Måling af total calcium i neuroner ved Electron Probe røntgen Microanalysis

Summary

Dette papir beskriver anvendelsen af ​​cryoanalytical elektronmikroskopi til kvantitativ måling af total calcium indhold og fordeling på subcellulære opløsning i fysiologisk definerede biologiske prøver.

Abstract

I denne artikel de værktøjer, teknikker og instrumenter er egnede til kvantitative målinger af intracellulære elementært indhold ved hjælp af teknik kendt som elektron probe mikroanalyse (EPMA) er beskrevet. Intramitochondrial calcium er særlig fokus på grund af den afgørende rolle, at mitokondrie calciumoverfyldning spiller i neurodegenerative sygdomme. Metoden er baseret på en analyse af røntgenstråler genereret på et elektronmikroskop (EM) ved interaktion af en elektronstråle med prøven. For at bevare den native fordeling af diffusible elementer i elektronmikroskopi prøver EPMA kræver "cryofixation" af vævet efterfulgt af fremstilling af ultratynde kryosektioner. Hurtig frysning af dyrkede celler eller organotypiske skive kulturer udføres ved springet frysning i flydende ethan eller af slam frysning mod en kold metalblok, hhv. Kryosektioner nominelt 80 nm tyk skæres tør med en diamant kniv ved ca. -16076; C, monteret på carbon / pioloform-belagt kobber net, og cryotransferred ind i en cryo-EM bruge en specialiseret cryospecimen holder. Efter visuel undersøgelse og placering kortlægning ved ≤ -160 ° C, og lav elektron dosis frosne hydreret kryosektioner frysetørres ved -100 ° C i ~ 30 minutter. Organel-level billeder af tørrede kryosektioner registreres også ved lav dosis, ved hjælp af en langsom-scan CCD-kamera og subcellulære regioner af interesse udvalgt til analyse. X-stråler, der udsendes fra ROIs ved en stationær, fokuseret, høj intensitet elektron probe indsamles af en energi-Dispersive X-ray (EDX) spektrometer, behandles af hørende elektronik, og præsenteres som en X-ray spektrum, der er en plot af røntgen intensitet vs energi. Yderligere software letter: 1) identifikation af elementært komponenter ved deres "karakteristiske" peak energi og fingeraftryk, og 2) kvantitativ analyse ved ekstraktion af toparealer / baggrund. Dette papir slutter med to eksempler, der illustrerer typiskeEPMA applikationer, et, hvor mitokondrie calcium analysemetoder kritisk indsigt i mekanismerne for excitotoksisk skade og en anden, der afslørede grundlag af iskæmi modstand.

Introduction

Calciumioner er nok den vigtigste og mest alsidige cellesignalering enhed i biologi, spiller en væsentlig rolle i normale processer så forskellige som synaptisk transmission og genekspression. På den anden side, calcium er lige så vigtigt i celledød. Især calcium deregulering er en nøglefaktor i neuronal skade i slagtilfælde, Parkinsons, Alzheimers og andre neurodegenerative sygdomme ^3,5. Således er det kritisk vigtigt at forstå kvantitativt hvor calcium er fordelt inden for celler, og hvordan dette ændrer følgende fysiologiske eller patofysiologiske stimuli. Dette mål kompliceres af, at calcium dynamisk fordeles mellem to fysiske tilstande - fri i opløsning eller bundet til et underlag - og det cellulære calciumkoncentrationerne ændre sig over flere størrelsesordener som følge af stimulation.

Mens der er flere avancerede metoder til rådighed for analyse af free intracellulært calcium, er bestemmelse af total calciumkoncentrationer i bestemte intracellulære realistisk begrænset til en fremgangsmåde, nemlig elektron probe mikroanalyse (EPMA). EPMA er en teknik, at par et røntgenbillede spektrometer til et transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM elektronkanon fokuserer en stationær, submicron elektron sonde på en subcellulær område af interesse og det element-specifikke X-stråler, der udsendes som et resultat af elektron bombardement er indsamlet og analyseret (se referencer ^{7, 4} til detaljerede tekniske anmeldelser). Fordele ved EPMA omfatter enkelt organel niveau opløsning og submillimolar følsomhed. I praksis er det dog EPMA kræver specialiserede cryotechniques og instrumenter til prøvepræparation og analyse. Her er de værktøjer, teknikker og instrumenter er egnede til måling af intracellulær calcium hjælp EPMA beskrevet. Intramitochondrial calcium er af særlig interest på grund af den afgørende rolle, at mitokondrie calciumoverfyldning spiller i neurodegenerative sygdomme.

