til de i livmoderen udviklede embryoner. De havde en relativt mindre hoved, selv om hjernen vesikler blev fastlagt. Hjertekamre ikke var adskilte, og lemmer knopper i nogle fostre udstillet mørke områder på ekstremiteterne. I den anden ende af spektret, omkring 14% af embryoerne udviste ringe udvikling i kultur (figur 3D). Disse embryoner havde kortere krop og hoved størrelser og viste mørke områder i visse dele af kroppen, der angiver degenerative forandringer. Selvom hjerte bankede det var syg udviklet og manglede differentiering i kamre i nogle embryoner mens det i andre lemmerne optrådte mørke og retarderet vækst.
Embryoner fortsatte i kultur i 38-40 time (Figur 2E Tabel 1) shskyldte omkring 49-50 s og var sammenlignelige med E12.0 embryoer (figur 2C) udvikles i livmoderen. Selvom forsinket med 2-3 timer, disse embryoner i kultur udstillet forholdsmæssig stigning i kroppens størrelse og viste passende organogenese og vævsdifferentiering som observeret i udviklingen af pigmentering i retina pigmenterede epitel og dannelsen af en velafgrænset snude i hovedet regionen. Selvom nogle dele på ekstremiteterne ligesom Lemanlæggene og hale syntes at være underudviklet, embryonerne syntes at være at udvikle sammenlignelige med i livmoderen embryoner. Men denne form for udvikling observeret i kun 30-40% af embryonerne dyrket (tabel 1), mens resten af dem udstillet en række udviklingsmæssige progression med områder af forsinket vækst eller under udvikling i nogle dele af kroppen eller hele foster.
Bortset fra de ovenstående forskelle i udvikling, observerede vi en markant Forskel nce i udvikling, når embryonerne er codyrket i den samme kultur flasken. Sammenlignet med de andre embryo (4A og 4A) i cokultur, veludviklede embryo (figur 4B og 4B) udviste en bedre vækst i alle aspekter af den embryonale udvikling. Større forskelle blev observeret i den samlede kropsstørrelse og hoved størrelse og nogle gange i hjertet og lemmer udvikling. Mens veludviklet foster fra cokultur var morfologisk sammenlignes med embryoner udvikler sig i livmoderen, har den anden foster i cokultur altid syntes at være mindre udviklet sammenlignet med den veludviklede foster. Denne form for forskel i udvikling blev observeret i 45% af co-kulturerne (N = 27), mens resten af cokulturer (N = 33) viste næsten ens udvikling i både embryonerne i cokultur.
e 1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50803/50803fig1.jpg "/>
Figur 1.. Trin i museembryo kultur-protokollen. (A) Gravid uterus med embryoner isoleret fra moderen musen. (B) Embryoner med intakt blommesæk adskilt fra decidua efter segmental dissektion af livmoderen. (C) Embryoner blotlagt fra blommesækken. (D) Rolling flaske kultur apparat ved 37 ° C og leveres med 95% O 2/5% CO 2 til dyrkning museembryoer. Klik her for at se en større version af dette tal.
