Mätning av totalt kalcium i nervceller från Electron Probe röntgenmikroanalys

Summary

Detta dokument beskriver tillämpningen av cryoanalytical elektronmikroskopi för kvantitativ mätning av totalt kalcium innehåll och fördelning vid subcellulär upplösning i fysiologiskt definierade biologiska prover.

Abstract

I den här artikeln de verktyg, tekniker och instrument som är lämpliga för kvantitativa mätningar av intracellulär elementärt innehåll med hjälp av teknik som kallas elektron sond mikroanalys (EPMA) beskrivs. Intramitochondrial kalcium är ett särskilt fokus på grund av den kritiska roll som mitokondrie kalciumöverbelastning spelar i neurodegenerativa sjukdomar. Metoden är baserad på en analys av röntgenstrålar som genereras i ett elektronmikroskop (EM) genom interaktion av en elektronstråle med provet. För att upprätthålla den inhemska distributionen av diffunderbara element i elektronmikroskopiska exemplar, kräver EPMA "cryofixation" av vävnad följt av beredningen av ultratunna kryosnitt. Snabb nedfrysning av odlade celler eller organotypic skiva kulturer utföres genom dopp frysning i flytande etan eller av slam frysning mot en kall metallblock, respektive. Kryosektioner nominellt 80 nm tjockt skärs torrt med en diamant kniv vid ca. -16076, C, monterat på kol / pioloform belagda koppargaller, och cryotransferred in en Cryo-EM med hjälp av en specialiserad cryospecimen hållare. Efter visuell undersökning och lokalisering kartläggning vid ≤ -160 ° C och låg elektrondosen, frysta hydrerad kryosnitt frystorkas vid -100 ° C under ~ 30 min. Organelle nivå bilder av torkade kryosnitt registreras, även vid låga doser, med hjälp av en långsam-scan CCD-kamera och subcellulära regioner av intresse som väljs för analys. Röntgen avges från ROI av en stationär, fokuserad, högintensiva elektronsond samlas in av en energiröntgen (EDX) spektrometer, behandlas av tillhörande elektronik, och presenteras som ett röntgenspektrum, dvs en tomt på röntgenintensitet kontra energi. Ytterligare programvara underlättar: 1) identifiering av elementära delar av sina "karakteristiska" peak energier och fingeravtryck, och 2) kvantitativ analys genom extraktion av toppareor / bakgrund. Denna uppsats avslutas med två exempel som visar typiskaEPMA applikationer, en där mitokondrie kalcium analys som kritisk insikt i mekanismer för excitotoxisk skador och en annan som avslöjade grunden för ischemi motstånd.

Introduction

Kalciumjoner är utan tvekan den viktigaste och mest mångsidiga enhet cellsignalering i biologi, spelar en viktig roll i normala processer så olika som synaptisk transmission och genuttryck. Å andra sidan, är lika viktigt i celldöd kalcium. Framför allt är kalcium avreglering en nyckelfaktor i neuronal skada vid stroke, Parkinsons, Alzheimers och andra neurodegenerativa sjukdomar ^3,5. Därför är det oerhört viktigt att förstå kvantitativt hur kalcium distribueras inom celler, och hur detta förändras efter fysiologiska eller patofysiologiska stimuli. Detta mål kompliceras av det faktum att kalcium är dynamiskt fördelade mellan två fysikaliska tillstånd - fria i lösning eller bundna till ett substrat, - och det cellulära kalciumkoncentrationer förändras över flera storleksordningar som en följd av stimulering.

Även om det finns flera avancerade metoder som finns för analys av free intracellulär kalcium, är fastställandet av den totala kalciumkoncentrationer i definierade intracellulära fack realistiskt begränsat till en strategi, nämligen elektronsondmikroanalys (EPMA). EPMA är en teknik som kopplar en röntgenspektrometer med ett transmissionselektronmikroskop (TEM). TEM elektronkanon fokuserar en stationär, submikron elektron sond på en subcellulär område av intresse och elementspecifika röntgenstrålning som avges som ett resultat av elektronbombardemang samlas och analyseras (se referenser ^{7, 4} för detaljerade tekniska recensioner). Fördelar med EPMA omfattar singel organellnivå upplösning och submillimolar känslighet. I praktiken kräver dock EPMA specialiserade cryotechniques och instrumentering för extraktion och analys. Här är de verktyg, tekniker och instrument som är lämpliga för mätning av intracellulär kalcium med hjälp av EPMA beskrivs. Intramitochondrial kalcium är av särskilt interest på grund av den kritiska roll som mitokondriella kalciumöverbelastning spelar i neurodegenerativa sjukdomar.

