Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse

Summary

Ce document décrit l'application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies.

Abstract

Dans cet article, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour des mesures quantitatives de contenu élémentaire intracellulaire en utilisant la technique dite de la microsonde électronique (EPMA) sont décrits. Calcium intramitochondrial est une attention particulière en raison du rôle essentiel que la surcharge calcique mitochondriale joue dans les maladies neurodégénératives. La méthode est basée sur l'analyse des rayons X générés dans un microscope électronique (EM), par l'interaction d'un faisceau d'électrons avec l'échantillon. Afin de maintenir la distribution d'éléments native diffusibles dans les échantillons en microscopie électronique, EPMA nécessite "cryofixation" du tissu suivie de la préparation de coupes cryogéniques ultraminces. La congélation rapide des cellules en culture ou des cultures de tranches organotypiques est effectuée par congélation plonger dans de l'éthane liquide ou un gel par le claquement contre un bloc de métal froid, respectivement. Cryocoupes nominalement 80 nm d'épaisseur sont coupées à sec avec un couteau de diamant à ca. -16076, C, monté sur carbone / grilles de cuivre pioloform revêtu, et cryotransferred dans un cryo-EM en utilisant un support de cryospecimen spécialisé. Après inspection visuelle et la cartographie de l'emplacement à une température ≤ 160 ° C et une faible dose d'électrons, cryosections congelés-hydraté sont lyophilisés à -100 ° C pendant ~ 30 min. les images au niveau des organites de cryosections séchées sont enregistrées, également à faible dose, au moyen d'une caméra CCD à balayage lent et les régions sous-cellulaires d'intérêt sélectionné pour analyse. les rayons X émis par ROI par une sonde fixe, concentré, à haute intensité électrons sont collectés par un X-ray à dispersion d'énergie (EDX) spectromètre, traitée par l'électronique associée, et présenté comme un spectre de rayons X, qui est un terrain de l'intensité des rayons X vs énergie. Logiciel supplémentaire facilite: 1) l'identification des composants élémentaires par leur énergie et leur empreinte digitale de pointe «caractéristiques», et 2) l'analyse quantitative par extraction de zones de pic / fond. Ce document se termine par deux exemples qui illustrent typiqueApplications EPMA, celui dans lequel l'analyse du calcium mitochondrial fourni des informations essentielles sur les mécanismes de blessures excitotoxic et un autre qui a révélé la base de la résistance à l'ischémie.

Introduction

Les ions calcium sont sans doute entité de signalisation cellulaire le plus important et polyvalent en biologie, en jouant un rôle essentiel dans les processus normaux aussi divers que la transmission synaptique et l'expression des gènes. D'autre part, le calcium est également important dans la mort cellulaire. En particulier, la déréglementation de calcium est un facteur clé dans les lésions neuronales dans l'AVC, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et autres maladies neurodégénératives ^3,5. Ainsi, il est important de comprendre quantitativement comment le calcium est distribué dans les cellules, et comment cela change suivant stimuli physiologiques ou physiopathologiques. Ce but est compliquée par le fait que le calcium est distribué de façon dynamique entre les deux états physiques - libres en solution ou lié à un substrat - et que les concentrations en calcium cellulaire changé au cours de plusieurs ordres de grandeur à la suite d'une stimulation.

Bien qu'il existe plusieurs méthodes avancées disponibles pour l'analyse de free calcium intracellulaire, la détermination des concentrations totales de calcium dans les compartiments intracellulaires définies est réaliste limitée à une approche, à savoir, microsonde électronique (EPMA). EPMA est une technique qui couple un spectromètre à rayons X à un microscope électronique à transmission (MET). Le canon à électrons de TEM se concentre une sonde électronique fixe, submicronique sur une région subcellulaire d'intérêt et les rayons X spécifiques à un élément émis à la suite d'un bombardement d'électrons sont recueillies et analysées (voir les références ^{7, 4} pour les examens techniques détaillées). Avantages de l'EPMA comprennent résolution unique au niveau de l'organite et sensibilité submillimolar. En pratique, cependant, EPMA nécessite cryotechniques spécialisées et de l'instrumentation pour la préparation et l'analyse spécimen. Ici, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour les mesures de calcium intracellulaire utilisant EPMA sont décrits. Calcium intramitochondrial est de i spécialentérêt en raison du rôle crucial que joue la surcharge de calcium mitochondrial dans les maladies neurodégénératives.

