Измерение общего кальция в нейронах помощью электронно-зондового рентгеновского микроанализа

Summary

Эта статья описывает применение cryoanalytical электронной микроскопии для количественного определения общего содержания кальция и распространения на субклеточном резолюции в физиологически определенных биологических образцов.

Abstract

В этой статье инструменты, методы и инструменты, подходящие для количественных измерений внутриклеточного содержания элементов с помощью метода, известного как электронно-зондового микроанализа (EPMA) описаны. Внутримитохондриальной кальция является особое внимание в связи с важной ролью, что митохондриальная перегрузки кальция играет в нейродегенеративных заболеваний. Метод основан на анализе рентгеновских лучей, генерируемого с помощью электронного микроскопа (ЭМ) при взаимодействии электронного пучка с образцом. В целях сохранения нативного распределение диффундирующих элементов в микроскопии образцов электрона, EPMA требует "cryofixation" из ткани с последующим подготовки ультратонких криосрезов. Быстрое замораживание культивируемых клеток или органотипических культур срез осуществляется путем погружения замораживания в жидком этана или шлема замораживания против холодного металлического блока, соответственно. Криосрезы номинально 80 нм обрезаются сухие с алмазным ножом на ок. -16076, С, установленный на углерод / pioloform покрытием медных сетей, и cryotransferred в крио-ЭМ, используя специализированный держатель cryospecimen. После визуального осмотра и отображения местоположения на ≤ -160 ° С и низкой дозы электронов, замороженные гидратированных криосрезы лиофилизируют при -100 ° С в течение ~ 30 мин. Изображения на уровне органелл высушенных криосрезов записаны, также в низкой дозе, с помощью ПЗС-камеры медленного сканирования и субклеточных регионах, представляющих интерес, выбранной для анализа. Рентгеновские лучи, испускаемые трансформирования стационарным, целенаправленной, высокой интенсивности электронного зонда собирают энергии-рентгеновской (EDX) спектрометра, обрабатывается, связанных электроники, и представлены в качестве рентгеновском спектре, то есть, Сюжет интенсивности рентгеновского излучения по сравнению энергии. Дополнительное ПО облегчает: 1) идентификацию элементарных компонентов по их "характерных" пиковых энергий и отпечатков пальцев, и 2) количественный анализ по добыче пиков / фон. Эта статья завершается двумя примерами, которые иллюстрируют типичныйПриложений EPMA, в котором митохондриальный анализ кальций обеспечивает необходимую понимание механизмов эксайтотоксичного травмы и другой, которые показали основе устойчивости к ишемии.

Introduction

Ионы кальция, возможно, наиболее важным и универсальным лицо клеточной сигнализации в биологии, играя важную роль в нормальных процессов как разнообразны, как и синаптической передачи и экспрессии генов. С другой стороны, кальций не менее важно в гибели клеток. В частности, дерегулирование кальция является ключевым фактором в нейронной травмы при инсульте, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний ^3,5. Таким образом, крайне важно, чтобы количественно понять, как кальций распределяется в клетках, и как это меняет следующие физиологических или патофизиологических раздражители. Эта цель осложняется тем, что кальций динамически распределяется между двумя физическими состояниями - бесплатно в растворе или связанного с подложкой - и что концентрации сотовой кальция меняться с течением несколько порядков, как следствие стимуляции.

Хотя Есть несколько передовых методологий, имеющихся для анализа фри ее внутриклеточный кальций, определение общей концентрации кальция в определенных внутриклеточных отсеков реально ограничивается одним подхода, а именно, зондовый микроанализ электронов (EPMA). EPMA является метод, который пары рентгеновский спектрометр для просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). ТЕМ электронная пушка фокусируется стационарный, субмикронного электронный зонд на субклеточном интересующей области и элементов конкретных рентгеновского излучения в результате электронной бомбардировки собираются и анализируются (см. ссылки ^{7, 4} для подробных технических обзоров). Преимущества EPMA включают одной резолюции органелл уровня и submillimolar чувствительность. На практике, однако, EPMA требует специализированных cryotechniques и аппаратуры для подготовки и анализа образцов. Здесь инструменты, методы и инструменты, подходящие для измерения внутриклеточного кальция с использованием ЭЗМА описаны. Внутримитохондриальной кальция представляет особый Iпроценты в связи с важной роли, которую играет митохондриальные перегрузки кальция в нейродегенеративных заболеваний.