Protocol

Den metod som beskrivs här har utvecklats med hjälp av särskilda instrument, verktyg och programvara. Eftersom labb inte kommer att använda samma experimentuppställning inflygningen generaliserad där så är möjligt.

1. Snabb nedfrysning

Den analysmetod som skall beskrivas är absolut beroende av kryogena metoder för: 1) den "cryofixation" hos celler eller vävnader på ett sätt som kvantitativt bibehåller fördelningen av diffunderbart vävnadskomponenter och kemiska ämnena som de var i levande celler vid ögonblicket för frysning , och 2) beredning av ultratunna kryosektioner lämplig för avbildning och analys i ett TEM. Dessa tekniker beskrivs kortfattat här, men detaljer som krävs för att återge dessa förfaranden i andra laboratorier är utanför ramen för denna artikel. Intresserade läsare hänvisas till utmärkta nya artiklar ^9,14.

Varning: Detta avsnitt beskriver användningen av flytande tvefied etan, som är mycket lättantändlig och explosiv, bör lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas. Operatören ska också vara förtrogen med flytande kväve (LN ₂₎ säkerhetsåtgärder, inklusive skyddslabbrock, glasögon, och cryoresistant handskar. OBS: Här och i hela, alla verktyg (tång, etc.) används för att hantera frysta prover måste förkyld i LN ₂ före användning för att undvika oavsiktlig upptining.

Odlade celler på täckglas

1. Förbered ett dopp frysning enhet genom att kondensera gasformiga etan vid -160 ° C i LN ₂ kylda central väl. Fyll till märket och täcker väl med lock svängnings aluminium när den inte används.
2. Med hjälp av filterpapper kilar, blot plasttäck av odlade celler under experimentellt lämpliga förhållanden till en tunn vattenfilm. Blot från kanten för att undvika att vidröra vävnaden, den idealiska rest filmen, bestämd genom trial-and-error, är så tunn som möjligt, men inte så ei så att avdunsta och tillåter torkning av vävnadsytan.
3. Håll täckglas vid kanten med kläm pincett, snabbt doppa i flytande etan, antingen manuellt eller med hjälp av gravitationsdrivna kolv.
4. Placera den frysta täckglas i en närliggande styrofoam skål med LN _2, tillräckligt stor för att manipulera önskat antal täckglas i behållare långtidslagring. Aluminium skruvlock burkar som inte gripa i LN ₂ rekommenderas.

Snabb frysning av odlade hjärnan skivor

5. Enligt en dissekera mikroskop, visa och orientera en organotypisk hippocampus slice, ostört och fortfarande sitter i kulturmembraninsatsen. Placera referenspunkter på membranet nära kanten på skivan med en svart Sharpie-typ penna och fotografi.
6. Fortfarande under mikroskop, skär ut ca. 5 x 5 mm membran torg med enskilda skivor centrerade på rutorna. Undvik att vidröra skivan eller böja membrane.
7. Montera en membran stöds skiva, mildras av en ¼ i agar diameter pad, på en specialdesignad aluminiumskiva för att passa en cryoultramicrotome (beskrivs nedan). Snabbt frysa segmentet med pneumatiskt driver den mot en LN ₂ kyld safir blocket med hjälp av en anpassad "slam frysning" enhet.
8. Flytta till lagring som på odlade celler.

2. Kryosektionering

CAVEAT: Framgångsrikt producerar torr skurna band av ultratunna sektioner, medan enkel och logisk, kräver utbildning, tålamod och stor praktik.

