電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

サマリー

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。

要約

この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて​​組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。

概要

カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患^3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 - - 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。

FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献^7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有の....

プロトコル

ここに記載されたアプローチは、特定の機器、ツールとソフトウェアを使用して開発されました。 Labsは、同じ実験を使用することはできませんので、アプローチは、可能な限り一般化されています。

1。急速凍結

彼らは凍結の瞬間に生きている細胞であったように定量的に拡散性組織成分と化学元素の分布を保持する方法で、細胞または組織の1）「低温固定」：後述する分析方法は、極低温のためのアプローチに絶対に依存していると、2）TEMで画像化及び分析に適した超薄凍結切片の調製。これらの技術は、ここで簡単に説明しますが、他の研究室では、これらの手順を再現するために必要な詳細はこの記事の範囲を超えています。興味のある読者は、優れた最近の記事を^9,14と呼ばれている。

注意：このセクションでは、液体石鹸の使用が記載されている引火性が高いと爆発する可能性あるefiedエタン;適切な予防措置が取られるべきである。また、オペレータは、液体窒素に精通している必要があります（LN _2）保護白衣、メガネ、そしてcryoresistant手袋など安全上の注意、。注：ここでは全体を通して、（鉗子など ）凍結した検体を処理するために使用されるすべてのツールは、偶発的な融解を避けるために、使用前に、LN ₂で予冷されている必要がありま....

結果

脳細胞は通常、虚血状態下で起こる病的な神経伝達物質の放出の結果として、興奮毒性損傷を維持する。 EPMAはカルシウムを大量に隔離する神経細胞のミトコンドリアの能力は、損傷のメカニズムの基礎となる方法を発見する重要でした。 図3の電子顕微鏡写真は、急速に興奮毒性刺激（100μMNMDA）へ30分間曝露した後に凍結培養海馬ニューロンの凍結乾燥した凍結切片におけるミトコンドリアの外観を表したものである。彼らは非常に腫れている、小さな、暗い介在物（赤い矢印）が含まれているように、ほとんどのミトコンドリアは、構造的に破損しているように見える。ミトコンドリア介在物（ 図3、赤と青のスペクトルのそれぞれ）内および（「マトリックス」）の排他的な元素分析を行うのに十分な解像度を有するEPMAは、介在物は、主にカルシウム及びリンから構成されていることが明らかになった。非常に高いカルシウムCONこれらの介在物の10トン- 〜1300ミリモル/ kg乾燥重量のに対し、<1ミリモル/ kgのミトコンドリアを休んでの典型的なものである-彼らの異常なカルシウム緩衝能を説明し、なぜ圧倒的なこのバ.......

ディスカッション

ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に保持されながらも、従来の固定された、プラスチック包埋調製物構造品質に匹敵する電子画像を記録するために必要とされないことに留意されたい。

構造調査画像は低印加電子線量で記録されているが、はるかに高い用量が良好な統計値を得るのに十分な計数率でX線放射を誘発するために必要とされる。したがって、EMPAに便利顕微鏡は高電流集中プローブを形成することができなければならない。2-5 nAの25〜50ナノメートルに、ER嚢やシナプス小胞のような細胞小器官を包囲するのに適した、許容可能である。この最小限の高輝度六ホウ化ランタンの電子銃が必要になります。これらの楽器の条件下では、1月10日ミリモル/ kg乾燥重量の典型的な組織濃度のカルシ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/材料
Thermanoxプラスチックカバースリップ	Thermo Fischer Scientific	72280
培養インサート	BD Falcon	353090	6ウェルプレート用
クライオピン	ライカマイクロシステム	ズ 16701952	溝付き
ウッドアプリケーター	EM Sciences	72300
折り畳み式電子顕微鏡グリッド	Ted Pella	4GC100/100	100メッシュ
インジウム箔	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge 凍結装置	Leica Microsystems	KF-80
Slam 凍結装置	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
ミクロトーム用クライオアタッチメント	ライカマイクロシステムズ	FC6
ダイヤモンドクライオトリミングツール	ダイアトーム	クライオトリム45
ダイヤモンドクライオナイフ	ダイアトーム	クライオ35
帯電防止装置	ダイアトーム	ハウフ スタティックライン
クライオ電子顕微鏡	カールツァイス顕微鏡	EM912 オメガ
EMクライオ試料ホルダー	Gatan	CT3500
スロースキャンCCDカメラ、2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
画像取得ソフトウェア	Olympus SIS	iTEM suite
ED X線検出器	オックスフォード・インストゥルメンツ	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	オックスフォード・インストゥルメンツ	XP-3
PCIバックプレーンcard	4pi Systems	Spectral Engine II
デスクトップコンピュータ	Apple	OS9互換機種
X線解析ソフト	NIST	DTSA, DTSA II
表計算ソフト		Microsoft Excel
CF100は、多くの学術施設で販売されていますが、現在は市販されていません。 CT3500クライオトランスファーホルダーのビデオチュートリアルは、次の場所にあります。これはhttp://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. SEIIは廃止されました。ユニバーサルスペクトルエンジンは、同等の機能を備えた後のPC互換製品です。4piは製造と販売を停止しましたが、技術的なカスタマーサポートは引き続き提供しています。中古のシステムは、オンラインでよく見かけます。 オリジナルのDTSAは、今では廃れています。NIST は、更新された後継である DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)