Summary
本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。
Abstract
この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。
Introduction
カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 - - 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。
FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有のX線を収集し、分析する。 EPMAの利点は、単一の細胞小器官レベルの解像度とsubmillimolar感度があります。しかし実際には、EPMAは、試料調製および分析のための専門cryotechniquesや計測が必要です。ここでは、EPMAを用いた細胞内カルシウムの測定のための適切なツール、技術および器具が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムは、特別のIです神経変性疾患におけるミトコンドリアのカルシウム過負荷果たしている重要な役割の都合nterest。
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Protocol
ここに記載されたアプローチは、特定の機器、ツールとソフトウェアを使用して開発されました。 Labsは、同じ実験を使用することはできませんので、アプローチは、可能な限り一般化されています。
1。急速凍結
彼らは凍結の瞬間に生きている細胞であったように定量的に拡散性組織成分と化学元素の分布を保持する方法で、細胞または組織の1）「低温固定」：後述する分析方法は、極低温のためのアプローチに絶対に依存していると、2）TEMで画像化及び分析に適した超薄凍結切片の調製。これらの技術は、ここで簡単に説明しますが、他の研究室では、これらの手順を再現するために必要な詳細はこの記事の範囲を超えています。興味のある読者は、優れた最近の記事を9,14と呼ばれている。
注意：このセクションでは、液体石鹸の使用が記載されている引火性が高いと爆発する可能性あるefiedエタン;適切な予防措置が取られるべきである。また、オペレータは、液体窒素に精通している必要があります（LN 2）保護白衣、メガネ、そしてcryoresistant手袋など安全上の注意、。注：ここでは全体を通して、（鉗子など ）凍結した検体を処理するために使用されるすべてのツールは、偶発的な融解を避けるために、使用前に、LN 2で予冷されている必要があります。
カバースリップ上で培養した細胞
- LN 2冷却された中央ウェル中に-160℃で気体状エタンを凝縮して、デバイスを凍結思い切って準備します。マークに記入し、ピボットアルミ蓋、使用しないときによくカバーしています。
- 濾紙ウェッジを用いて、薄い水性フィルムに、実験的に適切な条件下で培養された細胞のプラスチック製カバースリップブロット。組織に触れないようにするために、端からブロット、試行錯誤によって決定理想的な残留フィルムは、できるだけ薄いではないので、目組織表面の乾燥を蒸発させて可能にするためにある。
- クランプ鉗子でエッジカバーグラスを持ち、迅速に手動で、または重力駆動のプランジャーを用い、液体エタン中に浸す。
- 長期保存容器にカバースリップ所望の数を操作するのに十分な大きさ、LN 2の近くの発泡スチロールのボールに凍結したカバーガラスを配置します。 LN 2の下で押収しないアルミスクリューキャップ缶を推奨します。
培養された脳スライスの急速凍結
- 解剖顕微鏡下で、ビューと邪魔されず、まだ培養膜インサートに付属器官型海馬スライスを、向けます。黒シャーピー型ペンと写真でスライスのエッジ付近の膜上の基準マークを配置します。
- それでも、顕微鏡下で、約切り出す。正方形を中心とした個々のスライスに5×5ミリメートルの膜の正方形。スライスに触れたりmembranを曲げないE。
- （後述）cryoultramicrotomeに合うように作られたカスタム設計されたアルミニウム製ディスク上に、直径寒天パッドに¼によりクッション性の膜サポートスライスを、マウントします。急速に空気圧でカスタマイズされた「スラム凍結」装置を用いて、LN 2冷却型サファイアブロックに対してそれを推進することでスライスを凍結。