Protocol

Den her beskrevne fremgangsmåde blev udviklet ved hjælp af specifikke instrumenter, værktøjer og software. Fordi labs ikke skal bruge den samme forsøgsopstilling er generaliseret den tilgang, hvor det er muligt.

1.. Hurtig nedfrysning

Analysemetoden skal beskrives er helt afhængig af kryogene tilgange til: 1) "cryofixation" af celler eller væv på en måde, der kvantitativt bevarer fordelingen af ​​diffunderbare vævskomponenter og grundstoffer, som de var i levende celler i det øjeblik for frost , og 2) udarbejdelse af ultratynde kryosnit egnet til billedbehandling og analyse i et TEM. Disse teknikker er kort beskrevet her, men detaljer er nødvendige for at reproducere disse procedurer i andre laboratorier er uden for rammerne af denne artikel. Interesserede læsere henvises til fremragende nylige artikler ^9,14.

Advarsel: Dette afsnit beskriver brugen af ​​liquefied ethan, som er meget brandfarlige og eksplosive, bør der tages passende forholdsregler. Operatøren skal også være bekendt med flydende nitrogen _(LN2) sikkerhedsforanstaltninger, herunder beskyttende kittel, briller og cryoresistant handsker. Bemærk: Her og overalt, alle værktøjer (pincet osv.) anvendes til at håndtere frosne prøver skal forkøles i LN ₂ før brug for at undgå utilsigtet optøning.

Dyrkede celler på dækglas

1. Forbered en springet frysning anordning ved at kondensere gasformig ethan ved -160 ° C i LN _2-kølet central godt. Fyld op til mærket og dække godt med drejelige aluminium låg, når den ikke er i brug.
2. Brug filter papir kiler, skamplet plastik dækglas af dyrkede celler under eksperimentelt passende betingelser til en tynd vandig film. Skamplet fra kanten for at undgå at berøre væv den ideelle resterende film, bestemt ved trial-and-error, er så tynd som muligt, men ikke så thi at fordampe og tillade tørring af vævsoverfladen.
3. Holding dækglasset ved kanten med fastspænding pincet, hurtigt nedsænkes i flydende ethan, enten manuelt eller ved hjælp af tyngdekraften-drevne stemplet.
4. Placer den frosne dækglasset i en nærliggende styrofoam skål LN _2, stor nok til at manipulere det ønskede antal dækglas i langsigtede opbevaringsbeholdere. Aluminium skruelåg dåser, der ikke beslaglægge under LN ₂ anbefales.

Hurtig nedfrysning af dyrkede hjernen skiver

5. Under et dissektionsmikroskop, se og orientere en organotypisk hippocampus skive, uforstyrret og stadig er knyttet til kultur membran Indsæt. Placer referencemærker på membranen nær kanten af ​​skive med en sort Sharpie-typen pen og fotografi.
6. Stadig under mikroskop skåret ud ca. 5 x 5 mm membran firkanter med individuelle udsnit centreret på firkanterne. Undgå at røre ved skive eller bøje membrane.
7. Monter en membran understøttet skive, polstret med en ¼ i diameter agar pad, en specialdesignet aluminium disk lavet til at passe en cryoultramicrotome (beskrevet nedenfor). Hurtigt fryse skive med pneumatisk fremdrive det mod en LN _2-kølet safir blok ved hjælp af en tilpasset "slam frysning"-enheden.
8. Flyt til opbevaring som beskrevet for dyrkede celler.

2. Cryosectioning

Advarsel: Succesfuld producerer tør-cut bånd af ultratynde sektioner, mens ligetil og logisk, kræver træning, tålmodighed og en betydelig praksis.