Protocol

L'approche décrite ici a été développé en utilisant des instruments, des outils et des logiciels. Parce que les laboratoires ne seront pas utiliser le même dispositif expérimental de la démarche est généralisée, si possible.

Une. La congélation rapide

La méthode d'analyse d'être décrite est tout à fait dépendante de méthodes cryogéniques pour: 1) la "cryofixation" des cellules ou des tissus d'une manière qui préserve quantitativement la distribution des composants des tissus diffusibles et éléments chimiques comme ils l'étaient dans des cellules vivantes à l'instant de congélation et 2) la préparation d'ultramince cryosections approprié pour l'imagerie et l'analyse dans un TEM. Ces techniques sont brièvement décrites ici, mais les détails nécessaires pour reproduire ces procédures dans d'autres laboratoires sont au-delà de la portée de cet article. Les lecteurs intéressés sont appelés à d'excellents articles récents ^9,14.

Attention: Cette section décrit l'utilisation de savon mouéthane efied, qui est hautement inflammable et potentiellement explosif; précautions appropriées devraient être prises. L'opérateur doit également se familiariser avec de l'azote liquide _(LN2) les mesures de sécurité, y compris couche protectrice de laboratoire, des lunettes et des gants cryoresistant. Remarque: Ici comme partout, tous les outils (pinces, etc) utilisés pour manipuler les échantillons congelés doivent être pré-refroidies dans LN ₂ avant utilisation pour éviter la décongélation accidentelle.

Les cellules cultivées sur des lamelles couvre

1. Préparer un dispositif de gel profond par condensation de l'éthane gazeux à -160 ° C dans la LN puits central ₂ refroidi. Remplir à la marque et couvrir le puits avec le couvercle pivotant en aluminium lorsqu'il n'est pas utilisé.
2. En utilisant des cales de papier-filtre, tache lamelles en plastique de cellules cultivées dans des conditions appropriées expérimentalement à un film aqueux mince. Éponger à partir du bord de façon à éviter de toucher le tissu, le film résiduel idéal, déterminé par essai-erreur, est aussi mince que possible, mais pas si edans d'évaporer et de permettre le séchage de la surface du tissu.
3. En tenant la lamelle couvre-objet par le bord avec une pince de serrage, rapidement plonger dans de l'éthane liquide, soit manuellement, soit à l'aide du piston de la gravité alimenté.
4. Placer la lamelle congelé dans un bol en polystyrène expansé à proximité de LN _2, assez grand pour manipuler le nombre souhaité de lamelles couvre-objet dans des récipients de stockage à long terme. boîtes à bouchon à vis en aluminium qui ne saisissent pas sous _LN2 sont recommandés.

Congélation rapide des tranches de cerveau de culture

5. Sous un microscope de dissection, vue et orienter une tranche de l'hippocampe organotypique, intact et toujours attaché à l'insert de membrane de culture. Placez points repères sur la membrane près du bord de la tranche avec un stylo Sharpie black-type et la photographie.
6. Encore sous le microscope, couper env. 5 x 5 mm carrés de membranes avec des tranches individuelles centrées sur les places. Évitez de toucher la tranche ou la flexion du membrane.
7. Monter une tranche de membrane soutenu, amortie par un ¼ dans la garniture de gélose de diamètre, sur un disque en aluminium conçu sur mesure pour s'adapter à un cryoultramicrotome (décrit ci-dessous). Rapidement geler la tranche par pneumatique projetant contre un bloc de saphir LN _2-refroidi au moyen d'un dispositif sur mesure "claquement de congélation".
8. Déplacer vers stockage comme décrit pour les cellules en culture.