1. Baka ut en cryoultramicrotome utrustad med en cryoattachment och sval till -135 ° C.
2. Skär frysta täckglas i ca. 3 x 3 mm rutor med hjälp av en vass, förkyld skalpell. Använd bitar med kulturer uppåt i en viskös vätska "cryoglue" (en 01:06 blandning av etanol och 2-propanol, ^11), på standard 3mm diameter aluminiumstift utformade för att passa mikrotomen exemplar chuck. Undvik läckande cryoglue på odlingsytan. Stelna cryoglue genom sänkning av cryobox temperatur till ≤ -160 ° C.
   • För frysta hjärnan skivor, säkert fästa skivor direkt till en skräddarsydd exemplar chuck med hjälp av en skruv krage.
3. Trimma utvalda områden av frysta prover - t.ex. cellrika områden i täckbitar eller identifierade områden av skivor - till en ca. 250 x 250 ìm blocket ansikte och ~ 100 nm djup med hjälp av en diamant trimningsverktyg.
4. Torr skurna band av tunna sektioner på ca. -160 ° C med användning av en 35 ° diamant cryoknife, väsentligen såsom beskrivs i referencs ^{4, 9.} Skärhastighet och kniv släppningsvinkeln bestäms empiriskt, en bra utgångspunkt är 0,4-0,6 mm / s vid 9 °. Den nominella tjocklek, dvs förlagan förväg av hydratiserade sektioner is typiskt 80 nm, även om avsnitten är faktiskt 1.5-2.0x tjockare, främst på grund av kompression. För tillfredsställande sektionering, är en antistatisk anordning viktigt. Placera joniserande spets enheten 0,5-1 cm från kniveggen och justera uteffekten tills tillfredsställande band av avsnitten produceras.
5. Förbered ögonfrans sonder genom limning (med epoxy) ögonfransar till trä applikator pinnar. Med hjälp av en sådan sond, plocka upp och överföra delar från baksidan av kniven på glöd-urladdat, kolbelagda pioloform support filmer gjutna över fällbara koppargaller 100-mesh och vilar på en halv-viks indium folie kuvert på en arbetshylla bakom kniven. Vik över den övre halvan av gallret och kuvert, tryck med en kallpressning verktyg.
6. Överför inslagna galler till ett bekvämt rutnät låda och förvara i en aluminiumburk som beskrivs i steg 1,4.

3. Cryotransfer av prover till elektronmikroskop

Kärnan instrument för EPMAi detta laboratorium är en analytisk elektronmikroskop som drivs vid 120 kV och utrustade för cryomicroscopy, dvs utformad med en ren vakuum, exemplar-område anticontaminator, en högkänslig digitalkamera 2k x 2k och cryotransfer provhållare. Kontrollera i förväg mikroskop inriktning och driftsförhållanden i både låg-och hög förstoring lägen och bekräfta en tillfredsställande kolumn vakuum, helst ≤ 10 ^-7 Torr. Söker upp vid behov.

1. Bekräfta att den vakuumisolering av Dewar-komponenten av cryoholder är tillfredsställande. Pump som behövs.
2. Kyl cryoholder till sin lägsta temperatur, minst -160 ° C, medan under högt vakuum i mikroskop scenen, loss kabeln mellan innehavaren till dess kontrollbox. Luta goniometer 45 ° medurs innan du tar bort hållaren för att minimera LN ₂ spilla på operatör och mikroskop ytor.
3. Förbered benchtop cryoworkstation genom kylning integralen isolatd cup till ≤ 160 ° C.
4. Transfer (quickly!) den kylda cryoholder från mikroskopet till cryo arbetsstation. Dra innehavarens frostskydd.
5. Hämta i LN ₂ ett rutnät smörgås från lagring och plats på arbetsbordet i cryoworkstation. En stoppring för innehavarens testbrunnen läggs också på bordet.
6. Öppna indium kuvertet och flytta bifogade fällbara galler med förlagan väl av cryoholder. Fäst nätet med låsringen med hjälp av käppar verktyget tillhandahålls och stäng frostskyddet.
7. Snabbt bort cryoholder från cryoworkstation och lägg in i luftslussen för mikroskopet och gå igenom pumpsekvensen så snabbt som möjligt. On insertion, bör det finnas minimala störningar av kolonnen vakuum.
8. Återgå goniometer till 0 ° lutning. Anslut och återställa skyddet kontrollboxen och kontrollera att provtemperaturen ≤ 150 ° C.
9. Fyll på Dewar avprovhållare och tillåter vakuum och temperatur för att återhämta sig helt.

