Summary
Tre analyser, bland annat cytopatisk effekt (CPE)-baserad analys, analys dos-respons och Time-of-Addition (TOA)-analys har utvecklats, optimerad, validerade och används för att identifiera nya antivirala läkemedel mot bluetongue-virus (BTV), samt för att fastställa den möjliga mekanismen-av-åtgärd (MoA) för nyligen identifierade antivirala medel.
Abstract
För att identifiera potentiella antivirala medel mot BTV, har vi utvecklat, optimeras och valideras tre analyser som presenteras här. CPE-baserade analysen var den första analys utvecklad för att utvärdera om en förening uppvisade någon antiviral effekt och har använts för att screena stora substansbibliotek. Under tiden kan cytotoxiciteten hos antiviraler också utvärderas med användning av CPE-baserad analys. Analysen dosrespons var utformad för att bestämma området för effektiviteten för den valda antiviral, det vill säga 50% inhiberande koncentration (IC50) eller effektiva koncentrationen (EC50), såväl som dess spann av cytotoxicitet (CC50). TOA-analysen användes för den initiala MoA undersökning för att fastställa den bakomliggande mekanismen av de nya antivirala läkemedel under BTV viral livscykel eller den eventuella effekten på värd cellulära maskineri. Dessa analyser är viktiga för utvärderingen av antiviral effekt i cellodlingssystem, och har använts för våra senaste undersökningar lederning till att identifiera ett antal nya antivirala läkemedel mot BTV.
Introduction
BTV är en prototyp dubbelsträngat RNA-virus i släktet orbi, familj Reoviridae. BTV är en av de viktigaste sjukdomar av tamboskap, bland får, getter, nötkreatur och andra husdjur, med $ 3000000000 / år förlust världsomspännande 1,2. Den exotiska BTV serotyp är en viktig animaliska patogener anges i "USDA hög risk Boskap Pathogens." Nyligen återväxande av BTV har orsakat ett stort utbrott av sjukdomen hos nötkreatur och får i flera länder i norra Europa 3,4. Som ett resultat av dess ekonomiska betydelse och som modellsystem, har BTV varit föremål för omfattande molekylära, genetiska och strukturella studier, och flera vacciner har utvecklats. Men på grund av bristen på lämpliga analyser för antiviral läkemedelsupptäckt, det finns inga antivirala läkemedel tillgängliga mot BTV.
I en nyligen hög throughput screening (HTS) kampanj med hjälp BTV som modellsystem, vi developed, optimeras och valideras en CPE-baserad analys för att identifiera potentiella bredspektrum antivirala läkemedel mot arbovirus 5. CPE-baserad analys är ett välkänt test som har använts i antiviral läkemedelsutveckling mot ett antal virus som framkallade en snabb och observer CPE / apoptos 5-7. I vårt system, posta BTV-infektion är CPE uppenbart i vertebratceller, inklusive HeLa, BSR, och HEK 293T 8. BTV-inducerad CPE skulle kunna övervakas och kvantifieras med hjälp av olika metoder cellviabiliteten upptäckt, inklusive CellTiter Glo cellviabiliteten reagenssats (CTG-kit) 9. Detta kit bestämmer antalet livsdugliga celler i odling baserat på kvantifiering av cellulära ATP presenteras, vilket signalerar närvaron av metaboliskt aktiva levande celler. Under optimala förhållanden, CPE-baserad analys som presenteras här visade sin genomförbarhet med "blanda och mäta" ett steg-protokollet, och flexibilitet med stabila självlysande signaler. Samtidigt toxiska föreningar redusiering cellviabiliteten kommer att uteslutas i denna CPE-baserad analys. CPE-baserad analys visade sin robusthet och tillförlitlighet för antiviral läkemedelsutveckling mot BTV, och har använts för att screena NIH Molekylära bibliotek Small Molecule arkiv (MLSMR), vilket leder till identifiering av sex nya kluster av potentiella antiviral blyförening (s ) 5.
