Summary
細胞変性効果（CPE）ベースのアッセイ、用量応答アッセイとTime-of-付加（TOA）アッセイを含む3つのアッセイは、同様に、開発され最適化され、検証され、ブルータングウイルスに対する新規な抗ウイルス（BTV）を識別するために利用されている新たに同定された抗ウイルス薬のための可能な作用機序（MOA）を決定するように。
Abstract
BTVに対する潜在的な抗ウイルス剤を同定するために、我々はここで紹介する3つのアッセイを開発し、最適化および検証されています。 CPEベースのアッセイは、化合物は、任意の抗ウイルス効果を示し、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用されているかどうかを評価するために開発された最初のアッセイであった。一方、抗ウイルス剤の細胞毒性はまた、CPEベースのアッセイを用いて評価することができる。用量応答アッセイは、 すなわち 、50％阻害濃度（IC 50）または有効濃度（EC 50）、ならびに細胞毒性のその範囲（CC 50）、選択された抗ウイルス効力のための範囲を決定するために設計された。のToAアッセイはBTVウイルスのライフサイクルやホスト細胞機構に影響の可能性の間に新たな抗ウイルス剤の基本的なメカニズムを決定するために、最初のMOAの研究のために使用した。これらのアッセイは、細胞培養系における抗ウイルス効果を評価するために不可欠であり、我々の最近の研究のために使用されているリードBTVに対する新規抗ウイルス薬の数の同定にING。
Introduction
BTV属オルビウイルス 、 レオウイルス科に試作品の二本鎖RNAウイルスである。 BTVは、世界中の1,230億ドル/年の損失と、ヒツジ、ヤギ、牛や他の家畜動物を含む家畜の中で最も重要な疾患の一つです。エキゾチックBTV血清型は、に記載されている重要な動物の病原体である「米国農務省ハイ帰結家畜病原体。 "最近では、再興BTVの北欧3,4間でいくつかの国で牛や羊の病気の大発生を引き起こした。その経済的重要性の結果として、モデル系として、BTVは、広範囲の分子遺伝学的および構造的研究の主題であった、いくつかのワクチンが開発されている。しかし、抗ウイルス薬の発見のための適切なアッセイがないために、BTVに対して利用可能な抗ウイルス薬は存在しない。
モデル系としてBTVを用いた最近のハイスループットスクリーニング（HTS）のキャンペーンでは、dは、eveloped最適化され、アルボウイルス5に対する潜在的な広域スペクトル抗ウイルス薬を識別するために、CPEベースのアッセイを検証しました。 CPEベースのアッセイは、迅速かつ観察可能なCPE /アポトーシスを誘導した5-7多数のウイルスに対する抗ウイルス薬物の発見に使用されている十分に認識アッセイである。我々のシステムでは、ポストBTV感染、CPEは、HeLa、BSRおよびHEK 293T 8を含む脊椎動物細胞において明らかである。 BTV誘発CPEを監視し、セルタイターグロ細胞生存度試薬キット（CTGキット）9を含む種々の細胞生存率検出法を用いて定量することができる。このキットは、代謝的に活性な生細胞の存在を示す細胞のATPの定量に基づいて培養物中の生存細胞の数を提示し、決定する。最適化された条件下で、ここに提示され、CPEベースのアッセイは、「ミックスと測定」1段階プロトコル、および安定した発光シグナルと柔軟性との実現可能性を示した。一方、毒性化合物REDUcing細胞生存率は、このCPEベースのアッセイで除外されます。 CPEベースのアッセイは、BTVに対する抗ウイルス薬の発見のためにその堅牢性と信頼性を示し、潜在的な抗ウイルス鉛化合物（Sの6小説クラスターの同定をもたらすNIH分子ライブラリ小分子リポジトリ（MLSMR）をスクリーニングするために使用されています）5。