<br /> Figur 2. Fostre i kultur formere sig i livmoderen udvikling. In Utero udvikling på E10.5 (A), E11.0 (B) og E12.0 (C). Udvikling i kultur efter 18 timer (D) og 40 t (E). Målestokken i (E) gælder for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Embryonale udvikling i kultur. Embryo udviklet i livmoderen ved E11.0 DPC (A). Udvikling i kultur (B, C, D). (B) Repræsentation af god embryonale udvikling i kultur. Omkring 58% af den samlede embryoner dyrket udviser sammenlignelig udvikling til In Utero udviklede embryoner. (C) Repræsentation af mellemliggende udvikling i kultur. 28% af embryoner dyrkes show mellemliggende udvikling. (D) Repræsentation af dårlig embryonale udvikling i kultur. Ca. 14% embryoner viser dårlig udvikling i kultur. Målestokken i (D) gælder for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Udviklingsmæssige forskelle i museembryo cokultur system. Embryoner i starten af cokultur (A B). Fosterudviklingen efter 16 timer af cokultur (A ', B'). En af embryoner i cokultur (A ') vises under-størrelse i forhold til den anden embryo (B) i cokultur. Målestokken i (B ') gælder for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Total embryoner dyrket i 16-18 timer | Udvikling efter dyrkning i 16-18 hr | Total embryoner dyrket i 38-40 timer | Udvikling efter dyrkning i 38-40 hr | |||
| Godt | Intermediate | Dårlig | Godt | Dårlig | ||
| 112 | 65 | 31 | 16 | 12 | 4. | 8. |
Tabel 1. Udvikling af embryoner i museembryo dyrkningssystem. Embryoer dyrket i enten 16-18 timer eller 38-40 timer. Af de samlede 112 embryoner dyrket i 16-18 timer, 65 (58%) embryoner udstillet sammenlignelig udvikling til fostre udvikler sig i livmoderen, 31 (28%) viste mellemliggende og 16 (14%) viste dårlig udvikling. Af de samlede 12 embryoner dyrket i 39-40 timer, kun 4 (~ 35%) fostre viste en god udvikling, mens de resterende udviste ringe udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Midten af drægtigheden fase musefostre blev dyrket i et serumfrit dyrkningsmedium i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C. Embryo udvikling ex utero var kritisk afhængig af flere faktorer på hvert trin under proceduren fra det tidspunkt, hvor livmoderen er isoleret fra aflivet mus til færdiggørelsen af kultur (figur 1). Den vigtigste faktor, der påvirkede udviklingen var den tid, det tager at starte kulturen. De andre kritiske punkter under proceduren, der kræver mest pleje omfatter skridt såsom adskillelse af embryoner med intakt blommesæk fra livmoderen og eksteriorisering af embryonerne fra blommesækken. Som gnavere har discoid placenta havde segmental dissektion af livmoderen ikke skade blodforsyningen til fosteret, selv om placenta decidua let beskadiges ved hjørnerne. I virkeligheden er dette efterlod en lille åbning på either ende, hvorigennem et par stumpe pincet kan indsættes forsigtigt oprive livmoderen og placenta decidua muliggør let isolering af embryoer med intakt blommesækken. Men det næste trin eksteriorisering af embryonerne fra blommesækken er kritisk, at enhver skade på de store blodkar i blommesækken potentielt påvirke udviklingen af embryo i kulturen. Korrekt fosterudvikling blev støttet, når embryoner blev blotlagt fra blommesækken opretholde intakthed af vaskulaturen i blommesækken. Tidligere undersøgelser har indikeret åbningen af blommesækken når museembryoer ud fosterstadiet E10 blev dyrket 1, 15, 18, 19. Derfor vi observeret degenerative forandringer og embryoner ikke kunne overleve kultur periode, hvor E10.5 embryoer blev dyrket med intakt blommesæk. Vi antager eksteriorisering af embryonerne vil lette effektiv næringsstof absorption gennem væv og samtidig bevare kontinuiteten i karrene med blommesækken. Disse embryoner i kultur udstillet effektiv hjerterytme og blodcirkulationen i embryonale kropsdele i forhold til de embryoner dyrket uden blommesækken.