2. Cryosectioning

MISE EN GARDE: produire avec succès des rubans de coupes ultrafines sec coupées, tandis que simple et logique, une formation, de la patience et beaucoup de pratique.

1. Cuire un cryoultramicrotome équipé d'un cryoattachment et laisser refroidir à -135 ° C.
2. Couper des lamelles congelés dans env. 3 x 3 cases mm en utilisant un pointu, scalpel préalablement refroidi. Incluez morceaux avec des cultures vers le haut dans un liquide "cryoglue" visqueux (un mélange 01:06 d'éthanol et de 2-propanol ^11), type sur 3mm broches d'aluminium de diamètre conçu pour s'adapter à l'échantillon mandrin microtome. Éviter les fuites cryoglue sur la surface de culture. Solidifier cryoglue en abaissant la température de cryobox à ≤ 160 ° C.
   • Pour des tranches de cerveau congelés, fixer les disques directement à un échantillon mandrin sur-mesure au moyen d'un collier à vis.
3. Coupez des régions choisies des échantillons congelés - par exemple les zones riches cellules de pièces de lamelle ou domaines identifiés de tranches - une env. Face de bloc de 250 x 250 um et environ 100 um de profondeur à l'aide d'un outil de coupe au diamant.
4. Rubans sec coupe de lames minces à ca. -160 ° C en utilisant un diamant cryoknife 35 °, essentiellement comme décrit dans Références ^{d'4, 9.} Vitesse de coupe et angle de dégagement du couteau sont déterminées de manière empirique, un bon point de départ est de 0,4-0,6 mm / sec à 9 °. L'épaisseur nominale, c'est à dire spécimen avance, des articles hydratés is typiquement 80 nm, bien que les articles sont en fait de 1,5 2.0x plus épais, principalement due à la compression. Pour sectionnement satisfaisante, un dispositif antistatique est essentiel. Placez la pointe ionisante des périphériques de 0,5-1 cm du bord de couteau et régler la puissance de sortie jusqu'à rubans satisfaisantes des articles sont produits.
5. Préparer des sondes de cils par collage (époxy) cils de bois bâtons applicateurs. En utilisant une telle sonde, ramasser et sections de transfert de l'arrière de la lame sur des films de soutien pioloform revêtues de carbone lueur déchargée exprimés plus de 100 mailles des grilles de cuivre de pliage et reposant sur une indium enveloppe d'aluminium plié en deux sur une étagère de travail derrière le couteau. Replier la moitié supérieure de la grille et l'enveloppe, la presse avec un outil pression à froid.
6. Transfert grilles enveloppés dans une boîte de grille pratique et la ranger dans un aluminium peuvent, comme décrit dans l'étape 1.4.

3. Cryotransfert des échantillons à la microscope électronique

L'instrument de base pour EPMAdans ce laboratoire est un microscope électronique analytique fonctionnant à 120 kV et équipé pour cryo-microscopie, qui est, conçu avec un vide propre, spécimen anticontaminator-zone, une haute sensibilité appareil photo numérique 2k x 2k et cryotransfert support de spécimen. Vérifier au préalable l'alignement du microscope et des conditions de fonctionnement dans les deux modes à faible et à fort grossissement et confirmer un vide de la colonne satisfaisante, idéalement ≤ 10 ^-7 Torr. Tune up si nécessaire.