1. Bages en cryoultramicrotome udstyret med en cryoattachment og afkøles til -135 ° C.
2. Skær frosne dækglas i ca. 3 x 3 mm firkanter ved hjælp af en skarp, forafkølet skalpel. Indkapsle stykker med kulturer opad i en viskos væske "cryoglue" (en 01:06 blanding af ethanol og 2-propanol ¹¹⁾ på standard 3mm diameter aluminium pins designet til at passe den microtome modellen Chuck. Undgå utætte cryoglue på kultur overflade. Størkne cryoglue ved at sænke cryobox temperatur ≤ -160 ° C.
   • For frosne hjernen skiver, fastgøre diske direkte til en skræddersyet eksemplar værktøjsholderen ved hjælp af en skrue krave.
3. Trim udvalgte områder af frosne prøver - f.eks celle-rige områder af dækglas stykker eller bestemte områder af skiver - til en ca. 250 x 250 um blok ansigt og ~ 100 um dybde ved hjælp af en diamant trimmeværktøj.
4. Dry-cut bånd af tynde sektioner på ca. -160 ° C under anvendelse af en 35 ° diamant cryoknife, i det væsentlige som beskrevet i referencs ^{4, 9.} Skærehastighed og kniv clearance vinkel bestemmes empirisk, et godt udgangspunkt er 0,4-0,6 mm / sek ved 9 °. Den nominelle tykkelse, dvs modellen forhånd hydrerede sektion Is typisk 80 nm, selvom sektioner er faktisk 1,5 2.0x tykkere, hovedsageligt på grund af kompression. For tilfredsstillende sektionering, er afgørende en antistatisk enhed. Placér ioniserende spidsen af ​​enheden 0,5-1 cm fra knivsæg og justere udgangseffekt indtil tilfredsstillende bånd af sektioner er produceret.
5. Forbered eyelash sonder ved at lime (med epoxy) øjenvipper til træ applikator pinde. Ved hjælp af en sådan sonde, samle op og overføre sektioner fra bagsiden af ​​kniven onto glød-afladet, kulstof-belagt pioloform support film støbt over 100-mesh folde kobber net og hviler på et halvt foldet indium folie kuvert på en arbejdsgruppe hylde bag kniven. Fold den øverste halvdel af gitteret og konvolut, presse med en koldpresning værktøj.
6. Overfør indpakket gitre til en bekvem gitter kasse og opbevares i en aluminium kan som beskrevet i trin 1.4.

3. Cryotransfer af enheder til elektronmikroskop

Kernen instrument for EPMAi dette laboratorium er en analytisk elektronmikroskop drives ved 120 kV og udstyret til cryomicroscopy, altså designet med en ren vakuum, prøve-område anticontaminator, en 2k x 2k højfølsom digitalt kamera og cryotransfer prøveholder. Tjek på forhånd mikroskop tilpasning og driftsforhold i både lav og høj forstørrelse tilstande og bekræfte en tilfredsstillende kolonne vakuum, ideelt ≤ 10 ^-7 Torr. Tune nødvendigt.

1. Kontroller, at vakuumisolering af Dewar komponent af cryoholder er tilfredsstillende. Pumpe nødvendigt.
2. Afkøl cryoholder til minimum temperatur, mindst -160 ° C, mens under højt vakuum inden mikroskopbordet, afmontere kabel, der forbinder holderen til dens styreboks. Vip goniometer 45 ° med uret, før du fjerner indehaveren til at minimere LN ₂ spilde på operatør og mikroskop overflader.
3. Forbered stationære cryoworkstation ved afkøling den integrerede isolered cup til ≤ 160 ° C.
4. Transfer (quickly!) den afkølede cryoholder fra mikroskop til kryo arbejdsstation. Træk indehaverens frost skjold.
5. Hent under LN ₂ et gitter sandwich fra oplagring og sted på arbejdsbordet i cryoworkstation. En låsering til indehaverens eksemplar godt placeres også på bordet.
6. Åbn indium kuvert og flytte den medfølgende folde gitteret til modellen godt af cryoholder. Fastgør nettet med holdering hjælp af skruenøgle værktøj forudsat og lukke frost skjold.
7. Hurtigt fjerne cryoholder fra cryoworkstation og indsætte i luftslusen af ​​mikroskopet og gå gennem pumpe sekvens så hurtigt som muligt. Ved indsættelse bør der være minimal forstyrrelse af kolonnen vakuum.
8. Retur vinkelmåler til 0 ° hældning. Tilslut og reenergize kontrolboksen og bekræft, at prøven temperaturen ≤ 150 ° C.
9. Fyld Dewar afpræparatholderen og tillade vakuum og temperatur at komme sig helt.

