Summary
Um biossensor ótico sem rótulo para detecção de bactérias rápidas é introduzido. O biossensor é baseado num nanoestruturada de Si poroso, que se destina a captar directamente as células de bactérias alvo na sua superfície. Usamos os anticorpos monoclonais imobilizados, para o transdutor poroso, como as sondas de captura. Os nossos estudos demonstram a aplicabilidade destes biosensores para a detecção de concentrações baixas de bactérias dentro de minutos, sem processamento prévio da amostra (tal como a lise das células).
Abstract
Um biossensor óptico livre de rótulo com base em uma nanoestruturada Si poroso foi concebido para a captura rápida e detecção de bactérias de Escherichia coli K12, tal como um modelo de microorganismo. O biossensor se baseia em ligação directa das células das bactérias alvo na sua superfície, enquanto que nenhum pré-tratamento (por exemplo, através de lise celular), da amostra em estudo é necessário. Uma película fina mesoporoso Si é utilizada como o elemento de transdutor óptico do biossensor. Sob iluminação com luz branca, a camada porosa mostra bem resolvidas padrões de franjas de Fabry-Perot em seu espectro de reflectividade. Aplicando uma transformação rápida de Fourier (FFT) para reflectividade resultados dados em um único pico. As alterações na intensidade do pico da FFT são monitorados. Assim, as bactérias alvo capturar sobre a superfície do biossensor, através de interacções anticorpo-antigénio, induz alterações mensuráveis na intensidade dos picos de FFT, que permitem uma observação "tempo real" de fixação das bactérias.
nt "> O filme mesoporoso Si, fabricado por um processo de anodização electroquímica, é conjugado com anticorpos monoclonais, específicos para as bactérias alvo. A imobilização, imunoactividade e especificidade dos anticorpos são confirmadas por experiências de marcação fluorescentes. Assim que o biossensor é exposta ao bactérias alvo, as células são directamente capturado na superfície de Si poroso com a modificação de anticorpos. Estes eventos de captura específicas resultar em alterações de intensidade na película fina do espectro de interferência óptica do biossensor. Nós demonstramos que estes biossensores podem detectar concentrações relativamente baixas de bactérias (detecção limite de 10 4 células / mL) em menos de uma hora.Introduction
Precoce e preciso de identificação de bactérias patogênicas é extremamente importante para a segurança alimentar e água, monitoramento ambiental, e de ponto-de-cuidados diagnósticos 1. Como técnicas de microbiologia tradicionais são demorados, trabalhoso, e não têm a capacidade de detectar microorganismos em "tempo real" ou fora do ambiente de laboratório, biossensores estão evoluindo para enfrentar esses desafios 2-5.
Nos últimos anos, o Si poroso (psi) tem emergido como uma plataforma promissora para o desenho de sensores e biossensores 6-20. Na última década, vários estudos sobre sensores e biossensores ópticos baseados em psi foram publicados 21,22. A camada nanoestruturado PSi normalmente é fabricado por ataque anódico eletroquímica de um único cristal de Si wafer. Os nanomateriais PSI resultantes exibem muitas características vantajosas, como grande superfície e volume livre, pore tamanhos que podem ser controlados e sintonizável optipropriedades cal 10,16. As propriedades ópticas da camada PSi, como fotoluminescência 8,11 e luz branca à base de reflectância interferometria 7,19, são fortemente influenciados pelas condições ambientais. Captura de hóspedes analitos moléculas / alvo dentro da camada porosa em resultados de uma mudança no índice de refracção médio do filme, observada como uma modulação em espectro de fotoluminescência, ou como um desvio de comprimento de onda no espectro de reflectividade 10.
Embora a grande inovação em tecnologia de biosensor óptico PSi, só há poucos relatos sobre plataformas baseadas em PSI para bactérias detecção 6,8,20,23-29. Além disso, a maioria desses estudos de prova de conceito demonstraram "indireta" de detecção de bactérias. Assim, em geral, antes de lise das células é necessário para extrair os fragmentos de proteína / ADN-alvo, característicos para as bactérias estudadas 29. Nossa abordagem é captar diretamente a bactéria alvocélulas para o biossensor psi. Portanto, os anticorpos monoclonais, que são específicos para alvejar as bactérias, são imobilizadas sobre a superfície porosa. A ligação de células de bactérias, através de interacções anticorpo-antigénio, para a superfície do biossensor induzir alterações na amplitude (intensidade) do espectro de reflectividade 24-26.