1. Confirmer que l'isolation sous vide de la composante de la cryoholder Dewar est satisfaisante. Pompe selon les besoins.
2. Refroidir le cryoholder à sa température minimum, au moins 160 ° C, tandis que sous vide poussé dans la platine du microscope, détachez le câble reliant le titulaire à son boîtier de commande. Inclinez le goniomètre 45 ° vers la droite avant de retirer le support de minimiser LN ₂ répandre sur les surfaces de l'opérateur et du microscope.
3. Préparer la cryoworkstation de paillasse par le refroidissement de la isoler intégranted tasse à ≤ 160 ° C.
4. Transfert (quickly!) le cryoholder refroidi de microscope à Cryo poste de travail. Rétracter gel bouclier de la porte.
5. Récupérer sous LN _2, un sandwich au réseau de stockage et de place sur la table de travail de la cryoworkstation. Un anneau de retenue pour l'échantillon le puits de la titulaire est également mis sur la table.
6. Ouvrez l'enveloppe d'indium et déplacer la grille de pliage ci-joint pour le bien de l'échantillon de la cryoholder. Fixez la grille avec la bague de retenue en utilisant l'outil de clé fournie et fermer l'écran de gel.
7. Enlever rapidement la cryoholder du cryoworkstation et l'insérer dans le sas du microscope et de passer par la séquence de pompage le plus rapidement possible. Lors de l'insertion, il devrait y avoir une interruption minimale du vide de la colonne.
8. Goniomètre revenir à 0 ° d'inclinaison. Rebranchez et redynamiser le boîtier de commande et de confirmer que la température de l'échantillon est ≤ 150 ° C.
9. Remplir le Dewar de laporte-échantillon et permettent vide et la température se remettre complètement.

4. Enquête visuelle des sections

1. Rentrer le bouclier de gel de la porte pour exposer spécimen et tourner sur le faisceau d'électrons.
2. Évaluer visuellement l'échantillon à faible grossissement, généralement 250X, et un éclairage faible. Comme illustré sur la figure 1, les sections doivent être minces et lisses, non pliée ou en chevauchement, plane et bien attaché à la feuille de support, et généralement pas obscurcie par les barres de la grille.
3. Éventuellement photographier sections choisies. (REMARQUE: Réduire l'exposition au faisceau, depuis les coupes congelées hydraté sont très sensibles aux dommages induits par faisceau.) Utilisez la platine de goniomètre numérique automatisé pour stocker les coordonnées des articles sélectionnés.

5. La lyophilisation des articles

1. Lyophiliser sections en augmentant la température de titulaire à ca. 100 ° C pendant environ 30 min.
2. Recool support à -160 ° C ou moins.

6. Imagerie des cellules et des organites

Images structurels des articles lyophilisés sont obtenus à ca. -160 ° C, à faible dose, les images sans perte enregistrés numériquement à l'aide d'une caméra CCD à balayage lent 2k x 2k contrôlé par un logiciel approprié.

1. Activez l'EM en mode salut-mag.
2. Choisissez et de l'image à ~ 2000 X (comme TIFF, voir la figure 2) cellules sélectionnées et les zones sub-cellulaires d'intérêt dans les sections de haute qualité dont les emplacements ont déjà été enregistrées et stockées. (NOTE: Les sections sèches sont maintenant beaucoup moins fragile et moins sensible aux électrons du faisceau dommages.
3. Évaluer images afin de sélectionner des régions d'intérêt (ROI) pour analyse aux rayons X. Cette étape peut éventuellement être effectuée hors ligne, auquel cas l'EM peut être tournéet hors de l'échantillon laisse se réchauffer à la température ambiante.

7. Acquisition de rayons X Spectra

Spectres de rayons X peut être enregistré en utilisant n'importe quel de plusieurs commerciale conçue sur mesure ou X-ray systèmes d'analyse minimum consistant en un X (EDX) détecteur à dispersion d'énergie, l'électronique impulsion processeurs et logiciels associés d'acquisition et d'affichage compatible. (Le système utilisé dans ces travaux est décrit dans le tableau 1.)