- 培養細胞について記載したようにストレージに移動します。
2。凍結切片
注意点は：正常に超薄切片のドライカットのリボンを生産する、簡単で論理的ながら、訓練、忍耐とかなりの練習が必要です。
- -135℃にcryoattachmentとクールな装備cryoultramicrotomeを焼く
- 約に凍結されたカバースリップをカット。シャープ、予備冷却メスを用いて3×3ミリメートルの正方形。培養物は、標準的な3に、粘性のある液体」cryoglue」に（エタノールの午前1時06分混合し、2 -プロパノール11）を上にして作品を埋め込 むミクロトーム試料チャックに適合するように設計直径のアルミニウムピン。培養表面上にcryoglueが漏れないようにしてください。 -160℃で≤するcryobox温度を下げることによってcryoglueを固める
- 凍結した脳スライスの場合は、しっかりとネジカラーを用いてカスタムメイドの試料チャックに直接ディスクを添付します。
- 約に-スライスのカバーガラス片または識別された領域の例えば 、細胞が豊富な地域-凍結した検体の選択された領域をトリミング。ダイヤモンドのトリミングツールを使用して250×250程度のブロック面と〜100μmの深さ。
- カリフォルニア州での薄い切片のドライカットのリボン。-160℃のreferencs 4、9に記載されて本質的に、35°のダイヤモンドcryoknifeを使用。切削速度とナイフ逃げ角を経験的に決定され、良好な出発点は、9°で0.4〜0.6ミリメートル/秒である。水和された部分の公称厚さ、 すなわち標本アドバンス、Iの項では、主に圧縮のために、実際には1.5-2.0倍厚いが、一般的には80nmだ。満足の切片化のため、静電気防止用器具が不可欠です。ナイフエッジからデバイス0.5〜1センチメートルのイオン化の先端を置き、セクション満足なリボンが生成されるまで、出力電力を調整します。
- 木製アプリケータースティックに（エポキシで）まつげを接着することによってまつげプローブを準備します。このようなプローブを使用し、100メッシュの銅グリッドを折り畳み、背後にある作業用の棚に折りインジウム箔封筒に載っ上にキャストグロー放電を行うと、炭素被覆PIOLOFORMの支持フィルム上にナイフの背面からピックアップし、転送部ナイフ。冷間プレスツールでグリッドと封筒の上半分には、を押します折り重なり。
- アルミ便利グリッドボックスとストアへの転送包まれたグリッドが、ステップ1.4で説明することができます。
3。電子顕微鏡の試料のクライオトランスファー
EPMAのコア測定器この研究室で120 kVので作動し、低温顕微鏡のために装備、つまり、クリーンな真空、試料面積anticontaminator、2K X 2Kの高感度デジタルカメラやクライオトランスファー試料ホルダーに設計された分析電子顕微鏡がある。両方の低·高倍率モードで顕微鏡のアライメントおよび動作条件を事前に確認して、理想的≤10 -7トル、満足なカラム真空を確認する。必要に応じてチューンアップする。
- cryoholderのデュワー部品の真空断熱が十分であることを確認します。必要に応じてポンプ。
- 顕微鏡ステージ内で高真空下にある間、その最低温度、少なくとも-160℃までcryoholderを冷却、そのコントロールボックスにホルダーを接続するケーブルを取り外す。オペレータおよび顕微鏡表面にこぼれるLN 2を最小化するためにホルダーを取り外す前に、角度計45°時計回りに傾けます。
- 一体型絶縁するを冷却することによりベンチトップcryoworkstationを準備160℃〜≤Dカップ
- 転送（quickly!）クライオワークステーションに顕微鏡から冷却cryoholder。保有者の霜シールドを撤回。
- LN 2 cryoworkstationの作業テーブル上のストレージと場所からグリッド·サンドイッチの下で取得します。ホルダの試料ウェルについての保持リングは、テーブル上に置かれる。
- インジウム封筒を開き、cryoholderの検体ウェルに囲まれた折りたたみグリッドを移動します。提供スパナツールを使用して、保持リングとグリッドを確保し、霜シールドを閉じます。
- 迅速cryoworkstationからcryoholderを削除して、顕微鏡のエアロックに挿入し、可能な限り迅速に、ポンピングシーケンスを通過。挿入時に、カラム真空の中断を最小限に抑えるがあるはずです。