När en potentiell antiviral förening har identifierats med användning av CPE-baserad analys, måste den utsättas för det tio-koncentration dos-respons-analys för att bestämma området för antiviral effekt och cytotoxicitet 2. Den antivirala effekten, representerad som den inhiberande koncentration 50% (IC50) eller den effektiva koncentrationen 50% (EC 50), är koncentrationen av ett läkemedel som inhiberar virusinducerad CPE halvvägs mellan baslinjen och maximum. Cytotoxiciteten av antivirala läkemedel, dvs den cytotoxiska koncentrationen 50% (CC 50), är koncentrationenav ett läkemedel som inducerar 50% av cytotoxicitet mellan baslinjen och max. Den selektiva index (SI), betecknas som 50% SI (SI 50) beräknas från CC 50 / IC 50 som bestämmer specificiteten av det antivirala mot virus-inducerad CPE. IC-50 (eller EG-50), CC-50 och SI-50 värden är kritiska åtgärder för att fastställa huruvida en antiviral förening som är potenta och selektiva för vidare läkemedelsutveckling.
När ett antiviralt visade ingen uppenbar toxicitet in vitro, men förhindras virusinducerad CPE och produktiv viral livscykel, är det viktigt att karakterisera dess MoA 2. Vi initierade en sådan karaktärisering genom att utföra ToA analys för att bestämma den möjliga steg (er) av viral livscykel som påverkas av det antivirala. Generellt var antivirala föreningen sattes till celler vid olika tidpunkter före eller efter-virusinfektion. Om antivirala läkemedel lades till de infekterade cellerna posta till sitt mål step under loppet av infektion, skulle det resultera i lägre aktivitet jämfört med den som tillsattes före steget. Således är ToA studie avgörande för att bestämma antiviral effekt av en förening, och dess potentiellt mål, antingen på den virala livscykeln eller värd maskiner inblandade i den virala livscykeln.
För samtliga tre analyser, var cellviabiliteten bestämdes med användning av CTG kit efter tillverkarens instruktioner 5. Denna upptäckt Systemet matar tillräckliga luminiscens signaler som kan analyseras med hjälp av olika interna program. Varje analys validerades och utfört minst tre exemplar med åtta kopior. För alla de erhållna data har tre parametrar, inklusive medelvärdet (AVE), standardavvikelse (STDAV) och koefficient variation (CV) analyseras för att bestämma tillförlitligheten hos analysen. När robustheten i analysen har fastställts, kommer data att analyseras ytterligare och ritas med olika biostatics och graphic verktyg 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celler, virus och de antivirala föreningarna
- Bibehåll BSR-celler, ett derivat av babyhamsternjur (BHK)-celler 10, i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 5% fetalt kalvserum (FCS), 100 U penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
- För samtliga tre analyser, platt celler i DMEM med 1% FCS, 100 U penicillin och 100 | ig / ml streptomycin, som tidigare optimerats 5. Detta medium benämns som analysmedium för samtliga tre analyser.
- Inkubera alla celler i inkubatorn vid 37 ° C med 5% CO2 och 80-95% luftfuktighet.
- Plack-rening och utbreda den typ 10 BTV (BTV-10) såsom beskrivits tidigare 8. Späd BTV-10 i analysmediet för varje utsedda analyser.
- Lös alla testföreningar i DMSO för att bilda ett lager med koncentration på 10 mM. Förvara bestånden vid -20 ° C.
- Späd föreningar till önskade koncentrationer med användning av analysmediet för nomineraded analyser 2.
2. CPE-baserad analys Använda CTG Kit
- Seed BSR celler i en 384-brunnars mikro (svart, format med 16 x 24) via MicroFlo väljer dispenser. Den seedning densitet är 5000 celler / brunn, och sådd volymen är 20 l för antiviral effekt analys.
- Inkubera cellerna i 2-3 timmar tills cellerna få anhängare till plattan ordentligt.
- Lägg antivirala föreningen med en slutkoncentration av 10 pM till varje brunn. Blanda den helt.
- Späd BTV till önskat titer och lägga till 5 pl BTV med betecknad MOI till varje brunn. För kontrollen väl, tillsätt 5 ìl av analysmedier. Inkubera de infekterade cellerna under 72 h vid 37 ° C med 5% CO2 och 80-95% luftfuktighet.