4.. Visuel undersøgelse af Sektioner

1. Træk frost skjold af holderen for at eksponere prøven og tænd for elektronstråle.
2. Visuelt evaluere prøven ved lav forstørrelse, typisk 250X, og lav belysning. Som illustreret i figur 1, bør sektioner være tynd og glat, ikke er foldet eller overlappende, flad og godt fastgjort til bærefilmen, og generelt ikke skjules af gitterstænger.
3. Eventuelt fotografere udvalgte sektioner. (BEMÆRK: Minimer stråle eksponering, da frosne hydreret sektioner er meget modtagelige for stråle-induceret skade.) Brug den automatiske digitale goniometer scenen for at gemme koordinaterne for udvalgte sektioner.

5.. Frysetørring af Sektioner

1. Frysetørre sektioner ved at øge holder temperaturen til ca. -100 ° C for ~ 30 min.
2. Recool holder til -160 ° C eller derunder.

6.. Imaging Celler og organeller

Strukturelle billeder af frysetørrede sektioner opnås ved ca. -160 ° C som lav dosis, nul-loss billeder optaget digitalt med en 2k x 2k slow-scan CCD-kamera styres af passende software.

1. Aktiver EM i hi-mag mode.
2. Vælg og billede på ~ 2.000 X (som TIFF, se figur 2) markerede celler og subcellulære områder af interesse i høj kvalitet sektioner, hvis steder blev tidligere optaget og gemt. (BEMÆRK: De tørrede sektioner er nu væsentligt mindre skrøbeligt og mindre modtagelige over for elektronstråle skader.
3. Vurdere billeder for at vælge områder af interesse (ROIs) for X-ray analyse. Dette trin kan eventuelt udføres off-line, i hvilket tilfælde EM kan drejesfra, og prøven lov til at opvarme til stuetemperatur.

7.. Erhvervelse af røntgen Spectra

X-ray spektre kan optages ved hjælp af en af ​​flere kommercielle eller specialdesignede røntgen analyse systemer minimalt består af en energi-Dispersive X-ray (EDX) detektor, tilknyttede puls-processor elektronik og kompatibel køb og display software. (Det system, der anvendes i dette eksperiment er beskrevet i tabel 1).

1. Konfigurer EM for X-ray købet ved at indsætte EDX detektor i kolonnen (om nødvendigt), tilbagetrækning af objektiv blænde og indsætte og centrering enhver omstrejfende stråling åbninger. Juster cryoholder til den laveste temperatur, hvor frost kontaminering af prøven undgås, men i det mindste under -100 ° C.
2. Vip holderen 20 ° mod detektoren.
3. Under lang-field imaging betingelser og under antagelse af en hensigt at analysere matrix af en individual mitokondrier, vælge en mitokondrier til analyse, flytte den til midten af ​​feltet og fokus.
4. Gå til stedet modus (på nogle mikroskoper blot konvergerer strålen ved hjælp af anden kondensator fokus) og øge strålestrøm til ca. 3. nA (som målt med en Faraday kop eller lignende) i en 100 nm stedet.
5. Start købet spektrum software og begynde 100 sec opkøb, som kan ses live tid på skærmens display. Gem registreret spektrum (figur 2). Industrien standard EMSA format foretrækkes.
6. Sluk for EM og overføre flere spektre fil (er) til en (offline) analyse arbejdsstation.

8.. Analyse af røntgen Spectra

Kvalitativ analyse

En EDX spektrum (figur 2, indsat) er hovedsagelig en xy plot af X-ray intensitet vs energi. Spectra indeholde kvalitative og kvantitative oplysninger om grundstofsammensætningen af ​​than analyserede volumen, i at den "karakteristiske" energi af en top identificerer element der giver anledning til spids, mens intensiteten afspejler mængden af ​​dette element. De karakteristiske toppe rider på toppen af ​​en langsomt varierende baggrund "kontinuum". (Legenden til figur 2 yderligere diskuterer iøjnefaldende detaljer i EDX spektre.) Energien af spidsbelastning mangfoldigheder for hele periodiske system er defineret af den velkendte elektroniske struktur af elementer, hvorfor alle EDX software links til en database, der automatisk identificerer komponenter af en analyt. I en fysiologisk sammenhæng elementer af almen interesse, der er velegnede til EDX analyse omfatter Na (K _α på 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV), og Ca (3,69 keV).

