Summary
Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.
Abstract
BTV karşı potansiyel antiviral belirlemek için, biz geliştirdik optimize edilmiş ve burada sunulan üç deneyleri geçerliliği var. CPE-tabanlı tahlil, bir bileşiğin bir anti-viral etkinlik gösteren ve büyük bir bileşik librarisinin elenmesi için kullanılmıştır olup olmadığını değerlendirmek için geliştirilen ilk deney oldu. Bu arada, antiviral sitotoksisitesi da CPE temelli test kullanılarak değerlendirilebilir. Doz-yanıt deney seçilen antiviral etkinlik için aralığını belirlemek için dizayn edilmiştir,% 50 inhibitör konsantrasyonunu (IC50) ya da etkili bir konsantrasyonu (EC50), hem de sitotoksisite yelpazesini (CC 50), yani. ÖY tahlil BTV viral yaşam döngüsü veya ana hücresel makine üzerindeki olası etkisi sırasında yeni antiviral yatan mekanizmasını belirlemek için ilk MoA çalışma için kullanılmıştır. Bu deneyler, bir hücre kültürü sisteminde antiviral etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemli olan ve bizim yeni araştırmalara yol kullanılmaktadırBTV karşı yeni antiviral bir dizi tanımlanmasına ing.
Introduction
BTV Orbivirüs soyu, Reoviridae ailesi içinde bir prototip çift sarmallı bir RNA virüsüdür. BTV çapında 1,2 3000000000 $ / yıl kaybı, koyun, keçi, sığır ve diğer evcil hayvanlar da dahil olmak üzere evcil hayvanların en önemli hastalıklar, biridir. Egzotik BTV serotipi listelenen önemli bir hayvan patojen olan "USDA Ciddiyeti Yüksek Hayvancılık Patojenlerinin." Son zamanlarda, yeniden ortaya çıkan BTV Kuzey Avrupa'da 3,4 genelinde birçok ülkede önemli bir sığırlarda hastalık salgını ve koyunları neden oldu. , Ekonomik önem taşıyan bir sonucu olarak ve bir model sistem olarak, BTV geniş, moleküler genetik ve yapısal çalışmaların konusu olmuştur ve çeşitli aşılar geliştirilmiştir. Ancak, antiviral ilaç keşfi için tahlillerin uygun olmaması nedeniyle, BTV karşı hiçbir antiviral vardır.
Model sistem olarak BTV'ye kullanarak yeni yüksek verimli tarama (HTS) kampanyası, biz d, eveloped optimize edilmiş ve Arbovirüsler 5 karşı potansiyel geniş spektrumlu antiviral belirlemek için bir CPE-bazlı analiz valide. CPE-tabanlı tahlil, hızlı ve gözlemlenebilir CPE / apoptoz 5-7 virüslerin neden olduğu bir dizi karşı antiviral ilaç keşfi kullanılmıştır iyi bilinen bir deneyidir. Bizim sistemde, post BTV enfeksiyon, CPE HeLa, DUY ve HEK 293T 8 dahil omurgalı hücrelerinde açıktır. BTV kaynaklı CPE CellTiter Glo hücre canlılığı reaktif kiti (CTG kit) 9 dahil olmak üzere çeşitli hücre canlılığı algılama yöntemleri kullanılarak izlenebilir ve nicelendirilebilir. Bu kit, metabolik olarak aktif canlı hücrelerin varlığını işaret eder hücresel ATP miktarının göre kültür içinde canlı hücre sayısını sunulmuştur belirler. Optimum şartlarda, burada sunulan CPE-bazlı analiz "mix ve ölçmek" bir adım protokol ve istikrarlı Işıklı sinyalleri ile esneklik ile fizibilite gösterdi. Bu arada, toksik bileşikler gdrmhücre canlılığı cing bu CPE bazlı deneyde dışı bırakılacaktır. CPE-bazlı analiz ile sağlamlık ve BTV karşı antiviral ilaç keşfi için güvenilirlik göstermiştir, ve potansiyel antiviral talebi bileşik (ler altı yeni kümesinin tanımlanması için yol NIH Molecular Kütüphane Küçük Molekül Depo (MLSMR) taranması için kullanılmıştır ) 5.
Potansiyel antiviral bileşiği, CPE-bazlı analiz ile tespit edilmiştir, bu antiviral etkinliği ve sitotoksisite 2 aralığını belirlemek için on-konsantrasyon doz-yanıt deneyine tabi olması gerekir. Antiviral etkinlik,% 50 inhibe edici konsantrasyon (IC50) ya da% 50 etkili konsantrasyon (EC 50) olarak temsil edilen, esas-çizgi ve maksimum arasındaki virüs kaynaklı CPE yarım önleyen bir ilacın konsantrasyonudur. Antiviral sitotoksisitesi,% 50 sitotoksisite konsantrasyonu (CC 50), yani konsantrasyonudurtaban çizgisi ile en arasında sitotoksisitedeki% 50 uyaran bir ilacın. % 50 SI (SI 50) olarak ifade seçici endeksi (SI), virüs kaynaklı CPE karşı antiviral özgünlüğünü belirleyen CC 50 / IC50 hesaplanmaktadır. IC 50 (ya da EC 50), 50 CC ve SI değerleri, 50 bir antiviral bileşiği, kuvvetli ve daha fazla ilaç geliştirme için seçici olup olmadığını belirlemek için kritik ölçülerdir.