潜在的な抗ウイルス化合物はCPEベースのアッセイを用いて同定された場合には、抗ウイルス効果および細胞毒性2の範囲を決定するために、10濃度の用量応答アッセイに供される必要がある。抗ウイルス効果は、50％阻害濃度（IC 50）又は50％有効濃度（EC 50）として表される、ベースラインと最大値の間のウイルス誘導CPEを半阻害する薬物の濃度である。抗ウイルス剤の細胞毒性は、50％細胞毒性濃度（CC 50）、 すなわち 、濃度ベースラインと最大値との間の細胞毒性の50％を誘導する薬剤である。 50％のSI（SI 50）と表記の選択指数（SI）は、ウイルス誘発CPEに対する抗ウイルスの特異性を決定する、CC 50 / IC 50から計算されます。 IC 50（またはEC 50）は 、CC 50およびSI 50値は、抗ウイルス化合物は強力な、さらなる薬物開発のために選択的であるかどうかを決定する重要な尺度である。
抗ウイルスがインビトロで明白な毒性を示さなかった、まだ防止ウイルスはCPE及び生産的なウイルスのライフサイクルを誘導した場合には、そのMOA 2を特徴付けることが重要である。我々は、抗ウイルスによって影響されるウイルスのライフサイクルの可能な工程（単数または複数）を決定するためのToAアッセイを行うことにより、このような特徴付けを開始した。一般に、抗ウイルス化合物を、異なる時間前又は後のウイルス感染で細胞に添加した。抗ウイルスが感染した細胞に添加した場合のその標的へ投稿前のステップに添加されたものと比較した場合、TEPは、感染の過程で、より低い活性をもたらすであろう。したがって東亜の研究では、いずれかのウイルスのライフサイクルまたはウイルスのライフサイクルに関与するホスト機器に、化合物の抗ウイルス効果、およびその潜在的なターゲットを決定するために重要である。
3つ全てのアッセイについて、細胞生存率を、製造業者の指示5以下CTGキットを用いて決定した。この検出システムは、様々なインハウスソフトウェアを使用して分析することができる適切な発光信号を出力する。各アッセイは、少なくとも8レプリカを三重に検証され、実施された。すべての得られたデータについては、平均値（AVE）、標準偏差（STDEV）、および共効率的変動（CV）を含む三のパラメータは、アッセイのロバスト性を決定するために分析した。アッセイのロバスト性が決定されると、データは、さらに分析し、種々の生物静力学およびGRAPHIを用いてプロットされCツール2。
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Protocol
1。細胞、ウイルスや抗ウイルス化合物
- ダルベッコ改変イーグル5％ウシ胎仔血清（FCS）を含む培地（DMEM）、100U/mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンで、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞10の誘導体をBSR細胞を維持する。
- すべての3つのアッセイのために、1％のFCS、100U/mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むDMEM中で、プレートの細胞、5以前に最適化された。この培地は、3つのすべてのアッセイのためのアッセイ培地と呼ばれる。
- 5％CO 2及び80〜95％の湿度で、37℃のインキュベーター内のすべてのセルをインキュベートする。
- プラーク精製し、以前に説明したように8種類10 BTV（BTV-10）を伝播する。指定された各アッセイのためのアッセイ培地中BTV-10を希釈する。
- 10mMで濃度のストックを形成するために、DMSO中のすべてのテスト化合物を溶解。 -20℃で在庫を保管して
- 指名するためのアッセイ培地を用いて所望の濃度に化合物を希釈するDアッセイ2。
2。 CTGキットを使用して、CPEベースのアッセイ
- MicroFlo選択ディスペンサーを経由して、384ウェルマイクロプレート（16×24でフォーマット黒）へのシードBSR細胞。播種密度は十分に5000細胞/であり、播種量は抗ウイルス効果の分析のために20μLです。
- 細胞が完全にプレートに付着し得るまで2〜3時間細胞をインキュベートする。
- 各ウェルに10μMの最終濃度の抗ウイルス化合物を加える。それを完全に混ぜる。
- 希望の力価とBTVを希釈し、各ウェルに5μL表記MOIでBTVを追加します。うまく制御のために、アッセイ培地の5μlを加える。 5％CO 2及び80〜95％の湿度で、37℃で72時間感染させた細胞をインキュベートする。