- Vid 72 hpi, tina och jämvikt CTG buffert och frystorkad CTG substratet till rumstemperatur före användning. Bered den homogena CTG reagenslösning genom att blanda den frystorkade enzym / substrat och buffertreagens enligt the tillverkarens anvisningar.
- Jämvikta analysplattorna till rumstemperatur under 15 min.
- Lägg till en lika stor volym (25 l) av CTG reagens till varje brunn med en dispenser. Efter inkubation under 15 min vid rumstemperatur i mörker, mäta luminiscens signaler med användning av en multi-mode-läsare med en integrationstid av 0,1 sek.
3. Dos-respons-analys
- Seed BSR-celler in i en 384-brunnars mikroplatta (svart; format av 16 x 24) via en dispenser, med en såddtäthet av 5000 celler / brunn i en sådd volym av 20 ul för antiviral effekt assay och 25 ul för cytotoxicitetsanalys, respektive .
- Inkubera cellerna under 2-3 h vid 37 ° C med 5% CO2 och 80-95% luftfuktighet tills celler är väl fäst till plattan.
- Process analys i fjärdedel område av 384-brunnsplatta för varje förening (motsvarande en 96-brunnars platta), såsom visas i tabell 1. Fördela åtta replikat för varje koncentrationi en enda analys. Tilldela den första kolumnen som positiv kontroll utan tillsats av föreningen och virus, och den sista kolumnen (12: e) som negativ kontroll genom att tillsätta viruset endast utan föreningar.
- Späd föreningar till 50 uM i analysmedium och tillsätts den 2: a kolonn vid 20 pl / brunn för antiviral effekt assay. Blanda föreningen fem gånger med användning av 8-kanals semi-automatisk pipett till en koncentration av 25 pM.
- Användning av 8-kanals semi-automatisk pipett, överför 20 | il blandning i 2: a kolumnen till nästa kolumn (3: e), blanda väl för att bilda en koncentration av 12,5 pM. Upprepa denna process genom att överföra 20 | il blandning av 3: e kolumnen till nästa kolumn (4: e) för att bilda en annan två-faldig utspädning med en koncentration av 6,25 uM. Upprepa detta två gånger seriespädning tills den 11: e kolumnen. Aspirera och kasta 20 pl av blandningen i 11: e kolumn efter tillsats och blandning av den kompound.
- Lägg BTV-10, baserat på MOI av 0,01, till varje brunn från kolumn 2 till kolumn 11 med en volym av 5 ^ il / brunn. Efter tillsats av viruset, bör det slutliga föreningskoncentration i varje kolumn vara: 20 | iM i kolumn 2, 10 | iM i kolumn 3 och fortsatte med en två-faldig spädning ned till kolonn 11 med en slutkoncentration av 0,04 pM.
- Lägg till 5 l av medium till kolumn 1 som cell bara kontroll (positiv) och 5 pl / brunn av BTV till kolumn 12 som BTV-infektion endast kontrollen (negativ).
- Späd föreningar till en initial koncentration av 200 | iM för cytotoxicitetsanalysen. På liknande sätt tillfoga 25 pl / brunn av förening till kolonn 2 och blandades 5x med 8-kanals halvautomatisk pipett till en koncentration av 100 pM. Lägg inte till BTV.
- Utför tvåfaldiga serier utspädning genom att aspirera 25 ^ från kolumn 2 till grann kolumn 3, och fortsatte tills den sista kolumnen (12: e). I spalt 12, efter blandning, aspirera och kasta 25 ul av mixture. Den slutliga koncentrationen i kolumn 2 ska vara 100 ^ M och den 12: e kolumnen bör vara 0,2 pM. I kolumn 1 är cellen enda kontroll.
- För båda antiviral effekt och cytotoxicitetsanalyser, inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO2 och 80 till 95% fuktighet under 72 h efter behandling. Mät cellviabiliteten med hjälp av CTG-kit som beskrivits ovan (protokoll steg 2,5-2,7).