1. Configurer l'EM pour l'acquisition de rayons X par l'insertion, le détecteur EDX dans la colonne (si nécessaire), le retrait de l'ouverture objectif, et l'insertion et le centrage des ouvertures de rayonnement parasite. Ajuster le cryoholder à la plus basse température à laquelle le gel contamination de l'échantillon est évitée, mais au moins au-dessous de -100 ° C.
2. Incliner le support à 20 ° vers le détecteur.
3. Dans des conditions de formation d'image à grand champ, et en supposant que l'on envisage d'analyser la matrice d'un individual mitochondries, choisissez une mitochondrie pour l'analyse, le déplacer vers le centre du champ et de se concentrer.
4. Passer en mode spot (sur certains microscopes juste converger le faisceau en utilisant deuxième foyer du condenseur) et augmenter le courant de faisceau à ca. 3 nA (mesurée avec une cage de Faraday ou similaire) dans un endroit 100 nm.
5. Lancez le logiciel d'acquisition de spectre et de commencer à 100 acquisitions sec, qui peut être consulté temps en direct sur l'écran d'affichage. Enregistrer spectre enregistré (Figure 2). Le format EMSA standard de l'industrie est préférable.
6. Arrêtez l'EM et transférer le fichier (s) multi-spectres à un (offline) analyse poste de travail.

8. Analyse des rayons X Spectra

L'analyse qualitative

Un spectre EDX (figure 2, en médaillon) est essentiellement un complot xy de l'intensité des rayons X vs énergie. Spectra contiennent des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de til a analysé volume, en ce que l'énergie "caractéristique" d'un pic identifie l'élément donnant lieu à ce que l'intensité maximale alors que reflète la quantité de cet élément. Les pics caractéristiques montent au-dessus d'un fond lentement variable, le "continuum". (La légende de la figure 2 présente en outre des détails importants sur les spectres EDX). L'énergie des collecteurs de pointe pour l'ensemble du tableau périodique sont définis par la structure électronique bien connue d'éléments, donc tous les liens de logiciels EDX à une base de données qui identifie automatiquement les éléments de un analyte. Dans un contexte physiologique, éléments d'intérêt général qui sont bien adaptées à l'analyse EDX comprennent Na (K _α à 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) et Ca (3,69 keV).

1. Profitez de base de données de logiciels disponibles et routines pic correspondant à identifier les éléments majeurs dans les spectres. Dans un échantillon biologique s'attendre à trouver des pics de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et. (ATTENTION:Les deux derniers éléments se superposent!)

Analyse quantitative

L'analyse quantitative des spectres EDX consiste à extraire l'aire intégrée des pics identifiés, et la conversion de cette valeur à une concentration. Pour l'analyse biologique, la méthode est la méthode établie pic / continuum salle ^4,7,10, qui tire parti du fait que l'intensité du continuum (défini ci-dessus et sur ​​la figure 2) est proportionnelle à la masse sèche du volume analysé . Ainsi, le rapport du pic de la zone / zone continuum, par rapport au même rapport dans les spectres de normes de composition connue, indique la concentration dans le compartiment cellulaire ciblée. Notez que cette approche fournit des concentrations en unités de moles par poids, généralement exprimées en mmol / kg de poids sec. Cette unité est inhabituel et d'interprétation peut exiger la conversion supplémentaire, par exemple, mmol / L poids humide ou mmol / mg de protéine, comme décrit elsewhere ^4,10.

2. Extraire des zones de pointe (et des estimations d'erreur) d'éléments biologiques entre Z = 10 à 20 (0,5 à 4,0 keV), à savoir Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et, avec l'une des routines de montage intégrée dans le logiciel d'analyse (voir le tableau 1, en ​​particulier la note 4). Ce laboratoire utilise Simplex ou plusieurs places-moins approprié. Notez que cette mise en place nécessite une attention particulière à la résolution du chevauchement entre K et Ca pics (voir la figure 2).
3. Intégrer le continuum entre 1,45 à 1,61 keV. Régions sans interférences alternatives peuvent être utilisées.
4. Le calcul des ratios de pointe / continuum puis concentrations par rapport aux normes. Propager des erreurs tout au long de l'analyse.
5. Utiliser des logiciels et des formules statistiques standard pour estimer les moyennes qui reflètent la variabilité biologique.