- 0°チルト角度計を返します。再接続してreenergizeコントロールボックスを、試料温度が150℃≤であることを確認
- のデュワーを補充試料ホルダーと真空と温度が完全に回復することができます。
4。セクションの視覚的な調査
- 試料を露出し、電子ビームをオンにするホルダーの霜シールドを後退させる。
- 視覚的には低倍率、通常は250倍、低照度での試料を評価する。 図1に示されるように、セクションでは、薄くて滑らかで、折り畳まれていないか、または重複し、平らで十分に支持膜に付着してもよく、一般的には、グリッド·バーで隠さないようにしてください。
- 必要に応じて選択した部分を撮影しています。 （注：凍結した水和の項では、ビーム誘起損傷を非常に受けやすいことから、ビーム露光を最小限に抑えます。）選択したセクションの座標を保存するために自動化されたデジタルゴニオステージを使用してください。
5。セクションの凍結乾燥
- 凍結乾燥切片を約するホルダ温度を増加させることによって-100°C〜30分間。
- 下の-160℃以下にホルダーを再冷却。
6。細胞およびオルガネラのイメージング
凍結乾燥されたセクションの構造の画像は、約で得られる。 -160°Cのような低用量、適切なソフトウェアによって制御さ2kのX 2kのスロースキャンCCDカメラを用いてデジタル的に記録されたゼロロス像。
- こんにちは-MAGモードでEMをアクティブにします。
- 選択したセルや場所、以前に記録し、保存した高品質のセクションへの関心の細胞内の領域（TIFFのように、 図2を参照）〜2000 xで選択した画像。 （注：乾燥した切片は、現在実質的に壊れにくく、電子ビームによる損傷を受けにくい。
- X線分析のための関心領域（ROI）を選択するために画像を評価する。このステップは、必要に応じてEMをオンにすることができる場合には、オフラインで行うことができるオフし、室温まで温めた試料。
7。 X線スペクトルの取得
X線スペクトルは、最小エネルギー分散型X線（EDX）検出器、関連するパルスプロセッサエレクトロニクスと互換取得および表示ソフトウェアからなるいくつかの商用またはカスタム設計されたX線分析装置のいずれかを用いて記録することができる。 （このラボで使用されるシステムは、 表1に記載されている。）
- 、コラム（必要な場合）にEDX検出器を挿入する対物絞りを撤回し、浮遊放射開口部を挿入し、センタリングにより、X線取得のためのEMを構成します。試料の霜汚染が回避される最低温度にcryoholderを調整するが、少なくとも-100℃以下の
- ホルダの検出器に向けて20°に傾けます。
- 広視野撮像条件の下で、一方がindividuaのマトリックスを分析しようとすると仮定しLのミトコンドリアは、分析のためのミトコンドリアを選択するフィールドの中央に移動し、焦点を当てています。
- 100 nmのスポットにスポットモード（一部の顕微鏡にちょうど第二凝縮フォーカスを用いたビームを集束）に移動し、CAにビーム電流を大きくしてください。3 NA（ファラデーカップまたは類似で測定した）。
- スペクトル取得ソフトウェアを起動し、表示モニターにライブの時間を表示することができます100秒の買収を、開始します。記録されたスペクトル（ 図2）を保存します。業界標準のEMSA形式が好ましい。
- EMをシャットダウンして（オフライン）分析ワークステーションに複数のスペクトルのファイルを転送します。
8。 X線スペクトルの解析
定性分析
EDXスペクトル（ 図2、挿入図）は、本質的なエネルギー対のX線強度のX-Yプロットである。スペクトルはTの元素組成についての定性的および定量的な情報が含まれていますピークの「特徴」エネルギーは強度がその要素の量を反映しながら、そのピークを生じさせる要素を識別するという点で、彼は、ボリュームを分析した。特徴的なピークは「連続体」、ゆっくりと変化する背景の上に乗っている。 （ 図2伝説がさらにEDXスペクトルの顕著な詳細を説明します。）全体の周期表のピーク多様体のエネルギーは、要素のよく知られた電子構造、自動的にコンポーネントを識別し、データベースへのため、すべてのEDXソフトウェアリンクによって定義されています分析対象。生理的な文脈では、EDX分析に非常に適している一般的な関心の要素は、NA（1.04 keVの時のKα）、P（2.01 keVの）、K（3.31 keVの）、およびCa（3.69 keVの）が含まれています。