Neste trabalho, relatamos a construção de um biossensor à base de PSi óptica e demonstrar a sua aplicação como uma plataforma biosensing livre-label para a detecção de Escherichia coli (E. coli) bactérias K12 (usado como um modelo de microorganismos). The monitorados sinal óptica é a luz reflectida a partir da nanoestrutura PSi devido Fabry-Perot de interferência de película fina (Figura 1A). As alterações na amplitude de luz / intensidade são correlacionados para imobilização específica das células de bactérias alvo para a superfície do biossensor, permitindo a rápida detecção e quantificação das bactérias.
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Protocol
1. Preparação de Oxidado poroso SiO2
- Bolachas de Si (Etch único lado polido sobre o <100> rosto e fortemente dopado tipo p, 0,0008 Ω · cm) de uma solução 3:1 (v / v) de HF aquoso e de etanol absoluto durante 30 segundos a uma corrente constante densidade de 385 mA / cm 2. Por favor, note que a IC é um líquido altamente corrosivo e deve ser manuseado com cuidado extremo.
- Lavar a superfície do Si (psi) película porosa resultante com etanol absoluto várias vezes; secar as películas sob uma atmosfera de azoto seco.
- Oxidar as amostras recém-psi-gravados em um forno tubular a 800 ° C durante 1 h em ar ambiente (colocar a amostra no forno à temperatura ambiente, o calor do forno para 800 ° C, deixar no forno durante 1 hora, desligar o fornalha e retirar as amostras do forno apenas à temperatura ambiente).
2. Biofunctionalization de Psio 2 Andaimes
- Incubar uma PSi oxidada (PSiO 2) da amostra durante 1 hora em mercaptopropil (solução trimetoxi-3) 95% (MPTS) (108 mM em tolueno).
- Lavar o psio 2 amostra tratada com silano com tolueno, metanol e acetona, seco sob uma atmosfera de azoto seco.
- Incubar a amostra Psio 2 modificado com silano durante 30 min em 1 ml de solução de biotina 100 mM de PEO-iodoacetilo.
- Lavar o psio 2 amostra tratada com a biotina, com 0,1 (PBS) M de fosfato salina tamponada várias vezes.
- Incubar a amostra Psio 2 modificado com biotina durante 30 minutos em 1 ml de solução de 100 ug / ml de estreptavidina (SA).
- Lavar o tratado-SA Psio 2 amostra com 0,1 M PBS solução várias vezes.
- Incubar a SA-2 modificado Psio amostra resultante durante 30 min em 1 ml de 100 ug / ml E. biotinilado A solução de anticorpo monoclonal de E. coli (imunoglobulina G, IgG), ou com 100 ug / ml de IgG de coelho biotinilado (como um modelo para um anticorpo monoclonal).
3. Labeling fluorescentes e microscopia de fluorescência
- Incubar as superfícies de IgG modificadas com 15 ug / ml de fluoresceína (ITCF) marcado anti-IgG de coelho durante 40 min e com 15 ug / ml de fluoresceína (ITCF) marcado anti IgG de rato como controlo.
- Lavar as amostras modificadas com 0,1 M PBS solução várias vezes.
- Examine as amostras sob um microscópio de fluorescência.
4. Cultura de bactérias
- Cultive E. bactérias coli K12 em um tubo de 10 ml com 5 ml de Luria Bertani (LB) (composição do meio em 1 litro de água desionizada: 5 g de NaCl, 5 g de extracto de levedura e 10 g de triptona). Incubar as bactérias durante a noite com agitação a 37 ° C.
- Monitorar a concentração de bactérias através da leitura da densidade óptica (DO) a um comprimento de onda de 600 nm. Após crescimento durante a noite em meio LB, ler a DO600 utilizando um espectrofotómetro para determinar a concentração bacteriana. O número de células é extremactly proporcional para as medições de OD 600 (1 OD 600 = 10 8 células / ml).
5. Bactérias Sensing
- Coloque o psio IgG-2 modificado e limpo Psio 2 (como o controlo) em amostras de uma célula de fluxo feito por encomenda de Plexiglas. Fixar a célula de fluxo para assegurar que a reflectividade da amostra é medido no mesmo ponto durante todas as medições.