Representative Results

Les cellules du cerveau subissent généralement des blessures excitotoxic à la suite de la libération de neurotransmetteurs pathologique qui se produit dans des conditions ischémiques. EPMA était essentiel pour découvrir comment la capacité des mitochondries neuronales pour séquestrer des quantités massives de calcium sous-tend le mécanisme de la blessure. La micrographie électronique de la figure 3 illustre l'aspect des mitochondries dans les cryosections lyophilisées de neurones d'hippocampe en culture congelés rapidement après 30 min d'exposition à une stimulation excitotoxique (100 uM NMDA). La plupart des mitochondries semblent être structurellement endommagé, car ils sont très enflées et contiennent de petites inclusions sombres (flèches rouges). EPMA, qui a une résolution suffisante pour effectuer l'analyse élémentaire et à l'intérieur exclusif (la «matrice») inclusions mitochondrial (Figure 3, les spectres rouge et bleu, respectivement), a révélé que les inclusions sont composées essentiellement du calcium et du phosphore. Le con de calcium extrêmement élevétente de ces inclusions - ~ 1300 mmol / kg de poids sec, alors que <1 mmol / kg est typique de repos mitochondries - explique leur capacité calcium-tampon extraordinaire, et pourquoi écrasante ce mécanisme tampon calcium conduit à une surcharge déclenché la mort cellulaire ^11.

L'hippocampe, une zone du cerveau critique pour l'apprentissage et la mémoire, est un site majeur de blessure après une ischémie. Fait intéressant, et thérapeutiquement importante, la région fonctionnellement distincte nommé CA3 est beaucoup moins sensible aux lésions ischémiques que ne l'est la région CA1 adjacent, synaptique connecté. Analyse APEM - en conjonction avec cryosections des régions spécifiques de tranches d'hippocampe qui maintiennent la structure in situ et la fonction (Figure 4, micrographie) - a été utilisé pour montrer que les stimuli toxiques induisent beaucoup plus élévations de calcium dans les neurones CA1 vulnérables que dans les neurones CA3 adjacentes résistants ( Figure 4, diagramme à barres). Par conséquent, CA1 mitochondries dria exposer vaste blessure et le dysfonctionnement, ce qui indique que le Ca ^{2 +} dysfonctionnement mitochondrial surcharge induite est un facteur déterminant dans la vulnérabilité sélective des neurones CA1 ^13.

Figure 1. Micrographie électronique à faible grossissement de deux rubans de cryosections congelés hydraté pris en charge sur un film de pioloform. Caractéristiques d'une bonne préparation sont illustrés, y compris, bien attachés, sections plates peu fragmentés. places de la grille avec des déchirures dans le film de support doivent être évitées, car le film se déchire encore sous le faisceau d'électrons. Deux carrés entièrement appropriées pour l'analyse sont indiquées par des astérisques. Barre d'échelle = 100 um.

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Figure 2. L'analyse quantitative de la composition élémentaire organite par EPMA. Faible dose, balayage numérique en microscopie électronique à transmission de neurone sympathique dans un cryosection lyophilisé préparé à partir de ganglion de commande rapidement congelé illustre le détail réalisable de ces spécimens. Notez la membrane plasmique forte, piles bien conservés de réticulum endoplasmique et les mitochondries abondantes Encart -. Spectre EDX enregistrée à partir d'un quartier typique de la matrice mitochondriale, comme indiqué par le point rouge. Les éléments qui correspondent aux principaux pics coquille de rayons X K sont identifiés, dans le cas du potassium et du calcium, deux lignes K-coquille résultant de transitions électroniques alternatifs sont résolus, comme indiqué K _α et K _β selon la notation spectroscopique standard. Spectrum illustre la répartition typique des éléments majeurs dans les neurones vivants. Notez le rayonnement continuum variant lentement, par exemple entre 1.5 à 1.8 ou 2.8 à 3.1 keV, ce qui reflète la densité de la masse de ce compartiment cellulaire. L'analyse quantitative de calcium dans les cellules saines est compliquée par la présence de niveaux relativement élevés de potassium (poids env. 500 mmol / kg à sec, à peu près équivalente à 150 mM), ce qui donne lieu à un chevauchement des _β potassium K et le calcium K _α sommets dans le spectre EDX. Il existe des algorithmes standard pour déconvolution ce chevauchement. La barre d'échelle représente 1 um.