1. Udnyt tilgængelig software database og peak matchende rutiner for at identificere de vigtigste elementer i spektre. I en biologisk prøve forvente at finde toppe for Na, Mg, P, S, Cl, K og Ca. (ADVARSEL:De sidste to elementer overlapper hinanden!)

Kvantitativ analyse

Kvantitativ analyse af EDX spektre består i at udvinde det integrerede område af identificerede toppe og konvertere denne værdi til en fusion. For biologisk analyse, den etablerede fremgangsmåde er den Hall peak / kontinuum metode ^,4,7,10, der drager fordel af, at intensiteten af kontinuum (defineret ovenfor, og i figur 2) er proportional med tørvægt analyserede volumen . Således forholdet topareal / kontinuum-området, når der sammenlignes med samme forhold i spektre af standarder med kendt sammensætning, angiver koncentrationen i den målrettede cellulære rum. Bemærk, at denne metode giver koncentrationer i enheder af mol per vægt, typisk udtrykt som mmol / kg tørvægt. Denne enhed er usædvanligt og fortolkning kan kræve yderligere omdannelse til f.eks mmol / l vådvægt eller mmol / mg protein som beskrevet elsewhere ^4,10.

2. Uddrag spidsarealer (og fejlestimater) af biologiske elementer mellem Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dvs Na, Mg, P, S, Cl, K og Ca, ved hjælp af en af de montering rutiner indbygget i analyse software (se tabel 1, især fodnote 4). Dette laboratorium bruger Simplex eller multiple mindste kvadraters montering. Bemærk at denne montering kræver omhyggelig opmærksomhed til at løse overlapningen mellem K-og Ca toppe (se figur 2).
3. Integrer et kontinuum mellem 1,45-1,61 keV. Alternative støjfrie områder kan anvendes.
4. Beregn peak / kontinuum nøgletal og derefter koncentrationer ved sammenligning med standarder. Udbrede fejl i hele analysen.
5. Brug standard statistisk software og formler til at estimere gennemsnit, der afspejler den biologiske variabilitet.

Representative Results

Hjerneceller opretholde typisk excitotoksisk skade som følge af den patologiske neurotransmitterfrigivelsen, der opstår under iskæmiske forhold. EPMA var afgørende for at opdage, hvordan evne neuronale mitokondrier til at udskille massive mængder af calcium ligger bag den mekanisme af skade. Den elektronmikroskop i figur 3 illustrerer udseendet af mitokondrier i frysetørrede snit af dyrkede hippocampale neuroner hurtigt frosset ned efter 30 min eksponering til en excitotoksisk stimulus (100 uM NMDA). De fleste mitokondrier synes at være strukturelt beskadiget, eftersom de er meget opsvulmede og indeholde små, mørke inklusioner (røde pile). EPMA, som har opløsning tilstrækkeligt til at udføre grundstofanalyse inden og eksklusiv (den "matrix") mitokondrie inklusioner (figur 3, rød og blå spektre, henholdsvis), viste, at de indeslutninger hovedsagelig består af calcium og fosfor. Den ekstremt høje calcium contelt af disse optagelser - ~ 1.300 mmol / kg tørvægt, mens <1 mmol / kg er typisk for hvile mitokondrier - forklarer deres ekstraordinære calcium-bufferkapacitet og hvorfor overvældende denne buffer mekanisme fører til calciumoverfyldning-udløst celledød ^11.

Hippocampus, et område af hjernen kritisk for indlæring og hukommelse, er et vigtigt sted for skade efter iskæmi. Interessant og terapeutisk vigtigt funktionelt distinkt region navngivet CA3 er langt mindre sårbar over for iskæmisk beskadigelse, end det er tilstødende, synaptisk forbundet CA1-regionen. EMPA analyse - i samarbejde med snit af specifikke områder af hippocampusskiver der opretholder in situ struktur og funktion (figur 4, mikrograf) - blev brugt til at vise, at giftige stimuli fremkalde langt større calcium stigninger i udsatte CA1 neuroner end i resistente tilstødende CA3 neuroner ( Figur 4, søjlediagram). Følgelig CA1 mitochon Dria udstille omfattende skade og dysfunktion, hvilket indikerer, at Ca ^{2 +-overload-induceret} mitokondriel dysfunktion er en afgørende faktor i den selektive sårbarhed CA1 neuroner ^13.