- Incubar as amostras com E. coli K12 suspensão (10 4 células / ml) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remover a suspensão de bactérias através de lavagem da célula com 0.85% w / v de solução salina durante 30 minutos.
- Monitorar as mudanças nos dados de refletividade em todo o experimento. Todas as medições ópticas devem ser realizados num meio aquoso circundante. Espectros devem ser coletados por meio de um espectrômetro de CCD e analisadas aplicando transformada de Fourier rápida (FFT), como descrito anteriormente 25,26.
- Confirmar a presença da bactéria nasuperfície do biossensor, por observação das amostras sob um microscópio de luz vertical imediatamente após a experiência biosensing.
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Representative Results
PSi oxidada (psio 2) filmes são preparados como descrito na secção de texto protocolo. Figura 1B mostra uma alta resolução de micrografia electrónica de varrimento da película resultante PSi após a oxidação térmica. A camada Psio 2 é caracterizada por poros cilíndricos bem definidos, com um diâmetro na gama de 30-80 nm.
O anticorpo monoclonal (IgG) moléculas são enxertadas sobre as duas superfícies de psio, utilizando uma tecnologia bem estabelecida silanização acoplado com um sistema de biotina-SA. O esquema de síntese detalhada é descrita na Figura 2. Em primeiro lugar, a superfície oxidada termicamente é silanizada por MPTS, resultando em uma superfície silanizada-tiol (Figura 2c). No passo seguinte, a superfície activada é incubada com um SH-reactivo moléculas ligantes biotina (Figura 2d), seguido por uma ligação das proteínas à superfície da SA modificado com biotina biotina-SA via pontes
A ligação dos anticorpos para a superfície de psio 2 é confirmada por marcação fluorescente seguida pela observação da superfície sob um microscópio de fluorescência. Além disso, estudos de fluorescência permitem caracterizar a actividade e a especificidade antigénica dos anticorpos imobilizados de superfície (IgG de coelho) por ligação de fluorescência marcado anti-IgG de coelho e anti-IgG de rato como controlo. Figura 3 resume os resultados destas experiências .
A fim de demonstrar bactérias biosensing nós usamos uma E. específico coli de IgG, em vez do modelo de IgG (IgG de coelho). Mais uma vez, a abordagem é para monitorar mudanças na amplitude (intensidade) da luz refletida a partir do Psio 2 nanostructure. Durante as experiências de detecção, os biosensores são fixados em uma célula de fluxo de modo a assegurar que a reflectividade da amostra é medido no mesmo ponto durante todas as medições. Toda a experiência é realizada em ambiente húmido e a reflectividade do espectro da amostra é monitorizada continuamente. Os biosensores são expostas a E. coli K12 suspensão (10 4 células / ml) durante 30 min, após o que uma solução tampão é usado para lavar a superfície do biossensor (para a remoção de bactérias não ligadas). Um espectro FFT do biossensor antes e depois da introdução da E. bactérias coli (10 4 células / ml) é mostrada na Figura 4a (em cima). Assim, após exposição a E. coli bactérias (e subsequente passo de enxaguamento) uma redução da intensidade de 7 ± 1% é registada, enquanto as alterações insignificantes (redução inferior a 0,5% da intensidade da FFT) são observadas para o não modificado Psio 2 superfície (Figura 4b, em cima). Além disso, em order para confirmar a presença de células capturadas sobre a superfície de psio 2, os biosensores são observadas sob um microscópio de luz, imediatamente após a conclusão da experiência biosensing. Figura 4a (fundo) mostra imobilizada células de bactérias na superfície do biossensor, enquanto que não há células são observados sobre as superfícies não modificados (de controlo), ver figura 4b (inferior).
Figura 1. (A) Espectro de reflectividade típica de um típico de Fabry-Perot Psio 2 nanoestrutura (esquerda) e o espectro correspondente sequência de uma transformação rápida de Fourier (direita). A posição e magnitude do pico único resultante são monitorados. (B) A alta resolução, micrografia eletrônica de varredura transversal (secelétrons secundárias) de uma Psio 2 camada (gravado por 30 segundos a 385 mA / cm 2).