Vedligeholdelse af embryoner i dyrkningsmediet opvarmet til 37 ° C lige fra det tidspunkt, de er isoleret fra livmoderen til tidspunktet for kultur vil straks give den bedst passende miljø til at opretholde deres evne til senere udvikling i kulturen. Dette forhindrer også forurening som følge af tilstedeværelsen af antibiotika i mediet, og man undgår indarbejdelse af selv små mængder af PBS / DMEM i kulturen. Det definerede medium har vi udnyttet gav overlegen embryonale udvikling sammenlignet med andre etablerede definerede medier beskrevet tidligere i Wawersik et al. 20, 21 (data ikke vist). Forskellen i fosterudviklingen kan primært skyldestil de unikke komponenter i vores defineret medium såsom KnockOut Serum udskiftning (KSR) og N-2 Supplement. Mens N-2 Supplement blev vist til at understøtte væksten og udtryk af post-mitotiske neuroner blev KSR vist sig at være en direkte erstatning for oksefosterserum 22, 23. KSR blev anvendt i kulturer til at understøtte væksten af udifferentierede pluripotente stamceller samt menneske-og muse embryonale stamceller, der blev vist sig at være stabilt og kønscelleoverførsel kompetent 23-25. Bortset fra dyrkningsmediet, oxygenkoncentrationen i kulturen flasken spiller en kritisk rolle i embryonisk udvikling. Embryoner kan ikke overleve betingelserne i 5% CO2 i en konventionel inkubator. Selvom vi ikke har testet andre oxygenkoncentrationer og forskellige strømningshastigheder, som tidligere foreslået 5,9, er anvendelsen af 95% O2 / 5% CO2 ved konstant strømningshastighed opretholdt overlevelsesevne embryoner i kulturen. Mens rotation afkultur flasker er nødvendig, embryoner når dyrket under de samme betingelser, men uden rotation af Kultur flasker resulterede i nonsurvival af embryonerne uden synlig hjerteslag. Vi antager, at konstant rotation (35 rpm) i den rullende flaske apparat kultur aktiveret fri suspension af embryonerne i mediet og såvel forbedret absorption af næringsstoffer og ilt gennem embryonale væv. Væksten i disse embryoner i kultur i form af den samlede krop og hoved størrelse, morfologi, dannelsen af en vel-kamre hjerte, hjerne blærer og okulær udvikling var sammenlignelig med embryoner udvikler sig i livmoderen. I vores hænder, var vi i stand til at replikere den embryonale udvikling, som blev observeret af Moore-Scott et al. 15.
Embryonerne i kulturen udviste en række vækst og morfologiske udvikling afhængigt af flere faktorer (figur 3, tabel 1). Under defineret kulturbetingelser, vi anvendte, embryoner dyrket for 16-18 hr viste sammenlignelig udvikling, der blev observeret i fostre udvikler sig i livmoderen hos ca 58% af fostre, mens 28% viste mellemliggende og 14% viste en dårlig udvikling. Udvidelse af kultur til 38-40 timer faldt yderligere evnen til at vise tilsvarende udvikling til kun 30-40% af de samlede dyrkede embryoner. Bortset fra de iboende faktorer, der potentielt kan påvirke fosterudviklingen ex utero, kan mange eksterne faktorer, der kan styres til en vis grad at spille en kritisk rolle, når embryonerne dyrkes i længere tid. En sådan potentiel faktor, der kan styres, er den tid, fra isolering af embryoner fra uterus til starten af kulturen. Det kan tolkes, at de første isolerede embryoner er udsat for mindre oxygen i dyrkningsskålen sammenlignet med embryoner isoleret ved udgangen som alle de embryoner gå ind i kultur flaske og modtager 95% O2 / 5% CO 2på samme tid. Men ilt til rådighed i blodet, der er tilbage i moderkagen efter segmentær dissektion understøtter muligvis ikke i længere tid, og af denne grund er de fleste af kulturen udstyr og apparater bør oprettes klar til at blive brugt før euthanizing musen. Vi får normalt embryoner i kulturen i 25-30 min fra det tidspunkt, hvor mus blev aflivet. Denne korte periode til at starte kulturen ikke ville være muligt, hvis embryoer, der skal behandles en ad gangen, som foreslået i Zeeb, M. et al. 18. Når embryoner behandles individuelt, gruppering af embryoner er ikke mulig, og hvert embryo bør være talt for somite nummer. Denne procedure vil tage mindst 5-6 minutter for hver foster at isolere, eksteriorisere fra blommesækken, tælle somitter og overføre til kulturen flaske. For en kuldstørrelse