4. Visuell undersökning av avsnitten

1. Dra tillbaka frostskydd av innehavaren att utsätta provet och slå på elektronstrålen.
2. Utvärdera visuellt provet vid låg förstoring, typiskt 250X, och låg belysning. Såsom illustreras i figur 1, bör sektionerna vara tunn och smidig, inte vikta eller överlappande, platt och väl fäst vid stödfilmen, och i allmänhet inte skyms av gallerstänger.
3. Eventuellt fotografera valda delar. (OBS: Minimera balk exponering, eftersom frysta hydrerad avsnitten är mycket känsliga för balk-inducerad skada.) Använd automatiserade digitala goniometer skede för att lagra koordinaterna för valda sektioner.

5. Frystorkning av avsnitten

1. Fryst torra sektioner genom att öka innehavaren temperaturen till ca. -100 ° C för ~ 30 min.
2. Återkylning innehavaren till -160 ° C eller lägre.

6. Imaging av celler och organ

Strukturbilder av frystorkade sektionerna erhålles vid ca. -160 ° C så låg dos, bilder noll-förlust in digitalt med hjälp av en 2k x 2k slow-scan CCD-kamera som styrs av lämplig mjukvara.

1. Aktivera EM i hi-mag-läge.
2. Välj och bild på ~ 2000 X (som TIFF, se figur 2) markerade celler och subcellulära områden av intresse för högkvalitativa sektioner vars platser tidigare registreras och lagras. (OBS: De torkade sektionerna är nu betydligt mindre sköra och mindre känsliga för elektronstråleskador.
3. Utvärdera bilder för att välja ut områden av intresse (ROI) för röntgenanalys. Detta steg kan valfritt utföras off-line, i vilket fall den EM kan vridasbort och provet tilläts att värmas till rumstemperatur.

7. Förvärv av röntgenspektra

Röntgenspektra kan spelas in med hjälp av någon av flera kommersiella eller skräddarsydda röntgenanalyssystem minimalt bestående av en energiröntgen (EDX) detektor, tillhörande puls-processor elektronik och kompatibel förvärv och visning programvara. (Det system som används i detta lab beskrivs i tabell 1.)

1. Konfigurera EM för röntgen förvärv genom att sätta i EDX detektorn i kolonnen (vid behov), dra tillbaka målet bländare, och sätta in och centre alla herrelösa strålnings öppningar. Justera cryoholder till den lägsta temperatur vid vilken frost kontamination av provet undviks, men åtminstone under -100 ° C.
2. Vinkla hållaren 20 ° i riktning mot detektom.
3. Under breda fältavbildningsförhållanden, och antar man avser att analysera matrisen av en individual mitokondrier, välj en mitokondrier för analys, flytta det till mitten av fältet och fokus.
4. Gå till spot-läget (på vissa mikroskop precis konvergera strålen med hjälp av andra kondensor fokus) och öka strålströmmen till ca. 3 nA (mätt med en Faraday cup eller liknande) i en 100 nm plats.
5. Starta förvärvs spektrum programvara och börja 100 sek förvärv, som kan ses live-tid på bildskärmen. Spara inspelad spektrum (Figur 2). Industristandarden EMSA format är att föredra.
6. Stäng av EM och överföra fler spektra fil (er) till en (offline) analys arbetsstation.

8. Analys av röntgenspektra

Kvalitativ analys

En EDX-spektrum (Figur 2, inlägg) är i huvudsak en xy plot av röntgenstråleintensitet kontra energi. Spectra innehåller kvalitativ och kvantitativ information om grundämnessammansättningen av tHan analyserade volymen, i att "karakteristiska" energi av en topp identifierar elementet som ger upphov till denna topp medan intensiteten reflekterar mängden det elementet. De karakteristiska topparna rida på toppen av en långsamt varierande bakgrund, den "oavbruten". (Legenden figur 2 diskuterar vidare framträdande detaljer i EDX-spektra.) Energin i toppgrenrör för hela periodiska systemet definieras av välkända elektroniska strukturen i element, alltså alla EDX programvara länkar till en databas som automatiskt identifierar komponenter i en analyt. I ett fysiologiskt sammanhang, inslag av allmänt intresse som är väl lämpade för EDX-analys innefattar Na (K _α på 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) och Ca (3,69 keV).

1. Dra nytta av tillgänglig programvara databas och topp matchande rutiner för att identifiera viktiga element i spektra. I ett biologiskt prov förvänta sig att hitta toppar för Na, Mg, P, S, Cl, K och Ca. (VARNING:De sista två delarna överlappar varandra!)