Figura 2 representação. Esquemática dos passos de síntese a seguir biofunctionalize superfície Psio 2 com anticorpos. (A) Uma corrosão anódica electroquímica é utilizada para preparar uma camada PSi de um único cristal de bolacha de Si. (B) A amostra recém-gravado é então oxidado termicamente a 800 ° C. (C) A superfície Psio 2 reage inicialmente com MPTS para criar a superfície livre do grupo tiol (activada Psio 2 filme). (D) incubação da película activada com PEO-iodoacetil biotina para gerar superfície biotinilado. (E) A incubação das s biotiniladosurface com SA. (F) A incubação da superfície modificada com anticorpos biotinilados. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Resultados de experiências de marcação de fluorescência para confirmar a actividade e especificidade antigênica do IgG imobilizada. As amostras são observadas sob um microscópio de fluorescência a um tempo de exposição constante. (A) bioconjugação Complete, Psio 2 + + MPTS biotina + SA + biotinilado-coelho-IgG e FITC-anti IgG de coelho, (B) experimento de controle com FITC anti IgG de rato; (C) experimento de controle, não IgG, Psio 2 + + MPTS biotina + SA e FITC-anti IgG de coelho.
Nota: Estes esquemas são para illustratfins de íons apenas como conjugação de IgG também ocorre no interior dos poros.
Figura 4. E. experimentos biosensing coli e imagens de microscópio óptico correspondentes dos biossensores imediatamente após as experiências. Os biosensores são incubadas com 10 4 células / ml E. As suspensões de E. coli. Chave: (a)-IgG modificado Psio 2, (b) puro (não modificada) 2 psio.
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Discussion
Um imunossensor óptica livre de etiqueta, com base em um Psio 2 nanoestrutura (um filme fino de Fabry-Perot) é fabricada, e a sua aplicabilidade potencial como um biosensor para a detecção de bactérias é confirmada.
Modificações e solução de problemas
Uma das principais preocupações na concepção de um imunossensor é a susceptibilidade de anticorpos a sofrer alterações de conformação indesejáveis durante a deposição e modelação sobre o substrato sólido, o que pode levar a uma diminuição na sensibilidade do biossensor 31,32. Para minimizar este problema, a conjugação dos anticorpos para a superfície de psio 2 é realizado por meio de biotina-SA pontes. SA e biotina são vulgarmente usados em muitas aplicações biotecnológicas, devido à sua elevada afinidade (K d ~ 10 -13 M). A ligação de biotina-SA é um dos produtos químicos mais comuns para a imobilização do receptor praticado no desenvolvimento de biossensores 10,32,33,34. A acessibilidade dos anticorpos imobilizados podem ser regulados através da reacção de biotina-SA, que proporciona uma ligação flexível entre a superfície sólida e a IgG 31,35. Assim, o psio 2 é primeiro biofunctionalized com biotina / SA para permitir a conjugação de anticorpos biotinilados na nanoestrutura.
Limitações da técnica
As principais limitações deste esquema biosensing são atribuídos aos anticorpos usar como elemento de captura bactérias. Tal como é com outros imunossensores, que estão limitados à detecção de alvos que possuem anticorpos disponíveis, a especificidade dos anticorpos utilizados e da sua estabilidade de 36. O tipo de anticorpos a ser utilizado depende da aplicação específica e sempre que são preferidos anticorpos monoclonais possíveis. No entanto, apesar do alto grau de especificidade que os anticorpos monoclonais de fornecer, a detecção de células inteiras de bactérias inferior a 1.000 células / ml é ainda um desafio35. Além disso, o elevado custo envolvido na produção desses anticorpos devem ser tomadas em consideração.
Outra limitação é associado com a estabilidade química do transdutor PSi oxidado em ambientes corrosivos / aquosas. Embora, a estabilidade Psio 2 é superior em comparação com o PSI filmes finos, ainda na realização de comprimento (várias horas) experimentos de fluxo de desvios da linha de base podem ser observados 14,15,21,24. Além disso, é favorecida a trabalhar à volta de pH neutro (na gama de 6-8), a fim de evitar a instabilidade mecânica da nanoestrutura.