Figur 1. Lavforstørrende elektronmikrografi af to bånd af frosne hydreret kryosnit understøttet på en pioloform film. Karakteristik af en god forberedelse er illustreret, herunder flade, godt tilknyttet, minimalt fragmenteret sektioner. Grid torve med flænger i støtte film bør undgås, da filmen tårer videre under elektronstråle. To pladser fuldt egnede til analyse Asterisk ved. Målestok = 100 um.

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg "/>
Figur 2. Kvantitativ analyse af organel grundstofsammensætningen af EPMA. Lav-dosis, digital scanning transmission elektron mikrograf af sympatisk neuron i en frysetørret kryosektion fremstillet af hurtigt frosne kontrol ganglion illustrerer detalje opnås i sådanne enheder. Bemærk den skarpe plasmamembranen, velbevarede stakke af endoplasmatiske reticulum og rigelige mitokondrier Indsat -. EDX spektrum optaget fra et typisk område af mitokondrie matrix, som indikeret ved den røde prik. Elementer, der svarer til de store K shell røntgen toppe identificeres, i tilfælde af kalium og calcium er to K-shell linjer opstår fra alternative elektroniske overgange løst, angives som K _α og K _β henhold til standard spektroskopiske notation. Spectrum illustrerer typiske fordeling af vigtige elementer i levende neuroner. Bemærk den langsomt varierende kontinuum stråling, fx mellem 1,5-1,8 eller 2,8-3,1 keV, hvilket afspejler massefylde denne cellulære rum. Kvantitativ analyse af calcium i raske celler kompliceres af tilstedeværelsen af relativt høje niveauer af kalium (ca. 500 mmol / kg tørvægt, omtrent svarende til 150 mm), hvilket giver anledning til overlapning af kalium K _β og calcium K _α toppe i EDX-spektret. Der er standard algoritmer til deconvolving dette overlap. Målestokken repræsenterer 1 um.

Figur 3. Excitotoksisk stimulation fremkalder variabel og lokaliseret calcium ophobning i de enkelte mitokondrier. Digital transmission elektron mikrograf af frysetørret kryosektion fremstillet af optagne hurtigt frosne hippocampus cellekultur efter excitotoksisk stimulering af NMDA-undertypen af ​​glutamat receptorer (100 uM NMDA i 30 min) viser mange mitokondrier indeholder små, naturligvis elektron tætte, punktformig inklusioner (røde pile). Tilsvarende X-ray spektre viser, at giftigt stimulation medført tab af ion homeostase, som det fremgår af øget Na peak og reduceret K højdepunkt i inddragelsen-fri mitokondrie matrix (blå pile og spektrum). Den store Ca højdepunkt i det røde spektrum afspejler stærk mitokondrie calcium ophobning lokaliseret til karakteristiske indeslutninger, som også indeholder store mængder fosfor og ilt. Gennemsnitlig Ca-koncentrationen i inklusioner og matricer var ~ 1.300 og ~ 60 mmol / kg tørvægt, hhv. Målestokken repræsenterer 500 nm.

7fig4.jpg "/>
Figur 4.. Mitokondrie calciumoverfyldning er ansvarlig for selektiv iskæmisk sårbarhed hippocampus CA1 neuroner venstre panel -. Elektronmikrofotografier af snit af celle organer i CA3 og CA1 regioner af en organotypisk hippocampus skive kultur, fryses hurtigt under iskæmi-efterligner betingelser (100 uM NMDA). højre panel - EPMA analyser af mitokondrie calcium indhold viser, at kemisk iskæmi inducerer meget større calcium stigninger i mitokondrier af sårbare CA1 neuroner end i tilstødende, iskæmi-resistent CA3 neuroner (* p <0,05 i forhold til NMDA-eksponerede CA1). NMDA-induceret calciumoverfyldning blev ophævet af NMDAR antagonist MK-801. Målestokken repræsenterer 2 um.

Discussion

Den elektronmikroskop-baserede analysemetode præsenteres her giver mulighed for detektion, identifikation og kvantificering af flere elementer af biologisk interesse, herunder Na, K, P og især Ca. Disse analyser kan udføres på subcellulært, dvs intra-organel, opløsning på grund af muligheden for at lokalisere og identificere strukturer af interesse i billeder af kryosektioner fremstillet af hurtigt frosne prøver af høj kvalitet. Bemærk, at ingen farvning er forpligtet til at optage elektron billeder sammenlignelige strukturelle kvalitet til konventionelt fast, plast-embedded præparater, selv mens placeringen af ​​væv elementer kvantitativt bevares.