Kvantitativ analys

Kvantitativ analys av EDX spektra består i att utvinna den integrerade området identifierade toppar och omvandla detta värde till en koncentration. För biologisk analys, är den etablerade synsätt på Hall topp / kontinuum metod ^4,7,10, som drar nytta av det faktum att intensiteten i kontinuum (definierad ovan och i figur 2) är proportionell mot torrvikt analyserade volymen . Således förhållandet mellan topparean / kontinuum område, jämfört med samma förhållande i spektra av standarder med känd sammansättning, anger koncentrationen i riktade cellfacket. Observera att denna metod ger koncentrationer i heter mol per vikt, vanligtvis uttryckt som mmol / kg torrvikt. Denna enhet är ovanlig och för tolkning kan kräva ytterligare omvandling till, till exempel, mmol / l våtvikt eller mmol / mg protein, såsom beskrivits elsewhere ^4,10.

2. Utdrag toppområden (och feluppskattningar) av biologiska faktorerna mellan Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), dvs Na, Mg, P, S, Cl, K och Ca, med hjälp av någon av de passande rutiner inbyggda i analysprogram (se tabell 1, speciellt fotnot 4). Denna labb använder Simplex eller flera-minstakvadrat montering. Notera att denna montering kräver noggrann uppmärksamhet på att lösa överlappningen mellan K-och Ca toppar (se figur 2).
3. Integrera kontinuum mellan 1,45-1,61 keV. Alternativa störningsfria områden kan användas.
4. Beräkna topp / kontinuum nyckeltal och sedan koncentrationer i jämförelse med standarder. Föröka fel genom hela analysen.
5. Använd standard statistisk programvara och formler för att beräkna medelvärden som speglar den biologiska variabilitet.

Representative Results

Hjärnceller upprätthålla normalt excitotoxisk skada till följd av den patologiska neurotransmittorfrisättning som sker under ischemiska förhållanden. EPMA var avgörande för att upptäcka hur kapaciteten av neuronala mitokondrier att binda stora mängder kalcium ligger bakom mekanismen för skada. Den elektronmikrofotografi i figur 3 illustrerar uppträdandet av mitokondrier i frystorkade kryosnitt av odlade hippocampusneuroner snabbt frysts efter 30 min exponering för ett excitotoxiskt stimulus (100 pM NMDA). De flesta mitokondrier verkar vara strukturellt skadas, eftersom de är starkt svällda och innehålla små, mörka inneslutningar (röda pilar). EPMA, som har upplösningen är tillräcklig för att utföra elementär analys inom och exklusive (den "matris") mitokondriella inkluderar (Figur 3, röd och blå spektra, respektive), visade att de inneslutningar till stor del består av kalcium och fosfor. Den extremt höga kalcium-contält av dessa inneslutningar - ~ 1,300 mmol / kg torrvikt, medan <1 mmol / kg är typiskt för vila mitokondrier - förklarar deras utomordentliga kalcium-buffertkapacitet, och därför överväldigande denna buffring mekanism leder till kalcium överbelastning-utlöst celldöd ^11.

Hippocampus, ett område av hjärnan som kritisk för inlärning och minne, är ett stort område av skada efter ischemi. Intressant och terapeutiskt viktig, är funktionellt distinkt region som heter CA3 mycket mindre känsliga för ischemisk skada än vad som är angränsande, synaptiskt ansluten CA1 region. EMPA-analys - i kombination med kryosnitt av specifika regioner i hippocampus skivor som underhåller på plats struktur och funktion (Figur 4, mikrograf) - användes för att visa att giftiga stimuli framkalla mycket större kalcium höjder i utsatta CA1 nervceller än i resistenta angränsande CA3 neuroner ( Figur 4, stapeldiagram). Följaktligen CA1 mitochon Dria uppvisar omfattande skador och dysfunktion, vilket tyder på att ^{Ca2 +-overload-inducerad} mitokondriell dysfunktion är en avgörande faktor i den selektiva sårbarhet CA1 nervceller ^13.