Protocol

Описанный здесь подход был разработан с использованием конкретных инструментов, инструментов и программного обеспечения. Потому что лаборатории не будет использоваться та же экспериментальная установка подход обобщается, где это возможно.

1. Быстрое замораживание

Аналитический метод, который будет описан абсолютно зависит от криогенных подходов для: 1) "cryofixation" клеток или тканей таким образом, чтобы количественно сохраняет распределение компонентов диффундирующих тканей и химических элементов, как они были в живых клетках в момент замораживания и 2) подготовка сверхтонких криосрезы подходит для работы с изображениями и анализа в ПЭМ. Эти методы кратко описаны здесь, но детали, необходимые для воспроизведения этих процедур в других лабораториях выходят за рамки данной статьи. Заинтересованные читатели могут обратиться к превосходным последних статей ^9,14.

Внимание: В этом разделе описывается использование жидкого мылаefied этан, который легко воспламеняется и потенциально взрывоопасной; соответствующие меры предосторожности должны быть приняты. Оператор также должен быть знаком с жидким азотом (LN ₂₎ меры безопасности, в том числе защитной халате, в очках, и cryoresistant перчатки. Примечание: Здесь и далее, все инструменты (щипцы и т.д.) используются для обработки замороженные образцы должны быть предварительно охлажденный в LN ₂ перед использованием, чтобы избежать случайного размораживания.

Искусственный клетки на покровные

1. Подготовьте устройство замораживания глубоководный при конденсации газообразного этана в -160 ° C в Л.Н. ₂ охлаждением центрального колодца. Заполните на должном уровне и покрыть хорошо с крышкой поворота алюминиевой когда он не используется.
2. С использованием фильтровальной бумаги клинья, промокните пластиковые покровные культивируемых клеток под экспериментально соответствующих условиях до тонкой водной пленки. Пятно от края таким образом, чтобы они не соприкасались ткани; идеальным остаточная пленка, определяется методом проб и ошибок, это как можно тоньше, но не настолько йв качестве испаряться, и дать высохнуть на поверхности ткани.
3. Проведение покровное по краю с зажимными щипцами, быстро погружают в жидкий этан, либо вручную, либо с помощью силы тяжести питанием поршень.
4. Поместите замороженные покровное в соседнем пенополистирола миску LN _2, достаточно большой, чтобы манипулировать нужное количество покровных в долгосрочные контейнеров для хранения. Алюминиевый колпачок банки, которые не захватить под LN ₂ рекомендуется.

Быстрое замораживание культивируемых срезах мозга

5. Под микроскопом рассекает, вид и сориентироваться органотипической гиппокампа ломтик, спокойно и по-прежнему прикрепленный к культуре мембраны вставки. Наведите координатных меток на мембране вблизи края среза с черным Находчивый типа пера и фотографии.
6. Тем не менее под микроскопом, вырезать ок. 5 х 5 мм мембрана квадраты с отдельными кусочками, сосредоточенных на площадях. Старайтесь не прикасаться срез или изгиб MEMBRANэ.
7. Установите с мембраной поддерживается кусочек, мягкая на ¼ в диаметр агар площадку, на специально созданных алюминиевого диска сделал, чтобы соответствовать cryoultramicrotome (см. ниже). Быстро заморозить кусочек по пневматическим метательным его против Л.Н. ₂ охлаждением сапфирового блока с помощью настроенной "слэм замерзания" устройства.
8. Переход к хранению, как описано в культивируемых клетках.

2. Cryosectioning

Предостережение: успешно производит сухие нарезанные ленты ультратонких срезов, а просто и логично, требует подготовки, терпения и значительной практики.