- スペクトル中の主要な要素を識別するために利用可能なソフトウェア·データベースとピーク·マッチング·ルーチンを活用。生体試料中のNa、Mgを、P、S、CL、K、およびCAのピークを見つけることを期待しています。 （注意：最後の2つの要素が重なって！）
定量分析
EDXスペクトルの定量分析は、同定されたピークの積分面積を抽出し、この濃度値を変換することからなる。生物学的分析のために、確立されたアプローチは、（上記および図2で定義された）連続体の強度が分析され、ボリュームの乾燥質量に比例するという事実を利用するホールピーク/連続法4,7,10、ある。既知の組成の標準のスペクトルの同じ比率と比較した場合、これにより、ピーク面積/連続面積の比は、標的細胞区画中の濃度を特定する。このアプローチは、一般的ミリモル/ kg乾燥重量として表される重量当たりのモル単位での濃度を、提供することに注意してください。このユニットは珍しいとELが説明されているように解釈のため、例えば、ミリモル/ Lの湿重量またはモル/ mgタンパク質に付加的な変換が必要な場合があります4,10を sewhere。
- Z = 10〜20（0.5〜4.0 keVの）との間の生物学的エレメントのピーク面積（及び誤差推定値）を抽出する、 すなわちナトリウム、およびMg、P、S、Clで、K、およびCa、解析ソフトウェアに組み込まれたフィッティングルーチンのいずれかを使用して（特に4脚注、 表1を参照）。このラボでは、シンプレックスまたは複数の最小二乗フィッティングを使用しています。このフィッティングは、KおよびCaのピークの間のオーバーラップをします（ 図2を参照） を解決するには十分注意が必要であることに注意してください。
- 1.45から1.61 keVの連続体を統合する。代替的な干渉のない領域を使用することができる。
- 標準との比較により、ピーク/連続比および濃度を計算します。分析を通じてエラーを伝播する。
- 生物学的変動を反映して平均値を推定するために、標準的な統計ソフトウェアや数式を使用してください。
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Representative Results
脳細胞は通常、虚血状態下で起こる病的な神経伝達物質の放出の結果として、興奮毒性損傷を維持する。 EPMAはカルシウムを大量に隔離する神経細胞のミトコンドリアの能力は、損傷のメカニズムの基礎となる方法を発見する重要でした。 図3の電子顕微鏡写真は、急速に興奮毒性刺激（100μMNMDA）へ30分間曝露した後に凍結培養海馬ニューロンの凍結乾燥した凍結切片におけるミトコンドリアの外観を表したものである。彼らは非常に腫れている、小さな、暗い介在物（赤い矢印）が含まれているように、ほとんどのミトコンドリアは、構造的に破損しているように見える。ミトコンドリア介在物（ 図3、赤と青のスペクトルのそれぞれ）内および（「マトリックス」）の排他的な元素分析を行うのに十分な解像度を有するEPMAは、介在物は、主にカルシウム及びリンから構成されていることが明らかになった。非常に高いカルシウムCONこれらの介在物の10トン- 〜1300ミリモル/ kg乾燥重量のに対し、<1ミリモル/ kgのミトコンドリアを休んでの典型的なものである-彼らの異常なカルシウム緩衝能を説明し、なぜ圧倒的なこのバッファリング機構は、カルシウム過負荷誘発される細胞死を11につながる。
海馬は、学習と記憶のための重要な脳の領域は、虚血後損傷の主要な部位である。興味深いことに、かつ治療が重要、CA3という機能的に異なる領域をはるかに脆弱で虚血性損傷に隣接し、シナプス接続CA1領域であるよりある。 EMPA分析は- その場の構造および機能（ 図4の顕微鏡写真） で維持海馬切片の特定領域の凍結切片と関連して-有毒な刺激が（耐性隣接CA3ニューロンにおけるよりも脆弱なCA1ニューロンにおけるはるかに大きなカルシウムの上昇を誘導することを示すために使用された図4は 、バーグラフ）。その結果、CA1ミトコンドリアの DRIAは、Ca 2 +過負荷によって誘導されるミトコンドリア機能障害がCA1ニューロン13の選択的脆弱性の決定要因であることを示し、大規模な損傷および機能不全を呈する。