på 10-12 fostre, som vi normalt får fra vores cd-1 mus, vil hele processen tage 60-72 min for de sidste par embryoner at komme ind i cULTUR. Dette er temmelig lang periode, og vi observerede hjerteslag til at bremse ned og næsten stoppe, når embryoner blev blotlagt og efterladt i PBS og forsinket til kultur. En anden potentiel faktor kan være håndtering eller forkert behandling af embryonerne under proceduren. Under håndtering, kan du fremkalde en utilsigtet skade på nogen del af kroppen eller blodkar i embryo eller blommesækken, der ikke er let opdages. Dette kan påvirke udviklingen af denne del af kroppen eller undertiden hele foster, som det blev observeret, at selv en veludviklet foster undertiden viser en form for underudvikling i yderpunkterne ligesom Lemanlæggene og hale indikerer utilstrækkelig blodforsyning. Det er bedre at kassere sådanne embryoner, der synes at være kompromitteret eller beskadiget under proceduren. Det andet problem normalt optræder under proceduren var, nogle af embryoner med intakte blommesæk prop ud brat fra decidua ved segmentær dissektion af livmoderen. Dette resulterer undertiden i more blodtab på adskillelsen punkt fra placenta selv vaskulaturen med blommesækken forbliver intakt. Denne blodtab kan påvirke den senere udvikling af embryoet på grund af mindre mængde blod tilbageholdes i embryonale kroppen under adskillelse.
Bortset fra de ovennævnte faktorer visse betingelser som, den fase af embryo på tidspunktet for start af kulturen påvirket udviklingen i kulturen. Vi har med held dyrkede midten af drægtigheden museembryoer startende med trin, der lå mellem 28-37 s for 16-40 timer og observeret nogle forskelle i udviklingen. Embryoner på 34-36 s stadie udstillet bedre udvikling i kulturen i forhold til de embryoner på 30-33 s fase indikerer en stigning i tilpasningsevne til dyrkningsbetingelser i embryoner dyrket på et senere tidspunkt. Den anden overraskende kendsgerning, som blev observeret under kultur var udviklingen af embryoner, når to eller flere fostre blev dyrket sammen (Figur 4). Cokultur resulted i signifikant forbedring i udviklingen i en af de embryoner sammenlignet med de øvrige foster i 45% af cokulturer. Selvom embryoner fra samme livmoderen ligner morfologisk og i somite tæller, i sagens natur ikke to fostre kan være på samme udviklingstrin, og dette kunne være en af grundene til udviklingsmæssige forskel i en af de embryoner i forhold til den anden i cokultur system.
Således viser vi, at midten af drægtigheden fase musefostre dyrket ex utero i et serum-frit medium i en atmosfære af 95% O2 / 5% CO2 i en rullende flaske apparat kultur ved 37 ° C udviser vækst og morfologiske udvikling sammenlignes der er observeret i fostre udvikler sig i livmoderen. Vi mener, at denne metode til museembryo kultur system vil være nyttigt for laboratorier har behov for at udnytte hele embryoner til at studere signalsystemer interaktioner vigtige i den tidlige embryonale organogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ikke nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Julie Gordon og Dr. Nancy Manley for deres nyttige råd med kulturen teknik. Dette arbejde er blevet støttet af Børnenes Glaukom Foundation og Sharon-Stewart aniridi Research Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic - Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10,000 IU/ml); Streptomycin (10,000 µg/ml; Amphotericin (250 µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube, 50 ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Microdissecting Forceps, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Microdissecting Forceps - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Microdissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Microdissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified - Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22 µm Cellulose Acetate)-150 ml | Corning | 431153 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Filter System (0.22 µm Cellulose Acetate)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25 ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette - 7.7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