1. Выпекать вне cryoultramicrotome оснащенный cryoattachment и охлаждают до -135 ° С.
2. Вырезать замороженные покровные в ок. 3 х 3 мм квадраты, используя острый, предварительно охлажденного скальпель. Вставить куски с культурами вверх в вязкой жидкости "cryoglue" (A 1:06 смеси этанола и 2-пропанола ^11), на стандартном 3мм диаметр булавки алюминиевые разработаны, чтобы соответствовать микротоме образца патрона. Не допускайте утечки cryoglue на поверхность культуры. Укрепить cryoglue путем понижения температуры cryobox до ≤ -160 ° С.
   • Для замороженных срезах мозга, надежно закрепить диски прямо на заказ образца патрона с помощью винтовой воротником.
3. Обрежьте выбранные участки замороженных образцов - например, мобильные богатых районах покровное части или определенных областях ломтиками - к прим. Блок лицо 250 х 250 мкм и ~ 100 глубина мкм с помощью инструмента алмазного обрезки.
4. Сухой резки ленты тонких срезов в ок. -160 ° С с использованием 35 ° алмазного cryoknife, по существу, как описано в referencs ^{4, 9.} Скорость резания и задний угол нож определяются эмпирически; хорошая отправная точка составляет 0,4-0,6 мм / сек при 9 °. Номинальная толщина, то есть образец заранее, гидратированных секциях яы обычно 80 нм, хотя на самом деле секции 1.5-2.0x толще, в основном за счет сжатия. Для удовлетворительного срезов, антистатической устройство имеет важное значение. Поместите ионизирующего конца устройства 0,5-1 см от ножа и отрегулировать выходную мощность до удовлетворительные ленты разделами производятся.
5. Подготовьте ресниц зондов путем склеивания (с эпоксидной смолой) ресницы к деревянным аппликатором палками. Использование такой зонд, и трансфер сечения из задней части ножа Onto свечения разряженный, углерода покрытием поддержки pioloform фильмов, поданных более чем 100-сетки складывающиеся медных сетей и отдыха на половину сложенный индия фольги конверт на рабочей полке позади нож. Раза по сравнению с верхней половины сетки и конверт, нажмите с холодного прессования инструмента.
6. Передача завернутые сетки в удобной коробке сетки и хранить в алюминиевом как описано в шаге 1.4.

3. Cryotransfer из образцов в электронный микроскоп

Ядро инструментом EPMAВ этой лаборатории представляет собой аналитический электронный микроскоп работает при 120 кВ и оборудованы для cryomicroscopy, то есть, предназначенный чистой вакууме, образец-области anticontaminator, в 2k 2k х высокой чувствительности цифровой камеры и держателем cryotransfer образца. Проверьте заранее выравнивание микроскопа и условия эксплуатации в обоих режимах с низким и большим увеличением и подтвердите удовлетворительное Вакуумная колонна, в идеале ≤ 10 ^-7 мм рт.ст.. Настройтесь, как это необходимо.

1. Убедитесь, что вакуумная изоляция компонента Дьюара в cryoholder удовлетворительное. Насос по мере необходимости.
2. Охладите cryoholder его минимальной температуры, по крайней мере, -160 ° C, в то время как в высоком вакууме в течение столик микроскопа; отсоединить кабель, соединяющий держатель в коробке управления. Наклоните гониометра 45 ° по часовой стрелке, прежде чем снимать держатель для минимизации LN ₂ проливая на оператора и микроскопа поверхностей.
3. Подготовьте настольный cryoworkstation охлаждением интегральное изолироватьг стакана до ≤ 160 ° C.
4. Передача (quickly!) охлажденный cryoholder от микроскопом, чтобы крио станцию. Уберите от замерзания щит его владельца.
5. Получить под LN ₂ сэндвич сетка из хранилища и места на рабочем столе в cryoworkstation. Кольцо стопорное для пробы владельца будет также размещена на столе.
6. Откройте индия конверт и двигаться прилагаемую складной сетку для образца лунку cryoholder. Закрепите сетку с стопорное кольцо с помощью инструмента гаечный ключ для и закрыть мороза щит.
7. Быстро удалить cryoholder от cryoworkstation и вставьте в шлюз микроскопа и пройти последовательности насосной как можно быстрее. На вставке, должно быть минимальным ущербом вакуума колонки.
8. Вернуться гониометра до 0 ° наклона. Подключите и оживления блок управления и убедитесь, что температура образца ≤ 150 ° C.
9. Пополните дьюареДержатель образцов и позволяют вакуум и температура, чтобы полностью восстановиться.