図1。 PIOLOFORM膜上に支持凍結水和凍結切片の2つのリボンの低倍率の電子顕微鏡写真。良い製剤特性最小限に断片化されたセクションは、よく付着し、平坦含む、図示されている。膜は、電子ビームの下でさらに涙のように支持フィルム中の裂け目を有するグリッド正方形は、避けるべきである。解析のための完全に適切な2マスはアスタリスクで表示されます。 = 100ミクロンスケールバー。
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図2。 EPMAによるオルガネラ元素組成の定量分析。低用量、交感神経ニューロンのデジタル走査型透過電子顕微鏡写真から調製された凍結乾燥した凍結切片中で急速に凍結された制御神経節は、そのような標本で達成可能な詳細を示す。シャープ、細胞膜、小胞体と豊富なミトコンドリアのよく保存スタックを注意挿入図 - 。赤い点で示されるように、ミトコンドリアマトリックスの典型的な領域から記録されたEDXスペクトル。主要なK殻X線のピークに対応する要素が識別され、カリウムおよびカルシウムの場合には、代替の電子遷移に起因する2 K殻線が解決され、K個のαとKと示さβ標準分光表記に従った。スペクトルは、生きている神経細胞の主要な要素の典型的な分布を示す。この細胞区画の質量密度を反映して例えば 1.5から1.8または2.8から3.1 keVのゆっくりと変化する連続放射を、注意してください。健康な細胞中のカルシウムの定量分析は、カリウムKのβおよびカルシウムKαピークの重なりを生じさせる（150mMのとほぼ同等の約 500ミリモル/ kg乾燥重量）、カリウム、比較的高レベルの存在によって複雑になるEDXスペクトルである。この重複をデコンボリューションするための標準的なアルゴリズムがある。スケールバーは、1μmを表しています。
図3。興奮毒性刺激は、個々のミトコンドリア内の変数と局所的なカルシウム蓄積を誘導する。から調製された凍結乾燥された凍結切片のデジタル透過型電子顕微鏡写真未固定、急速凍結した海馬の細胞培養は、グルタミン酸受容体（30分間、100μMNMDA）のNMDAサブタイプの興奮毒性刺激した後、小さな、自然に高電子密度、点状のインクルージョン（赤い矢印）を含有する、多数のミトコンドリアを示しています。対応するX線スペクトル、毒性、刺激が増大し、Naピークによって証明されるように、イオン恒常性の喪失をもたらし、封入フリーミトコンドリアマトリックス（青色の矢印とスペクトル）にKピークを低減することを実証する。赤色スペクトルの大きなCaのピークはまた、リンおよび酸素を大量に含有する介在物の特性に局在強力なミトコンドリアカルシウム蓄積を反映している。介在物と行列内の平均Ca濃度は、それぞれ〜1300および〜60ミリモル/ kg乾重量であった。スケールバーは、500nmを表す。
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図4。ミトコンドリアのカルシウム過負荷は、海馬CA1ニューロンの選択的虚血性脆弱性の原因である 左パネル - 。急速に虚血模倣条件（100μMのNMDA）の下で凍結した器官型海馬スライス培養のCA3とCA1領域の細胞体の凍結切片の電子顕微鏡写真。 右側のパネル - EPMAは、ミトコンドリアのカルシウム含有量の分析は、化学虚血が隣接する、虚血耐性のCA3ニューロン（NMDA-曝露CA1に*、P <0.05と比較して）よりも脆弱CA1ニューロンのミトコンドリアにはるかに大きなカルシウム上昇を誘導することを示す。 NMDA誘発カルシウム過負荷はNMDAR拮抗薬MK-801によって廃止された。スケールバーは2μmで表しています。
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Discussion
ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に保持されながらも、従来の固定された、プラスチック包埋調製物構造品質に匹敵する電子画像を記録するために必要とされないことに留意されたい。