- 72 hpiの、解凍し、使用前に室温までCTG緩衝液および凍結乾燥さCTG基板を平衡た。目に記載の凍結乾燥された酵素/基質およびバッファー試薬を混合して均質CTG試薬溶液を再構成するEメーカーの指示に従ってください。
- 15分間室温にアッセイプレートを平衡化させます。
- ディスペンサーにより各ウェルにCTG試薬を等量の（25μL）を追加します。暗所で室温で15分間インキュベートした後、0.1秒の積分時間でマルチモードリーダーを用いて発光シグナルを測定する。
3。用量反応アッセイ
- それぞれ/ウェル抗ウイルス効果の検定のための20μLおよび細胞毒性アッセイのために25μL、播種量の5000細胞の播種密度とディスペンサーを経由して、（16×24でフォーマット黒）、384ウェルマイクロプレートにシードBSR細胞。
- 細胞まで、5％CO 2及び80〜95％の湿度で、37℃で2〜3時間、細胞をインキュベートを、ウェルプレートに取り付けられている。
- 表1に示すように、（96ウェルプレートに相当）各化合物の384ウェルプレートの四分の一領域におけるプロセスのアッセイ。各濃度について8回の反復を割り当てる単一のアッセイ中。唯一の化合物を含まないウイルスを追加することによって、ネガティブコントロールとして化合物とウイルス、および最後の列（12 回目 ） を追加することなく、ポジティブコントロールとしての最初の列を割り当てます。
- アッセイ培地中に50μMの化合物を希釈し、20μL/ウェルの抗ウイルス効果の検定のための2 番目の列に追加します。 25μMの濃度に8チャンネル半自動ピペットを用いて、化合物を5回混合する。
- 8チャンネルの半自動ピペットを用いて、12.510μMの濃度を形成するために、よく混ぜ、次の列（ 第 3）に2 番目の欄に20μlの混合物を移す。 6.2510μMの濃度で別の2倍希釈を形成するために、次の列（4 回目 ）に3 番目の列から20μlの混合物を転送することにより、このプロセスを繰り返します。 11 列目まで、この2倍連続希釈を繰り返します。吸引し、COMPを追加し、混合した後に11 番目の列内の混合液20μlを捨てるound。
- 5μL/ウェルの容量でカラム11に列2から、各ウェルに、BTV-10、0.01のMOIに基づいて追加します。ウイルスを追加した後、各列の最終化合物濃度は次のようになります。列2が20μm、列3が10μm、および0.04μMの最終濃度でカラム11まで2倍希釈を継続した。
- カラム1に、媒体の5μl加え、細胞のみ（ポジティブ）コントロールとBTV感染として塔12へのBTVの5μL/ウエルのみのコントロール（負）として。
- 細胞毒性アッセイのために、200μMの初期濃度に化合物を希釈する。同様に、100μMの濃度に列2および8チャンネルの半自動ピペットで混合5Xへの化合物の25μL/ウェルを追加。 BTVを追加しないでください。
- 隣の列3、列2から25μLを吸引することで2倍系列希釈を実施し、最後の列（12日）まで継続。コラム12で、混合した後、吸引し、Mの25μLを破棄ixture。コラム2の最終濃度は100μMであるべきであり、12 番目のカラムには0.2μMである必要があります。列1はコントロール細胞である。
- 両方の抗ウイルス効果および細胞毒性アッセイのために、5％CO 2および72時間後に治療のために80〜95％の湿度で、37℃でプレートをインキュベートする。上述したように（プロトコルが2.5〜2.7ステップ）CTGキットを用いて細胞生存率を測定する。
4。時間型追加（TOA）アッセイ
- 5000細胞/ウェルで分配し、播種量を経由して15μL/ウェルで、384ウェルマイクロプレートの列1月24日（×24×16のフォーマットは黒）から種子BSR細胞。
- 各化合物について、384ウェルプレート（ 表2）の半分の各時点8つのレプリカとすべて二十から四列を利用する。 10μL/ウェルのアッセイ培地を添加することにより、細胞のみのコントロールとして、列1を割り当てます。 5μL/ウェルのアッセイ培地ANを追加することで、BTV感染制御のみ（ネガティブコントロール）などのマーク欄240.01のMOIでD 5μL/ウェルウイルス/ウェル25μlの最終体積に。