4. Time-of-Tillägg (TOA) analys
- Seed BSR celler från kolumn 1-24 i en 384-brunnars mikro (svart, format med 16 x 24) via en automat på 5000 celler / brunn och sådd volymen är 15 l / brunn.
- För varje förening, utnyttja alla tjugofyra kolumner med åtta repliker för varje tidpunkt i en hälften av 384-brunnar (tabell 2). Tilldela kolumn 1 som celler endast kontroll genom att tillsätta 10 l / brunn analysmedium. Mark-kolonn 24 som BTV infektion endast kontroll (negativ kontroll) genom att tillsätta 5 | il / brunn analysmedium ettd 5 | il / brunn viruset vid MOI av 0,01 till en slutlig volym av 25 | il / brunn.
- Välj de jämna kolumner från kolumn 2-22 som antiviral effekt utvärderings kolonnen vid olika timmar efter infektion (HPI). I dessa kolumner, infektera celler med 5 pl / brunn BTV på MOI på 0,01. Vid olika hpi, också lägga 5 | il / brunn utspädd förening till varje brunn för bildning av en slutlig volym av 25 | il / brunn. För att betecknas -2 och -1 hpi lägga förening till BSR-celler före BTV-infektion. För 0 hpi lägger föreningen och BTV till kulturen samtidigt.
- Parallellt utse de udda kolumner från kolumn 3-23 som förening endast kontrollerar, varav föreningen sattes vid olika tidpunkter som betecknas (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). I dessa kolumner, tillsätt 5 ul / brunn analysmedium och 5 | il / brunn utspädd förening till bildning av en slutlig volym av 25 | il / brunn.
- Efter behandling, inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 med 80-95% fuktighet.
- Bestäm cellviabiliteten vid 72 hpi använder CellTiter-Glo kit som beskrivits tidigare (protokoll steg 2,5-2,7).
5. Dataanalys
- Bearbeta all data först med hjälp av ordentlig intern mjukvara baserad på den självlysande signaler som erhållits via multi-mode-läsare. Bestäm medelvärdet (genomsnitt), standardavvikelse (STDAV) för varje behandling samt koefficient variationer (CV), som måste ha ett värde som inte är större än 10%.
- Överför bearbetade data från ovanstående program till en biostatisk och grafiska verktyg. Utför icke-linjär regressionsanalys för att bestämma värdena för EC50 och CC 50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Antiviral effekt av förening
Den cellbaserade CPE analys utvecklades, optimeras och validerat in vitro med användning av det luminiscenta baserade CTG kit för att identifiera nya antivirala medel mot BTV som beskrivits tidigare 2,5. Tio-dos-responsanalys Den användes för att återspegla den antivirala effekten och cytotoxicitet av en identifierad bly förening genom att mäta antalet metaboliskt levande celler i kultur baserad på kvantifiering av cellulär ATP presenteras i levande celler 5,11. I vår förra rapport har ett antal potentiella antivirala föreningar utvärderas, inklusive föreningar från varje kluster som identifierats via HTS mot BTV 5, och deras derivat via de novo syntes 2. Baserat på deras EC50, CC 50 och SI 50, har flera lovande substanser som identifierats med potent antiviral effekt, låg toxicitet och hög selektivitet. Exempelvis compound052 (C052)bestämdes att ha ett EC50 av 0,27 ± 0,12 ^ M (figur 1) 2 och en CC 50 av 82,69 ^ M, båda visar typiska regressiva kurvor inom den icke-linjära regressionsanalyser 2. SI 50 av C052 bestämdes vid 306 baserat på dess EC 50 och CC 50-värden. Den nanomolära skala antiviral effekt, låg toxicitet, och följaktligen hög SI 50 indikerade att C052 kan vara en potent och selektiv antiviral mot BTV.