Figure 3. Stimulation excitotoxique induit l'accumulation de calcium variable et localisé dans les mitochondries individuels. Micrographie électronique à transmission numérique de la cryosection lyophilisé préparé à partir de culture de l'hippocampe non fixée, rapidement congelé cellule après stimulation excitotoxic du sous-type NMDA des récepteurs du glutamate (100 uM NMDA pendant 30 min) montre de nombreuses mitochondries contenant de petites inclusions, ponctuées naturellement électrons denses (flèches rouges). Correspondant spectres de rayons X montrent que la stimulation toxique a entraîné la perte de l'homéostasie ionique, comme en témoigne l'augmentation pic Na et K réduite pic dans la matrice mitochondriale sans inclusion (flèches bleues et spectre). Le grand pic Ca dans le spectre rouge reflète la forte accumulation de calcium mitochondrial localisé à inclusions caractéristiques, qui contiennent également de grandes quantités de phosphore et de l'oxygène. La concentration moyenne en Ca inclusions et des matrices était ~ 1300 et ~ 60 mmol / kg de poids sec, respectivement. La barre d'échelle représente 500 nm.

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Figure 4. Surcharge calcique mitochondriale est responsable de la vulnérabilité ischémique sélective des neurones CA1 de l'hippocampe panneau de gauche -. Micrographies électroniques de cryosections de corps cellulaires dans le CA3 et régions CA1 d'une culture de la tranche de l'hippocampe organotypique, congelés rapidement dans des conditions d'ischémie imitant (100 uM NMDA). panneau de droite - EPMA analyse de la teneur en calcium mitochondrial montre que l'ischémie chimique induit beaucoup plus importantes élévations de calcium dans les mitochondries des neurones CA1 vulnérables que dans les neurones CA3 adjacentes ischémie-résistant (*, p <0,05 par rapport au CA1 NMDA-exposée). Surcharge de calcium induite par le NMDA a été abolie par NMDAR antagoniste MK-801. La barre d'échelle représente 2 um.

Discussion

La méthode analytique basée microscope à électron présenté ici permet la détection, l'identification et la quantification de plusieurs éléments d'intérêt biologique, notamment Na, K, P, Ca et surtout. Ces analyses peuvent être effectuées à subcellulaire, soit intra-organite, la résolution en raison de la capacité de localiser et d'identifier les structures d'intérêt dans les images de haute qualité de cryosections préparés à partir de spécimens congelés rapidement. Notez qu'aucune coloration est nécessaire pour enregistrer des images électroniques comparables en qualité structurelle, préparations plastique intégré classiquement fixes, alors même que l'emplacement des éléments du tissu est quantitativement préservée.