- 異なる時間後に感染（HPI）でカラム2月22日のような抗ウイルス効果の評価欄から偶数列を選択します。これらの列では、0.01のMOIで5μL/ウェルBTVで細胞を感染させる。別のHPIで、また/ウェル25μlの最終容量を形成するために、各ウェルに5μL/ウェルの希釈された化合物を追加します。示さ-2と-1 HPI前BTV感染にBSR細胞に化合物を添加してください。 0 HPIの場合は、同時に文化に化合物およびBTVを追加します。
- 並行して、（-2、-1、0、1、2、4、8、16、指定されたように、異なる時点で添加された化合物を、唯一の対照化合物としてカラム3-23の奇数列を指定する24、48 HPI）。これらの列では、5μL/ウェルのアッセイ培地を追加し、5μL/ウェルウェル25μL/の最終容量を形成するために化合物を希釈した。
- 処理後、80〜95％湿度で37°C、5％CO 2で細胞をインキュベートする。
- 前述したように（プロトコルは2.5〜2.7ステップ）のCellTiter-グロキットを使用して72 HPIで細胞生存率を測定。
5。データ解析
- マルチモードリーダーを介して得られた発光シグナルに基づいて、適切なインハウスソフトウェアを使用して、最初にすべてのデータを処理する。 10パーセントを超えない値を必要と平均値（平均）は、それぞれの治療のための標準偏差（STDEV）だけでなく、係数の変動（CV）を、決定する。
- 生物静力学およびグラフィックソフトウェアツールに上記のソフトウェアから処理されたデータを転送します。 EC 50およびCC 50の値を決定するために、非線形回帰分析を行う。
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Representative Results
1。化合物の抗ウイルス効果
細胞ベースのCPEアッセイは、以前に開発され最適化され、2,5記載のようにBTVに対する新規抗ウイルス薬を同定するために、発光ベースのCTGキットを用いてin vitroで検証した。 10用量応答アッセイは、生細胞5,11で提示細胞のATPの定量に基づいて培養物中の代謝的に生存可能な細胞の数を測定することによって同定されたリード化合物の抗ウイルス効果および細胞毒性を反映するために用いた。我々の以前の報告では、潜在的な抗ウイルス化合物の数は、 新規合成2を介して、BTV 5に対して、HTSを経由して特定された各クラスタからの化合物、およびそれらの誘導体を含む、評価した。彼らのEC 50、CC 50およびSI 50に基づいて、いくつかの有望なリード化合物は、強力な抗ウイルス効果、低毒性と高い選択性で同定された。例えば、compound052（C052）0.27±0.12μMのEC 50（ 図1）2及び82.69μMのCC 50、非線形回帰下の両方模式的に示す回帰曲線は2を解析を有することが決定された。 C052のSI 50は、そのEC 50およびCC 50値に基づいて、306で測定した。ナノモル規模抗ウイルス効果、低毒性、その結果、高Si 50は C052がBTVに対して強力かつ選択的な抗ウイルスかもしれないことを示した。
2。抗ウイルス化合物の可能性MOA
のToAアッセイは、化合物によって標的ウイルスのライフサイクルの可能な段階（群）を決定することを目的とした。前BTV感染に対する1または2時間でC052を追加する場合、 すなわち -1、-2 HPI、抗ウイルス効能は、C052は、ウイルスのライフサイクルの初期段階を超えて行動する可能性があることを示す、ナノモルスケール（ 図2）2で推移このようなウイルスの侵入など。 FurtheC052は、後に24 HPI、感染細胞に添加されるまでrmore、抗ウイルス効果は変化しないままであった。 32 hpiので添加すると、生存細胞の割合は、C052は、ウイルスのライフサイクルのこの段階で少ない保護的であったことを示す、C052処理細胞では減少した。 48 HPIに追加すると、BTV-誘発性CPEからBSR細胞に対する保護はありませんでした。 BTVウイルス複製の最初のサイクルは通常24 HPI内の感染細胞に完成しているので、我々の結果は、C052は、ウイルス複製、パッケージング、成熟および出力として、BTVウイルスのライフサイクルの後期段階で作用する可能性が示唆された。一方、それはC052は後期ウイルスのライフサイクル2の間に関与していたホスト細胞の機械に作用する可能性もある。