4. Визуальный обзор разделов

1. Уберите мороза щит держателя подвергать образец и включите электронного пучка.
2. Визуально оценить образец при малом увеличении, обычно 250X и низкой освещенности. Как показано на рисунке 1, секции должны быть тонкими и гладкими, не сложить или перекрытия, плоские и хорошо прикреплен к опорной фильма, да и вообще не видно из-за сетки баров.
3. При желании сфотографировать выбранные разделы. (ПРИМЕЧАНИЕ: Свести к минимуму воздействие луча, так как замороженные гидратированных разделы очень чувствительны к повреждениям луча-индуцированной.) Используйте автоматическую этап цифровой гониометра для хранения координаты выбранных разделов.

5. Лиофилизация разделов

1. Freeze-сухие участки, увеличивая температуру держатель для ок. -100 ° C для ~ 30 мин.
2. Recool держатель до -160 ° С или ниже.

6. Визуализация клеток и органелл

Структурные изображения лиофилизированных секций получены при ок. -160 ° C, а в низких дозах, нулевой потери изображения, записанные в цифровом использовании 2k х 2k с медленной разверткой ПЗС-камеры контролируется соответствующим программным обеспечением.

1. Активируйте EM в режиме привет-маг.
2. Выбрать и изображения на ~ 2000 X (как TIFFs, см. рисунок 2) выбранные ячейки и субклеточных областях, представляющих интерес в качественных участков, местоположение которых ранее были записаны и сохранены. (ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные разделы теперь существенно менее хрупкими и менее восприимчивы к повреждениям электронного пучка.
3. Оценка фотографий, чтобы выбрать интересующие участки (Rois) для рентгеноструктурного анализа. Этот шаг может быть необязательно выполнены в автономном режиме, и в этом случае EM может быть включенс, а образец оставляли нагреваться до комнатной температуры.

7. Приобретение Рентгеновские спектры

Рентгеновские спектры могут быть записаны с использованием любого из нескольких коммерческих или специально разработанный рентгеновский анализ системы минимально, состоящие из рентгеновских лучей (EDX) детектора энергии-дисперсионные, связанных импульсно-процессорных электроники и совместимым определение и отображение программного обеспечения. (Система, используемая в этой лаборатории описана в таблице 1.)

1. Настройте EM для приобретения рентгеновского, вставив детектор EDX в колонну (при необходимости), снятия объективную диафрагму, и вставки и центрирования любые беспризорные излучения отверстия. Отрегулируйте cryoholder самой низкой температуре, при которой мороз загрязнение образца избежать, но по крайней мере ниже -100 ° С
2. Наклоните держатель 20 ° по отношению к детектору.
3. В условиях формирования изображения шириной поля, и предполагая, один намерен проанализировать матрицу с индивидовл митохондрии, выбрать митохондрии для анализа, переместить его в центре поля и сосредоточиться.
4. Переход в режим точечной (на некоторых микроскопов просто сходятся луч с помощью второй фокус конденсатор) и увеличить ток пучка в прим. 3 нА (при измерении с Фарадея или аналогичный) в пятно 100 нм.
5. Запустите программу приобретения спектр и начать 100 приобретений сек, которые могут быть просмотрены живой времени на экране монитора. Сохранить записанный спектр (рис. 2). Предпочтительным является отраслевым стандартом формат EMSA.
6. Выключите EM и передать файл (ы) с несколькими спектров к (Offline) станции анализа.

8. Анализ рентгеновских спектрах

Качественный анализ

EDX спектр (рис. 2, вставка), по существу, ху график интенсивности рентгеновского против энергии. Спектры содержат качественную и количественную информацию о элементного состава тон проанализировал объем, в том, что «характерной» энергии пика идентифицирует элемент порождая этого пика в то время как интенсивность отражает количество этого элемента. Характерные пики ездить на вершине медленно меняющейся фоне, в «континуума». (Легенда Рисунок 2 далее обсуждает существенные детали спектров EDX.) Энергия пиковых коллекторы для всей периодической таблицы определяются известной электронной структуры элементов, таким образом всех программных EDX ссылки на базы данных, которая автоматически идентифицирует компоненты Аналит. В физиологическом контексте, элементы, представляющие общий интерес, которые хорошо подходят для анализа EDX включают Na (K _α на 1,04 кэВ), P (2,01 кэВ), K (3.31 кэВ) и Ca (3,69 кэВ).