Figur 1. Låg förstoring elektron mikroskop av två band av frysta hydrerad kryosnitt stödda på en pioloform film. Kännetecken för en bra förberedelse illustreras, inklusive platta, väl anslutna, minimalt fragmenterad sektioner. Grid fyrkanter med REACH i bärarfilmen bör undvikas, eftersom filmen tårar ytterligare under elektronstråle. Två rutor helt lämpliga för analys markeras med asterisk. Scale bar = 100 | im.

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg "/>
Figur 2. Kvantitativ analys av organell elementära sammansättningen med EPMA. Låg dos, digital skanning transmissionselektronmikrofoto av sympatiska neuron i ett frystorkat kryosektion ställdes från snabbt fryst kontroll ganglion illustrerar detalj uppnås i sådana prover. Notera den kraftiga plasmamembranet, välbevarade högar av endoplasmatiska nätverket och rikliga mitokondrier Inset -. EDX spektrum registreras från ett typiskt område i mitokondriens matrix, vilket indikeras av den röda pricken. Element som motsvarar de stora K skalröntgentoppar identifieras, i fallet med kalium och kalcium, är två K-skal-linjer som härrör från alternativa elektroniska övergångar löst, indikeras som K _α och K _β enligt standard spektroskopisk notation. Spectrum illustrerar typisk fördelning av huvudelement i levande nervceller. Notera den långsamt varierande kontinuum strålning, t.ex. mellan 1,5 till 1,8 eller 2,8 till 3,1 keV, som återspeglar massdensitet av denna cellulära fack. Kvantitativ analys av kalcium i friska celler kompliceras av närvaron av relativt höga halter av kalium (ca. 500 mmol / kg torrsubstans, motsvarar ungefär 150 mM), vilket ger upphov till överlappning av kalium K _β och kalcium K _α toppar i EDX spektrum. Det finns standardalgoritmer för deconvolving denna överlappning. Skala stapel representerar 1 mikrometer.

Figur 3. Excitotoxisk stimulering inducerar variabel och lokaliserad kalcium ackumulering i enskilda mitokondrier. Digital transmissionselektronmikrofoto av frystorkat kryosektion ställdes från ofixerade, snabbt frysta hippocampus cellkultur efter excitotoxisk stimulering av NMDA-subtypen av glutamatreceptorer (100 mikroM NMDA under 30 min) visar många mitokondrier som innehåller små, naturligt elektron täta, punktuell inneslutningar (röda pilar). Motsvarande röntgenspektra visar att giftiga stimulering resulterade i förlust av jon homeostas, vilket framgår av ökad Na topp och minskad K topp i införandet fria mitokondriens matrix (blå pilar och spektrum). Den stora Ca topp i det röda spektrat avspeglar stark mitokondrie kalcium anhopning lokaliserad till karakteristiska inneslutningar, som även innehåller stora mängder fosfor och syre. Genomsnittlig Ca koncentrationen i inneslutningar och matriser var ~ 1300 och ~ 60 mmol / kg torrvikt, respektive. Skala stapel representerar 500 nm.

7fig4.jpg "/>
Figur 4. Mitokondriell kalcium överbelastning är ansvarig för selektiv ischemisk sårbarhet hippocampus CA1 nervceller vänstra panelen -. Elektronmikro av kryosnitt av cellkroppar i CA3 och CA1 regioner av en organotypisk hippocampus bit kultur, snabbt fryses i ischemi liknande förhållanden (100 mikroM NMDA). högra panelen - EPMA analyser av mitokondrie kalciumhalt visar att kemisk ischemi framkallar mycket större kalcium höjder i mitokondrier utsatta CA1 nervceller än i angränsande, ischemi-resistenta CA3 neuroner (*, p <0,05 i förhållande till NMDA-exponerade CA1). NMDA-inducerad kalcium överbelastning avskaffades av NMDAR antagonisten MK-801. Skala stapel representerar 2 ìm.

Discussion

Den elektronmikroskop baserade analysmetod presenteras här möjliggör detektion, identifiering och kvantifiering av flera delar av biologiskt intresse, bland Na, K, P, och i synnerhet Ca. Dessa analyser kan utföras på subcellulära, dvs intra-organell, upplösning på grund av möjligheten att lokalisera och identifiera strukturer av intresse i bilder av kryosnitt framställda från snabbt frysta prover av hög kvalitet. Observera att ingen färgning är nödvändig för att registrera elektronbilder jämförbara i strukturell kvalitet till konventionellt fast, plastinbäddade preparat, även medan placeringen av vävnadselement kvantitativt bevaras.