表1。用量応答アッセイのためのプレートレイアウト。C052の抗ウイルス効果を評価した384ウェルプレート中で96ウェルスケールにおけるd。 BTV感染に加えて、異なる濃度のC052を含む各処理は、8つのレプリカを用いて行った。 72 hpiの時、細胞生存率は、CTGキットを用いて決定した。
テーブル。タイムオブ添加（TOA）アッセイ用2プレートレイアウト。レイアウトに示されるようにC052のToAのアッセイは384ウェルプレートで評価した。 BTV感染プラスC052の添加時間を含む各処置は、8つのレプリカを用いて行った。 -2および-1 HPI C052がBTV感染前に細胞に添加したことを示している。 0 HPIで、BTVおよびC052を同時に添加した。 72 HPIで、細胞の生存率は、CTGキットを用いて測定した。 表を見るにはここをクリックしてください 。
図1。図に示すように、C052。細胞の抗ウイルス効果は 、C052の10の異なる濃度の存在下で、0.01のMOIでBTVに感染させた。細胞生存率は、CTGキットを用いて、72 hpiので測定した。各データ点は、5回の繰り返しからの平均およびSDを表す。この図は、区らから変更されている。 2012 2。
図2。示されるように、C052のための時間型添加アッセイ。2.5 mMおよびそれぞれ0.27 mMの、少なくともC052は、異なるhpiの少なくともBTVに感染した細胞に添加し、そして誘導されたBTV CPE、または細胞生存率に対するC052の保護を用いて測定した。 72 hpiの各データ点におけるCTGキットは平均値を表し8つの独立した複製物からのSとSD。この図は、区らから変更されている。2012 2。
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Discussion
抗ウイルスヒットの最初の同定については、抗ウイルス薬の発見および開発のための重要なステップの一つは、定量化可能なマーカーを選択する簡単なプロトコルを開発し、十分な信号及び10％未満のCVを求める含む、堅牢なアッセイを開発することである。ほとんどの生化学的または細胞ベースのスクリーニングは、スクリーニングプロセスで必要な再現性及びスクリーニングされる分子の潜在的に多数のために、最も堅牢簡単かつ安価なアッセイに基づく化学の出発点を提供するように設計される。 CPEベースのアッセイは、大規模な化合物ライブラリーから効果的なヒットを同定するために、これらの要件を満たすように命名した。 CPEは、ウイルス増殖に関連した培養細胞に悪影響を指します。種々のアッセイは、機構の死細胞数（細胞毒性）、生細胞数（生存率）を示す、異なる種々のマーカーを測定することを介してCPEインジケータを使用することが可能であり、細胞死（アポトーシス）。 CPEベースのアッセイのための市販の試薬は、簡単なアッセイプロトコルで利用可能です。例えば、CTGキットは、単一の「混合および測定」ステップを含む、広くウイルス誘導性CPEを定量化するために使用されている。しかし、CPEベースのアッセイは、急速にCPEを誘導できるウイルスに制限されています。迅速なCPEを誘発しないウイルスを、種々のアッセイが開発されている。例えば、レプリコン保有細胞株を用いてレプリベースのアッセイは、翻訳、タンパク質処理、マイナスとプラス鎖RNA合成12月14日を含むウイルス複製の阻害剤のスクリーニングが可能になります。アンチセンスRNA戦略および小分子ライブラリーの仮想スクリーニングも可能15,16抗ウイルス剤を同定するために使用することができる。それにもかかわらず、抗ウイルス薬の有効性が全体のウイルスのライフサイクルに対する抗ウイルス効果を評価することができるin vitroでの細胞ベースのアッセイで検証することが重要です。 CPEベースアッセイは成功し、高スループットフォーマットに適合したインフルエンザウイルス6,17、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoVの）18に対して、最近達成したHTSスクリーニングを含む、大規模な化合物ライブラリーをスクリーニングするための最も信頼性が高く堅牢なアッセイの一つであるされています、19、及びレオウイルス（ブルータングウイルス）、アレナウイルス5。