1. Воспользуйтесь доступны программного обеспечения базы данных и пик согласующих процедур для выявления основных элементов в спектрах. В биологическом образце рассчитывают найти пики для Na, Mg, P, S, Cl, K и Са. (ВНИМАНИЕ:Последние два элемента перекрываются!)

Количественный анализ

Количественный анализ спектров EDX заключается в извлечении интегрированную площадь выявленных пиков и преобразования этого значения до концентрации. Для биологического анализа, установлено, подход является метод пик / континуум Hall ^4,7,10, который использует тот факт, что интенсивность континуума (определенный выше, и на фиг.2) пропорциональна массе сухого вещества анализируемого объема . Таким образом, отношение площади пика область / континуума, по сравнению с тем же соотношением в спектрах стандартам известного состава, указывает концентрацию в целевой сотовой отсеке. Следует отметить, что этот подход обеспечивает концентраций в единицах молей на весу, обычно выражается в виде ммоль / кг сухого веса. Это устройство является необычным и для интерпретации может потребоваться дополнительное преобразование в, например, ммоль / л сырой вес или ммоль / мг белка, как описано ELsewhere ^4,10.

2. Выписка пиков (и оценки погрешности) биологических элементов между Z = 10-20 (0,5-4,0 кэВ), то есть Na, Mg, P, S, Cl, К, Са, используя один из установочных процедур, встроенный в программное обеспечение для анализа (см. таблицу 1, особенно примечание 4). Эта лаборатория использует Simplex или несколько-наименьших квадратов фитинг. Заметим, что это уместно требует особого внимания к решению перекрытие между К и Са пиков (см. рисунок 2).
3. Интеграция континуум между 1.45-1.61 кэВ. Альтернативные без помех регионы могут быть использованы.
4. Рассчитать коэффициенты пик / континуума, а затем концентраций по сравнению с стандартами. Propagate ошибок по всему анализа.
5. Используйте стандартный статистического программного обеспечения и формулы для оценки средние, которые отражают биологическую изменчивость.

Representative Results

Клетки мозга, как правило, поддерживать эксайтотоксический травмы в результате патологического высвобождения нейромедиаторов, которое происходит при ишемических состояний. EPMA имеет решающее значение для открытия, как способность нейронов митохондрий поглощать огромное количество кальция лежит механизм травмы. Электронно-микроскопический снимок на рисунке 3 иллюстрирует вид митохондрий в лиофилизированных криосрезов культивируемых нейронах гиппокампа быстро замораживают после 30 мин воздействия эксцитотоксического стимула (100 мкМ NMDA). Большинство митохондрии появляются в структурном повреждении, так как они очень опухшие и содержат небольшие, темные включения (красные стрелки). EPMA, который имеет разрешение, достаточное для выполнения элементного анализа в рамках и без учета ("матрицы") митохондриальные включений (рис. 3, красного и синего спектров, соответственно), показал, что включения в значительной степени состоит из кальция и фосфора. Чрезвычайно высокая кон кальцияпалатка этих включений - ~ 1300 ммоль / кг сухой массы, в то время как <1 ммоль / кг является типичным отдыхает митохондрии - объясняет их необыкновенную способность кальций-буферизации, и почему подавляющее этот механизм буферизации приводит к кальция перегрузки-срабатывает гибели клеток ^11.

Гиппокамп, область мозга критической для обучения и памяти, является основным местом травмы после ишемии. Интересно, а терапевтически важно, функционально отличаются область названа СА3 гораздо менее уязвимы для ишемического повреждения, чем соседний, синаптически связано АК1 область. Анализ ЕМРА - в сочетании с криосрезов конкретных регионах срезах гиппокампа, которые поддерживают в структуре месте и функции (рис. 4, микрофотография) - был использован, чтобы показать, что токсичные стимулы вызывают гораздо большие высоты кальция в уязвимых нейронов СА1, чем в резистентных соседних нейронов СА3 ( Рисунок 4, гистограмма). Следовательно, АК1 митохондрий Dria демонстрируют обширную травму и дисфункции, указывая, что Са ^{2 +-перегрузки,} вызванной митохондриальная дисфункция является определяющим фактором в селективном уязвимости СА1 нейронов ^13.