2. Potential MoA för den antivirala substansen
TOA-analysen syftade att bestämma den möjliga stadium (er) av viral livscykel måltavla föreningar. När du lägger till C052 på 1 eller 2 tim före BTV-infektion, dvs -1 och -2 hpi, de antivirala effektivitet kvar på nanomolära skala (figur 2) 2, vilket indikerar att C052 kan agera utanför det tidiga stadiet av viral livscykel, såsom virus inträde. Furthermore förblev antiviral effekt oförändrad till C052 inkom i infekterade celler som senare som 24 hpi. När sattes vid 32 hpi, procentandelen av livsdugliga celler minskade C052 behandlingsceller, vilket visar att C052 var mindre skyddande i detta skede av viral livscykel. När sätts vid 48 hpi, fanns det inget skydd till BSR-celler från BTV-inducerad CPE. Sedan den första cykeln av BTV virusreplika oftast klar i infekterade celler inom 24 hpi föreslog våra resultat att C052 kan agera vid sena stadier av BTV viral livscykel, till exempel virusreplikation, förpackning, mognad och avstigning. Samtidigt är det också möjligt att C052 kan agera värd cellulära maskineri som var inblandade under sen viral livscykel 2.
Tabell 1. Plattan layout för dos-respons-analys. Den antivirala effekten av C052 var att utvärderad i en 96-brunnars skala inom den 384-brunnsplatta. Varje behandling, inklusive BTV-infektion plus olika C052 koncentrationer utfördes med åtta kopior. Vid 72 hpi var cellviabiliteten bestämdes med användning av CTG kit.
Tabell. 2 Plattan layout för Time-of-Addition (TOA) analys. TOA-analysen av C052 utvärderades i 384-brunnar som anges i layouten. Varje behandling, inklusive BTV infektion plus tid för att lägga till C052, genomfördes med åtta kopior. De -2 och -1 hpi visar att C052 lades till cellerna innan BTV-infektion. Vid 0 hpi ades BTV och C052 sattes samtidigt. Vid 72 hpi, var cellviabiliteten bestäms med hjälp av CTG-kit. Klicka här för att se tabellen .
Figur 1. Den antivirala effekten av C052. Celler infekterade med BTV på MOI på 0,01 i närvaro av tio olika koncentrationer av C052, som anges i figuren. Cellernas livsduglighet bestämdes vid 72 hpi, med användning av CTG kit. Varje datapunkt representerar medel och SD från fem replikat. Denna siffra har modifierats Gu et al. 2012 2.
Figur 2. Tids-of-tillägg analysen för C052. C052 på 2,5 mM och 0,27 mM, respektive, lades till BTV-infekterade celler vid olika HPI som anges, och skydd för C052 mot BTV inducerad CPE, eller cellviabilitet, mättes med hjälp av CTG-kit på 72 hpi Varje datapunkter representerade medelvärdets och SD från åtta oberoende replikat. Denna siffra har modifierats Gu et al. 2012 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För den första kartläggningen av antivirala hits, är en av de viktigaste stegen för antiviral läkemedelsforskning och utveckling för att utveckla kraftfulla analyser, vilket inkluderar att välja en mätbar markör, utveckla ett enkelt protokoll, få tillräckligt med signaler och mindre än 10% CV. De flesta biokemiska eller cellbaserade skärmar är utformade för att ge en kemisk startpunkt baserad på den mest robusta, enkla och billiga test, beroende på önskad reproducerbarhet i urvalsprocessen och det potentiellt stora antalet molekyler som skall screenas. CPE-baserad analys utsågs för att uppfylla dessa krav för att identifiera effektiva träffar från en stor substansbibliotek. CPE hänvisar till de negativa effekterna på de odlade cellerna associerade med förökningen av virus. Olika analyser finns att använda CPE indikatorn genom att mäta en mängd olika markörer som anger antalet döda celler (cytotoxicitet), antalet levande celler (livskraft) och mekanismenav celldöd (apoptos). Kommersiella reagenser för CPE-baserad analys är tillgängliga med en enkel analysprotokollet. Till exempel innehåller CTG kit singeln "blanda och mät" steg och har i stor utsträckning använts för att kvantifiera virus inducerade CPE. Dock är CPE-baserad analys begränsad till virus som kan framkalla en snabb CPE. För virus som inte inducerar snabb CPE har olika analyser utvecklats. Exempelvis replikonet baserad analys med användning av replikon-hysande cellinje möjliggör screening av inhibitorer för viral replikation, inklusive översättning, polyprotein bearbetning, och minus-och plus-sträng-RNA-syntes 12-14. Antisens-RNA strategier och virtuell screening av småmolekylära biblioteken även skulle kunna användas för att identifiera möjliga antivirala 15,16. Ändå är det viktigt att effekten av ett antiviralt läkemedel valideras i cellbaserat test in vitro som möjliggör utvärdering av antiviral effekt mot hela den virala livscykeln. CPE-baseradanalys har framgångsrikt anpassat till hög genomströmning format och är en av de mest pålitliga och robusta analys för screening av stora substansbibliotek, inklusive nyligen genomförda HTS filmvisningar mot influensavirus 6,17, svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus (SARS-CoV) 18 , arenavirus 19 och Reovirus (bluetongue virus) 5.