Även strukturella undersökning bilder spelas in med låg tillämpad elektron dos, är mycket högre doser krävs för att framkalla röntgenstrålning vid räknehastigheter tillräckliga för att få bra statistik. Därför måste ett mikroskop användbart för EMPA kunna bilda en hög ström fokuserad sond; 2-5 nAin 25-50 nm, lämplig för omfattande organeller som ER cisternae eller synaptiska vesikler, är acceptabel. Denna minimalt kräver en hög ljusstyrka lantan hexaboride elektronkanon. Under dessa instrumentella betingelser kan kalcium vid typiska vävnadskoncentrationer av 1-10 mmol / kg torrsubstans kvantitativt analyseras till ett standardfel av ± 0,1 mmol / kg i ~ 100 sek levande tid. Känsligheten av kalciumanalys skulle kunna förbättras avsevärt om det inte vore för den olyckliga överlappning av de stora kalciumröntgenlinje med en mindre kalium linje, deconvolution som tillför betydande osäkerhet för integrationen av kalcium-signalen (se figur 1 legend för detaljer). Observera att de randvillkor som beskrivs är mycket avslappnad när lokala kalciumkoncentrationer är ovanligt hög, vilket inträffar under fysiologiska, och särskilt patologiskt, mitokondrie kalcium ackumulering (figur 2-3).

Trots många successful-program, är det tydligt att EPMA är inte en särskilt effektiv teknik, så det finns mycket incitament att förbättra datagenomströmning. Tre lovande områdena nämns här: 1) elektronenergiförlustspektroskopi (EELS) istället för EDX, 2) 2D del kartor i stället för punkt sonder, och 3) nyare, state-of-the-art instrumentering. I stället för att samla utsända röntgenstrålar, EELS beror på inspelningsincident elektroner som har förlorat karakteristiska, elementspecifika mängder energi efter elektron / atomkollisioner. Statistiskt sett är EELS sig ~ 4x bättre än EDX, och ål hårdvara och mjukvara är nu praktiskt taget mogna för biologer. (Se referenser ^{6, 2} omdömen av ål tillämpningar inom biologi.)

Den förbättrade känsligheten erbjuds av EELS - och även av de nyare hög genomströmning Si avdriftsreducerande EDX detektorer, se nedan - möjliggör kortare uppehållstider per analys, t.ex. millisekunder snarare än hundreds av sekunder, och därmed möjligheten att generera digitala kartor över utvalda områden inom rimliga tider. Som ett exempel, kan spelas in en 128 x 128 kalcium kartan i ~ 1 tim ^1. Observera att denna metod, som kallas "spectrum imaging" ^6,2, ger en komplett EELS spektrum vid varje pixel, så information om flera element är inbäddad i det inspelade "datakub" (x vs. Y vs. E).

Slutligen har det skett väsentliga framsteg inom instrumentteknik och prestanda eftersom det nuvarande systemet, som beskrivs i protokollet avsnitt, utvecklades över 20 år sedan. State-of-the-art teknik som skulle vara de stort i en EMPA labb är installationen idag skulle omfatta: 1) en hög ljusstyrka fältemissions pistol som kan pumpa flera nanoampere (nA) av ström i subnanometer stora prickar, 2 ) ett stort område kisel-drift detektor för maximerad röntgenavskiljningsgrad och genomströmning ^8, och 3) modern programvaraerbjuder överlägsen flexibilitet och prestanda för spektralanalys förvärv, analys och kvantifiering. Sådana programvaror är kommersiellt tillgängliga från de flesta tillverkare, alternativt är en uppdaterad och förbättrad version av DTSA programvara, DTSA II, tillgänglig utan kostnad från NIST (se tabell 1, fotnot 4). Funktionerna som just beskrivits är på toppen av alla automations-och / eller robotteknik tillgänglig på basen elektronmikroskop.

EMPA-protokoll som beskrivs har visat sig mycket användbart för att attackera flera frågor av intresse för neuroforskare, hjälpa, till exempel för att avslöja cellulära mekanismer för neurodegeneration. Med tanke på de förbättringar som bara rekommenderas, bör EMPA fortsätta att vara ett fast bidrag till framtida forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)