É claro que quando se lida com amostras de alimentos ou de água reais, que são contaminados com bactérias, um processo de pré-tratamento adequado tem que ser considerada, antes da etapa de detecção. O pré-tratamento deve ser projetado de acordo com as características específicas da amostra estudada. Por exemplo, os procedimentos de preparação, tais como a dispersão, filtração, ba pHlança, etc, poderiam ser consideradas. No entanto, estas técnicas de pré-tratamento estão fora do escopo deste trabalho.
Significado no que diz respeito aos métodos existentes
Até à data, a detecção e identificação de contaminações bacterianas se baseiam principalmente em técnicas de microbiologia de cultivo clássicas ou em técnicas rápidas em microbiologia, tais como kits de bioquímicos, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), e PCR (reacção em cadeia da polimerase) Ensaios de 2,3. Estes métodos são trabalhosos e demorados exigem vários dias para obter resultados, assim'' avaliação em tempo real'' de água e segurança alimentar permanecem 2,4,5 inviável. No presente trabalho, nós demonstramos a capacidade de bio-sensores à base de PSi para superar os inconvenientes destas técnicas. O presente biossensor permite uma detecção simples e relativamente sensíveis de bactérias através de uma abordagem direta'' célula'' captura, monitorando mudanças em sua opespectro de interferência estatística. Nossos resultados preliminares exibir um baixo limite de detecção de 10 4 células / ml E. coli e um tempo de resposta rápido de vários minutos. Para comparação, o limite de detecção de ressonância de plasmon de superfície actual estado-da-arte (SPR) biossensores é na gama de 2 10 -10 6 células / ml 37-40. Em termos de tempo de resposta, a resposta biossensores para a exposição de bactérias é comparável à das técnicas de SPR. Assim, as principais vantagens deste regime biosensing são a simplicidade do ensaio e detecção rápida permitindo a identificação "em tempo real" de bactérias alvo.
As aplicações futuras
Várias abordagens estão actualmente a ser explorados para melhorar o limite de detecção e sensibilidade do biossensor, incluindo a optimização da concentração de anticorpos e de orientação, utilizam fragmentos de anticorpos em vez de anticorpos completos. Além disso, estamos estudando o potencial do aptamers como sondas de captura alternativos. Em conclusão, o trabalho aqui apresentado fornece uma plataforma biosensing genérico que pode ser traduzido para muitas aplicações biosensing de uma variedade de microorganismos.
As etapas críticas no âmbito do protocolo
A fim de alcançar o desempenho ideal do biossensor, é muito importante para confirmar a Biofunctionalization dos Psio 2 andaimes (ver secção 3 no texto do protocolo, Labeling fluorescentes e microscopia de fluorescência). Os estudos de fluorescência permitem confirmar a ligação dos anticorpos para o transdutor (psio 2) de superfície e para caracterizar a actividade e a especificidade antigénica dos anticorpos ligados, por ligação de fluorescência etiquetados anti-IgG de coelho e anti-IgG de rato como controlo .
Além disso, a fim de eliminar resultados falsos na leitura óptica, que é essencial para lavar adequadamente a superfície do seguinte expo biossensorre as bactérias alvo (para a remoção de células de bactérias que são ligadas de modo não específico ou residem na superfície) e para conduzir experiências de controlo com puro Psio 2. A importância da experiência de controle é a eliminação de adsorção inespecífica bactérias na superfície do biossensor (ver secção 5 no texto do protocolo, bactérias Percebendo).
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Israel Ciência (concessão n º 1118-1108 e concessão n º 1146/12) e do Fundo de Investigação Kroll Memorial Minna. ES agradece o apoio financeiro do Instituto de Nanotecnologia Russell Berrie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
| Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
| Ethanol absolute | Merck | 818760 | |
| PBS buffer solution (pH 7.4) | prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| Saline 0.85% w/v | prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ) | ||
| 95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS) | Sigma Aldrich Chemicals | 175617 | |
| PEO-iodoacetyl biotin | Sigma Aldrich Chemicals | B2059 | |
| Streptavidin (SA) | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-000-114 | |
| Fluorescein (DTAF)-streptavidin | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 016-010-084 | |
| Biotinylated-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 011-060-003 | |
| Fluorescently tagged anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 111-095-003 | |
| Fluorescently tagged anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 115-095-003 | |
| Biotinylated E. coli antibody | Jackson ImmunoResearch Labs Inc. | 1007 | |
| E. coli (K-12) | was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion |
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