構造調査画像は低印加電子線量で記録されているが、はるかに高い用量が良好な統計値を得るのに十分な計数率でX線放射を誘発するために必要とされる。したがって、EMPAに便利顕微鏡は高電流集中プローブを形成することができなければならない。2-5 nAの25〜50ナノメートルに、ER嚢やシナプス小胞のような細胞小器官を包囲するのに適した、許容可能である。この最小限の高輝度六ホウ化ランタンの電子銃が必要になります。これらの楽器の条件下では、1月10日ミリモル/ kg乾燥重量の典型的な組織濃度のカルシウムを定量的に〜100秒のライブ時間の±0.1ミリモル/ kgの標準エラー出力に分析することができます。それはマイナーカリウムラインの主なカルシウムX線ラインの不幸な重複がなければカルシウム分析の感度が大幅に改善されるのデコンボリューションは、カルシウムシグナルの統合に重要な不確実性を追加します（については、図1の説明を参照詳細）。生理学的、特に病理学、ミトコンドリアのカルシウム蓄積（ 図2-3）の間に起こるように、ローカルのカルシウム濃度が異常に高いときに説明し、境界条件が大幅に緩和されていることに注意してください。
数々のsuccessfにもかかわらず、uLのアプリケーションは、EPMAは、特に効率的な手法ではないことが明らかであるので、データ·スループットを向上させるために多くの動機がある。三つの有望な手段はここに記載されている：EDXの代わりに、1）電子エネルギー損失分光法（EELS）、2）二次元要素ではなく、点プローブのマッピングし、3）以降、最先端のインスツルメンテーション。むしろ放射されるX線を集めるよりも、EELS電子/原子衝突後のエネルギーの特徴、要素、具体的な量を失っている記録入射電子によって異なります。統計的に、EELSは本質的に、EDX、EELSおよびハードウェアとソフトウェアより〜4倍優れている今、生物学者のための実用的に成熟している。 （生物学におけるEELSアプリケーションのレビューのための参考文献6,2を参照してください。）
また、新しい高スループットのSi-ドリフトEDX検出器により、以下を参照してください- - EELSが提供する改善された感度は、分析ごとに短い滞留時間、 例えばミリ秒ではなく、時間ができます秒のundreds、したがって、合理的な時間内に選択されたエリアのデジタル地図を生成する機能。一例として、128×128カルシウムマップは、1時間〜1に記録することができる。いくつかの要素に関する情報が記録された「データキューブ」に埋め込 まれているので、「スペクトルイメージング」として知られている6,2このアプローチは、（x 対 。 対 E y）は、各画素において完全なEELSスペクトルを提供することに留意されたい。
最後に、プロトコルセクションで説明したように、20年以上前に開発された、本システムであるため、機器の技術と性能における実質的な進歩があった。今日セットアップさEMPAラボで絶対条件となり、最先端の技術が含まれます：サブナノメートルサイズのスポットへの電流のいくつかのナノアンペア（NA）をポンプすることができます1）高輝度電界放出電子銃; 2 ）最大化されたX線収集効率及びスループット8のための大面積のシリコンドリフト検出器、3）現代のソフトウェアスペクトル取得、分析、定量化のための優れた柔軟性とパフォーマンスを提供しています。このようなソフトウェアパッケージは、ほとんどのメーカーから市販されており、DTSAソフトウェア、DTSA IIの代わりに、更新され、改良されたバージョン、（ 表1、脚注4を参照のこと）、NISTから無償で提供されています。ちょうど説明された特徴は、任意の自動化の上面および/または塩基型電子顕微鏡で使用可能なロボットである。
EMPAプロトコル説明したように、例えば、神経変性の細胞メカニズムを明らかにすることを助ける、神経科学に関心のあるいくつかの問題を攻撃するため、それ自体は非常に有用であることが証明されました。ただ、推奨改善を考慮すると、EMPAは、今後の研究に固体貢献であり続けなければならない。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を報告していません。
Acknowledgments
私たちは、優れた技術支援のために氏クリスティーヌA.冬を感謝したいと思います。この作品は、NINDS学内研究プログラム、NIH（Z01 NS002610）の基本神経科学プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
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References
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