Рисунок 1. Низкая увеличения электронная микрофотография двумя лентами замороженных гидратированных криосрезов поддерживаемых на pioloform фильма. Характеристики хорошей подготовки проиллюстрированы, в том числе плоских, хорошо держится, минимально фрагментированные разделах. Сетки квадратов с разрывами в опорной пленкой следует избегать, так как пленка слезы далее по электронным пучком. Два квадрата полностью подходящие для анализа, обозначены звездочками. Шкала бар = 100 мкм.

"FO: Пребывание" / files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Количественный анализ органелл элементного состава по EPMA. Низкие дозы, цифровой сканирующей просвечивающей электронной микрофотографии симпатической нейрона в лиофилизированной cryosection, полученного из быстро замороженной управления ганглия иллюстрирует деталь достижимую в таких образцах. Обратите внимание на резкое плазматическую мембрану хорошей сохранности стеки эндоплазматического ретикулума и обильные митохондрий Вставка -. EDX спектр записан с типичной области митохондриального матрикса, как указано в красной точкой. Элементы, соответствующие основным K оболочки рентгеновских пиков обозначены; в случае калия и кальция, два К-оболочки линии, вытекающие из альтернативных электронных переходов будут решены, как указано K _α и K _β в соответствии со стандартом спектроскопического записи. Спектр иллюстрирует типичное распределение основных элементов в живых нейронов. Обратите внимание на медленно меняющуюся континуум излучения, например между 1,5-1,8 или 2,8-3,1 кэВ, который отражает массовую плотность этой клеточной отсека. Количественный анализ кальция в здоровых клетках осложняется присутствии относительно высоких уровней калия (ок. 500 ммоль / кг сухого веса, приблизительно эквивалентна 150 мм), что приводит к перекрытию К калий и кальций _β K _α пиков в спектре EDX. Существуют стандартные алгоритмы деконволюции этих факторов. Шкала бар составляет 1 мкм.

Рисунок 3. Экзайтотоксическим стимуляция вызывает переменной и локализованного накопления кальция в отдельных митохондрий. Цифровой просвечивающая электронная микрофотография лиофилизированной cryosection получали из нефиксированной, быстро замороженные гиппокампа культуры клеток после эксайтотоксичного стимуляции подтипа NMDA рецепторов глутамата (100 мкМ NMDA в течение 30 мин) показывает многочисленные митохондрии, содержащие небольшие, естественно электронно плотные, точечные включения (красные стрелки). Соответствующие спектры рентгеновского продемонстрировать, что токсичные стимуляция приводит к потере ионов гомеостаза, о чем свидетельствует повышенной пика Na и снижение K пика в включения без митохондриях (синие стрелки и спектр). Большой пик Са в красной области спектра отражает сильную митохондриальную накопление кальция локализованную к характерным включений, которые также содержат большое количество фосфора и кислорода. Средняя концентрация Са в включений и матриц было ~ 1300 и ~ 60 ммоль / кг сухого веса соответственно. Шкала бар представляет 500 нм.

7fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Митохондриальная перегрузки кальция отвечает за избирательным ишемической уязвимости нейронов гиппокампа СА1 левая панель -. Электронные микрофотографии криосрезов клеточных тел в СА3 и СА1 регионах органотипической гиппокампа культуры ломтик, быстро заморожены под ишемией имитируя условиях (100 мкМ NMDA). правой панели - EPMA анализ митохондриальной содержания кальция показывает, что химический ишемия индуцирует гораздо больше высотах кальция в митохондриях уязвимых нейронов CA1, чем в соседних, ишемия устойчивостью СА3 нейронов (* р <0,05 по отношению к NMDA-воздействию СА1). NMDA-индуцированных перегрузки кальция была отменена NMDAR антагониста МК-801. Шкала бар представляет 2 мкм.

Discussion

Электронный микроскоп на основе аналитический метод, представленный здесь позволяет для обнаружения, идентификации и количественного определения нескольких элементов биологический интерес, в том числе Na, K, P, и особенно Са. Эти анализы могут проводиться на субклеточном, т.е. внутри органеллы, разрешение благодаря способности, чтобы найти и определить структуры, представляющие интерес в качественных изображений криосрезов приготовленных из быстро замороженных образцов. Обратите внимание, что не окрашивание не требуется записывать электронные изображения, сравнимые по структурной качеству условно-постоянных, пластиковые встраиваемый препаратов, даже в то время как расположение элементов ткани количественно сохранились.