Bien que les images structurels de l'enquête sont enregistrés à la dose d'électrons appliquée faible, des doses beaucoup plus élevées sont nécessaires pour obtenir émission de rayons X à des débits suffisants pour obtenir de bonnes statistiques de comptage. Par conséquent, un microscope utile pour l'APEM doit être en mesure de former une sonde ciblée courant élevé; 2-5 nAen 25-50 nm, adapté pour encercler organites comme citernes de ER ou vésicules synaptiques, est acceptable. Ce mini nécessite un canon à électrons lanthane hexaborure haute luminosité. Dans ces conditions instrumentales, de calcium à des concentrations typiques de tissus de poids 1-10 mmol / kg sec peut être analysé quantitativement à une erreur-type de ± 0,1 mmol / kg en ~ 100 sec temps réel. La sensibilité de l'analyse du calcium serait grandement améliorée si ce n'était pas pour le malheureux chevauchement de la principale ligne de rayons X calcium avec une ligne de potassium mineur, déconvolution qui ajoute une incertitude significative à l'intégration du signal de calcium (voir la figure 1 la légende pour détails). Notez que les conditions aux limites décrites sont grandement détendue lorsque les concentrations de calcium locales sont anormalement élevés, comme c'est le cas pendant physiologiques, pathologiques et surtout, l'accumulation de calcium mitochondrial (figures 2-3).

Malgré de nombreux successfapplications ul, il est clair que EPMA n'est pas une technique particulièrement efficace, il n'y a donc beaucoup de motivation pour améliorer le débit de données. Trois pistes prometteuses sont mentionnés ici: 1) perte d'énergie des électrons spectroscopie (EELS) au lieu de EDX; 2) élément 2D des cartes à la place de points de sondes et 3) plus récente, instrumentation état-of-the-art. Plutôt que de recueillir les rayons X émis, EELS dépend de l'enregistrement électrons incidents qui ont perdu caractéristiques montants, spécifiques à un élément de l'énergie après des collisions électron / atome. Statistiquement, EELS est intrinsèquement ~ 4x mieux que EDX, EELS et matériel et les logiciels sont maintenant pratiquement à maturité pour les biologistes. (Voir les références ^{6, 2} pour l'examen des demandes d'anguilles dans la biologie.)

La sensibilité améliorée offerte par EELS - et aussi par les haut-débit Si-dérive détecteurs EDX plus récents, voir ci-dessous - permet courts temps de séjour par l'analyse, par exemple millisecondes plutôt que hes centaines de secondes, et donc la capacité de générer des cartes numériques des zones sélectionnées dans des délais raisonnables. A titre d'exemple, une carte 128 x 128 de calcium peut être enregistrée dans ~ 1 h ^1. Notez que cette approche, connue sous le nom "l'imagerie du spectre" ^6,2, fournit un spectre EELS complète à chaque pixel, afin que l'information sur plusieurs éléments est intégré dans le "cube de données" enregistré (x vs. Y vs. E).

Enfin, il ya eu des progrès notables en matière de technologie de l'instrument et de la performance depuis le système actuel, tel que décrit dans la section Protocole, a été développé il ya plus de 20 ans. State-of-the-art technologie qui serait de rigueur dans un laboratoire de l'APEM étant installation aujourd'hui comprendrait: 1) un pistolet à émission de champ à haute luminosité qui peut pomper plusieurs nA (NA) de courant dans les taches de subnanométrique taille; 2 ) un grand détecteur silicium-dérive pour maximisée collection efficacité et le débit ⁸ X-ray, et 3) un logiciel moderneoffrant une flexibilité et des performances supérieures pour l'acquisition spectrale, analyse et quantification. Ces logiciels sont disponibles dans le commerce de la plupart des fabricants, ou alternativement, une version mise à jour et améliorée du logiciel DTSA, DTSA II, est disponible sans frais auprès de NIST (voir le tableau 1, note 4). Les caractéristiques décrites sont juste au-dessus de tout l'automatisation et / ou de la robotique disponible sur le microscope électronique de base.

Le protocole de l'APEM comme décrit a prouvé lui-même très utile pour attaquer plusieurs questions d'intérêt pour les neuroscientifiques, en aidant, par exemple, de révéler les mécanismes cellulaires de la neurodégénérescence. Compte tenu des améliorations recommandées juste, APEM devrait continuer à être un contributeur solide pour des recherches futures.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)