Selv tilstandsvurdering billeder optages ved lav anvendt elektron dosis er meget højere doser nødvendige for at fremkalde røntgen-emission ved tællehastigheder tilstrækkelige til at opnå gode statistik. Derfor skal et mikroskop nyttig til EMPA være i stand til at danne en høj strøm fokuseret sonde; 2-5 nAi 25-50 nm, velegnet til omfattende organeller ligesom ER cisternae eller synaptiske vesikler, er acceptabel. Denne minimalt kræver en høj lysstyrke lanthan hexaboride elektron pistol. Under disse instrumentale forhold kan calcium ved typiske vævskoncentrationer af 1-10 mmol / kg tørvægt kvantitativt analyseret til en standard fejl på ± 0,1 mmol / kg i ~ 100 sek levende tid. Følsomheden af calcium analyse ville blive væsentligt forbedret, hvis det ikke var for den uheldige overlapning af de store calcium røntgenlinjeprofiler med en mindre kalium linje, deconvolution som tilfører betydelig usikkerhed til integrationen af calcium signal (se figur 1 forklaringen for detaljer). Bemærk, at de randbetingelser, der er beskrevet i høj grad er afslappet, når de lokale calciumkoncentrationerne er usædvanligt højt, som det sker i løbet af fysiologiske og især patologisk, mitokondrie calcium ophobning (figur 2-3).

Trods talrige successfUL-applikationer, er det klart, at EPMA er ikke en særlig effektiv teknik, så der er meget incitament til at forbedre data throughput. Tre lovende nævnes her: 1) elektron energitab spektroskopi (EELS) i stedet for EDX, 2) 2D element kort i stedet for punkts-prober, og 3) nyere, state-of-the-art instrumentering. Snarere end at indsamle udsendes røntgenstråler, EELS afhænger optagelse indfaldende elektroner, der har mistet karakteristiske Element-specifikke mængder af energi efter elektron / atom kollisioner. Statistisk set EELS er i sagens natur ~ 4x bedre end EDX, og ål hardware og software er nu næsten modne for biologer. (Se referencer ^{6, 2} til anmeldelser af ål applikationer i biologi.)

Den forbedrede følsomhed, der tilbydes af EELS - og også af de nyere high-throughput Si-afdrift EDX detektorer, se nedenfor - giver kortere opholdstider pr analyse, fx millisekunder snarere end hundreds af sekunder, og derfor evnen til at generere digitale kort på udvalgte områder i rimelige tidspunkter. Som et eksempel kan der optages en 128 x 128 calcium kortet i ~ 1 time ^1. Bemærk, at denne fremgangsmåde, der er kendt som "frekvenser imaging" ^6,2, giver en komplet EELS spektrum ved hver pixel, så oplysninger om flere elementer er indlejret i de indspillede "datakube" (x vs. Y vs. E).

Endelig har der været væsentlige fremskridt i instrument-teknologi og ydelse, da det nuværende system, som beskrevet i protokol afsnittet, blev udviklet over 20 år siden. State-of-the-art teknologi, der ville være de rigueur i en EMPA lab blive setup i dag vil omfatte: 1) en høj lysstyrke field-emission pistol, der kan pumpe flere nanoamps (Na) af strøm i subnanometer mellemstore pletter; 2 ) et stort område silicium-afdrift detektor til maksimeret røntgen opsamlingseffektivitet og gennemløb ⁸ og 3) moderne softwaretilbyder overlegen fleksibilitet og ydelse til spektral erhvervelse, analyse og kvantificering. Sådanne softwarepakker er kommercielt tilgængelige fra de fleste producenter, alternativt en opdateret og forbedret version af DTSA software, DTSA II, er tilgængelige uden ekstra omkostninger fra NIST (se tabel 1, fodnote 4). De netop beskrevne funktioner er på toppen af ​​enhver automatisering og / eller robotteknologi tilgængelig på basen elektronmikroskop.

EMPA protokol som beskrevet har vist sig særdeles nyttige for at angribe en række emner af interesse for hjerneforskere, hjælper, for eksempel til at afsløre cellulære mekanismer neurodegeneration. I betragtning af de forbedringer, netop anbefalet, bør EMPA fortsat være en fast bidragyder til fremtidig forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)