用量応答アッセイは、通常、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングした後、さらに単回投与CPEベースのアッセイによって同定されたヒットの抗ウイルス効果を検証するために命名した。これらのヒットは、抗ウイルス活性と同一視するが、薬になるために自分の可能性を明らかにするために、さらに確認が必要です。化合物の抗ウイルス効果は、EC 50、CC 50および用量反応分析を用いてSI値50を介して解析によって明らかにすることができる。一方、外オフターゲットまたは偽陽性が識別され、リードCOMPの数になりますoundsを絞り込むことができた。この分析を通して、、化合物の効力および毒性の順序は、特に構造活性相関（SAR）の分析と今後の医薬品化学修飾のために、将来の抗ウイルス薬の発見を指示するためにランク付けすることができた。実際には、化合物C052は、in vitroおよびin vivoの両方で優れた薬剤様特性に関連した化合物のC003の誘導体である。
薬物の要件を満たすためには、生理的濃度においてその標的と化合物の相互作用を特徴付けるためのMOA、 すなわちを決定するための絶対必要である。種々のアッセイ、 すなわち標的を阻害するだけでなく、許容される溶解性、透過性、タンパク質結合性、選択性、代謝および毒性プロフィールを有するように、特定の抗ウイルス剤の開発されている。 MOAの研究では、強力なEC 50、高CC 50とHして、骨の折れる努力、少数の選択された分子を必要とする低スループットアッセイであったためIGH SI 50値は、容易に分析することができた。この段階では、化合物のMOAを理解することは、細胞活性の解釈あるいは存在しないために深さを追加することができます。のToA研究は、抗ウイルス、ウイルスまたはホストのターゲットを操作したときのステージを絞り込むことが指定されている。化合物を知ることは、更なるMOA分析のための即時の方向性を提供することができ、特定の段階のウイルスのライフサイクルにおける基板との競争力がある。あるいは、アッセイを含む公知の機構とのより強力な細胞ベースのアッセイは、直接蛋白質21の表面への結合を阻害するウイルス、HIV-1インテグラーゼ阻害剤をスクリーニング20は、実際の上映前に、公知のMOA 22を提供する使用され得る。これらのスクリーニングからヒットが指定されたMOAによく関連したかもしれないが、実際にはMOAものToAと行動研究の他のメカニズムの対象とすることがある必要があるかもしれません。
要約すると、ここで報告された3つのアッセイを使用して、我々が正常にスクリーニングし、同定されているC003およびC052 2など、BTVに対して、いくつかの強力な抗ウイルス、。具体的には、C052のSI 50（C052がBTVに対して非常に選択的であることが示唆され、306を見上げた。のToAと元の論文に提示され、他のMOAの研究を経て、我々はC052がホストとの相互作用の可能性の抗ウイルス剤であることができることを提案したオートファジー機械、抗BTV薬物に開発することができる。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
このプロジェクトは、NIHからQ.李に、衝撃ファンドによるUABの医学部からQ.李への助成金1R03MH08127-01と7R03MH08127-02でサポートされていました。 Molette基金とオーバーン大学からのサポートが認識されている。また、作業の過程で氏PULINチェ氏と国立歌Musiienkoから技術の処遇に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
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