Analys dos-respons utsågs att ytterligare validera antiviral effekt av de träffar som identifierats via engångsdos CPE-baserad analys, vanligtvis efter screening av stora substansbibliotek. Dessa träffar, även identifierad med antiviral aktivitet, måste ytterligare bekräftelse att avslöja deras potential att bli ett läkemedel. Antiviral effekt av en förening skulle kunna avslöjas genom analys via EC50, CC 50 och SI 50 värde med hjälp av analys av dos-respons. Under tiden ut utanför mål eller falska positiva kommer att identifieras, och antalet bly compounds kan minskas. Via denna analys, kunde ordningen på sammansatta styrkor och toxicitet rangordnas för att rikta framtida antiviral läkemedelsforskning, särskilt för struktur-aktivitetssamband (SAR) analys och framtida läkemedelskemi modifiering. Faktum förening C052 var ett derivat av förening C003, som förknippas med god läkemedelsliknande egenskaper både in vitro och in vivo.
För att uppfylla kraven för en drog, det är ett måste för att bestämma dess MoA, det vill säga att karakterisera interaktionen av en förening med målet vid fysiologiska koncentrationer. Olika analyser har utvecklats av vissa antivirala medel, det vill säga att inte bara hämma målet utan att ha acceptabel löslighet, permeabilitet, proteinbindning, selektivitet, metabolism och toxicitet profiler. Eftersom jordbruksministeriet studier var låg genomströmning analys behöver mödosamma ansträngningar, endast ett fåtal utvalda molekyler, med potent EC50, hög CC 50 och hIGH SI 50 värde, kan lätt analyseras. En förståelse av MoA av en förening i detta skede kan fördjupa tolkningen av cellulär aktivitet eller dess frånvaro. TOA Studien är avsedd att begränsa det stadium när den antivirala interagerar med virus-eller värd mål. Att känna en förening är konkurrenskraftig med ett substrat i visst stadium viral livscykel kan ge en omedelbar riktning för vidare MoA analys. Alternativt mer potent cellbaserad analys med kända mekanismer, däribland analysen direkt screena för HIV-1-integrashämmare 20, inhibera virusbindning till yta-protein 21 skulle kunna användas vilka tillhandahåller känd MoA innan faktiska visningar 22. Samtidigt träffar från dessa screening kan väl relaterad till den utsedda MoA finns faktiskt MoA kan också behöva utsätta till ToA och annan mekanism av åtgärdsstudier.
Sammanfattningsvis, med hjälp av de tre analyserna som redovisas här, har vi framgångsrikt skärmad och identifieradeflera potenta antivirala medel mot BTV, inklusive C003 och C052 2. Särskilt SI 50 (av C052 var upp vid 306, vilket tydde på att C052 är mycket selektivt mot BTV. Via ToA och andra jordbruksministeriet studier som presenteras i den ursprungliga papper, föreslog vi att C052 kan vara en potentiell antiviralt medel interagerar med värd autophagy maskiner, skulle kunna utvecklas till en anti-BTV läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Projektet stöddes av bidrag 1R03MH08127-01 och 7R03MH08127-02 från NIH till Q. Li, och av effekterna medel från Institutionen för medicin vid UAB till Q. Li. Stöd från Molette fonden och Auburn University är uppskattad. Vi tackar också de tekniska assistans från Ms Pulin Che och Mr Volodymyr Musiienko under arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