Хотя структурные изображения опроса записываются на низкой принятой дозы электронов, гораздо более высокие дозы необходимы, чтобы выявить рентгеновского излучения при подсчете ставок, достаточных для получения хороших статистических данных. Таким образом, микроскоп полезно для EMPA должны быть способны образовать большой ток сфокусированного зонд; 2-5 нАв 25-50 нм, подходит для охватывая органеллы, как ER цистерн или синаптических пузырьков, является приемлемым. Это минимально требует высокой яркости гексаборид лантана электронную пушку. В этих инструментальных условиях, кальций при типичных тканевой концентрации 1-10 ммоль / кг сухого веса может быть количественно анализируют к стандартной ошибки ± 0,1 ммоль / кг в ~ 100 сек живого времени. Чувствительность анализа кальция бы быть значительно улучшена, если бы не несчастный перекрытия основного кальция рентгеновской линии с незначительным линии калия, деконволюция из которых добавляет значительная неопределенность в интеграции сигнала кальция (см. рисунок 1 легенду для подробнее). Заметим, что граничные условия, описанные сильно расслабленным, когда локальные концентрации кальция необычайно высок, как это происходит при физиологическом и особенно патологического, митохондриальной накопления кальция (рис 2-3).

Несмотря на многочисленные successfприложений UL, очевидно, что EPMA не особенно эффективный метод, так что есть много стимул улучшить пропускную способность. Три перспективные направления упомянуты здесь: 1) потерь энергии электронов спектроскопии (EELS) вместо EDX; 2) 2D элемент карты вместо точечных датчиков и 3) новые, о состоянии самой современной приборы. Вместо того, чтобы собирать, испускаемые рентгеновские лучи, угрей зависит от записи падающих электронов, которые потеряли характерные, элементов конкретных количество энергии после электронно / атомных столкновений. По статистике, EELS по своей сути ~ 4x лучше, чем EDX, и угрей аппаратное и программное обеспечение в настоящее время практически созреть для биологов. (См. ссылки ^{6, 2} по отзывам угрей применений в биологии.)

Улучшенная чувствительность предлагаемых EELS - а также более новые высокой пропускной Si-дрейфа EDX детекторов, см. ниже - позволяет сократить время пребывать на анализе, например миллисекунд, а не чundreds секунд, и, следовательно, способность генерировать цифровые карты отдельных областях в разумные сроки. В качестве примера, 128 х 128 карта кальция могут быть записаны в ~ 1 час ^1. Следует отметить, что этот подход, известный как "Спектр" визуализации ^6,2, обеспечивает полный спектр угрей в каждом пикселе, так что информация о нескольких элементов встроен в записанном "куба данных" (х Vs. У Vs. Е).

Наконец, были основные достижения в приборной технологии и производительность, так как существующей системы, как описано в разделе протокола, была разработана более 20 лет назад. Государство-оф-арт-технологий, которые были бы хорошим тоном в EMPA лаборатории, являющейся установки сегодня будут включать: 1) высокую яркость пистолет автоэмиссионного которые могут перекачивать несколько наноампер (NA) тока в субнанометровых размера пятна, 2 ) большая площадь кремниевый детектор дрейфа для максимального рентгеновского эффективности сбора и пропускной ^8, и 3) современное программное обеспечениеобеспечивая более высокую гибкость и производительность для спектрального сбору, анализу и количественного. Такие программные пакеты коммерчески доступны от большинства производителей; альтернативно, обновленная и улучшенная версия программного обеспечения DTSA, DTSA II, доступен на безвозмездной основе от NIST (см. таблицу 1, сноска 4). Особенности только описал, на верхней части любой автоматизации и / или робототехники, доступных на базы электронного микроскопа.

Протокол ЕМРА как описано зарекомендовал себя весьма полезным для нападения несколько вопросов, представляющих интерес для неврологов, помогая, например, выявить клеточные механизмы нейродегенерацией. Принимая во внимание прогресс просто рекомендуемые, ЕМРА должны продолжать быть твердым вклад в будущих исследований.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)