Bir in vitro antiviral herhangi bir aşikar toksisite göstermiştir, ancak önlenebilir virüs CPE ve üretken viral yaşam döngüsü neden olduğunda, onun Moa 2 karakterize etmek için önemlidir. Biz antiviral etkilenen viral yaşam-döngüsü olası adım (lar) belirlemek ÖY tahlilini yaparak böyle karakterizasyonu başlattı. Genel olarak, antiviral bileşiği, farklı zamanlarda öncesi ya da sonrası virüs enfeksiyonu hücrelere ilave edildi. Antiviral enfekte hücrelere ilave edildi durumunda hedef s göndermekönceki aşamada ilave edildi birine göre tep enfeksiyonun seyri sırasında, daha düşük aktiviteye sebep olur. Bu nedenle, TOD çalışma ya da viral yaşam döngüsü ya da viral yaşam çevriminde yer alan ana makine üzerinde, bir bileşiğin anti-viral etkinlik ve potansiyel hedef belirlemek için çok önemlidir.
Üç tahlilleri için, hücre canlılığı, üretici talimatlarına 5 ardından CTG kiti kullanılarak belirlenmiştir. Bu algılama sistemi çeşitli in-house yazılımı kullanılarak analiz edilebilir yeterli lüminesans sinyalleri verir. Her bir deney en az sekiz kopyaları ile üç nüsha olarak doğrulanmış ve uygulandı. Elde edilen tüm veriler için, ortalama değer (AVE), standart sapma (STDEV'leri) ve varyasyon katsayısı (CV) olmak üzere üç parametre, tahlilin sağlamlığını belirlemek için analiz edilmiştir. Tahlilin sağlamlığı belirlendikten sonra, bundan başka, veri analizi ve grafik olarak ve çeşitli biyoistatistiksel kullanılarak çizilirc aletleri 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücreler, virüs ve antiviral bileşikleri
- BSR hücreleri,% 5 fetal buzağı serumu (FCS) ihtiva eden bebek hamster böbrek bir türevi, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (BHK) hücreleri, 10, (DMEM) korumak, 100U/ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin.
- Üç analizi için,% 1 FCS, 100U/ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile DMEM içerisinde plaka hücreleri, 5, daha önce optimize edilmiş olarak. Bu ortam, her üç deneyleri için deney ortamı olarak adlandırılır.
- % 5 CO2 ve% 80-95 nem ve 37 ° C'de inkübatör içinde tüm hücreleri inkübe edin.
- Plak-saflaştırılması ve daha önce tarif edildiği gibi, 8 tipi 10 BTV (BTV-10) yayılır. Her belirlenen deneyleri için deney ortamında BTV-10 seyreltin.
- 10 mM'lik bir konsantrasyon ile bir stok oluşturmak için DMSO içinde tüm test bileşikleri çözülür. -20 ° C'de stokları Mağaza
- Adayı için deney ortamı kullanılarak arzu edilen konsantrasyonlara bileşikler seyreltind deneyleri 2.
2. CTG Kiti kullanılması CPE temelli Assay
- MicroFlo seçme dağıtıcı aracılığıyla, bir 384 çukurlu mikrolevhanm (16 x 24 kadar bir biçimde siyah) içine tohum BSR hücreleri. Tohum yoğunluğu da 5000 hücre / ve tohumlama hacim antiviral etkinliği analizi için 20 ul.
- Hücreler iyice plakasına yapışık gidene kadar 2-3 saat boyunca inkübe hücreleri.
- Her bir oyuğa 10 uM bir nihai konsantrasyonuna sahip bir antiviral bileşiği ilave edin. Tamamen karıştırın.
- İstenen bir tirenin BTV'ye seyreltilir ve her bir oyuğa gösterilen MOI ile 5 ul BTV'ye ekleyin. Kontrolü için iyi, tahlil medya 5 ul ekleyin. % 5 CO2 ve% 80-95 nem ve 37 ° C'de 72 saat için enfekte olmuş hücreleri inkübe edin.
- 72 HPI, çözülme ve kullanılmadan önce oda sıcaklığına CTG tampon ve liyofilize CTG tabakayı dengeye At. Th göre olan liyofilize enzim / alt-tabaka ve tampon reaktif karıştırılarak homojen CTG madde çözeltisini sulandırınE üreticinin talimatları.
- 15 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar deney plakaları dengelenmesi.
- Bir dağıtıcı ile her bir kuyucuğa CTG reaktiflerin eşit bir hacmi (25 ul) ilave edin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya bırakıldıktan sonra 0.1 saniye bir entegrasyon süresi ile, bir multi-mod okuyucusu kullanılarak ışık yayılması sinyalleri ölçer.
3. Doz-yanıt Deneyi
- Sırasıyla / oyuk anti-viral etkinliği tahlili için 20 ul ve sitotoksisite analizi için 25 ul bir hacim içinde ekim 5000 hücre bir çekirdek yoğunluğu olan bir dağıtıcı ile, (16 x 24 ile biçim siyah), bir 384-çukurlu Tohum BSR hücreleri .
- % 5 CO2 ve% 80-95 kadar hücreleri nem, 37 ° C'de 2-3 saat boyunca hücrelerin inkübe iyi levhaya eklenir.
- Tablo 1 'de gösterildiği gibi, (bir 96-çukurlu plaka eşdeğeri), her bir bileşik için 384 oyuklu plakanın çeyrek bölgesinde işlem deneyi. Her bir konsantrasyon için sekiz çoğaltır tahsisTek bir deneyde gösterilebilir. Sadece bileşikler olmadan virüs ekleyerek negatif kontrol olarak bileşik ve virüs eklemeden Pozitif kontrol olarak, ilk sütun ve son kolon (12 th) düzenleme.
- Deney ortamı içinde 50 uM bileşikleri seyreltilmiş ve 20 ul / oyuk anti-viral etkinlik tahlili için de, 2. sütuna ekleyin. 25 uM bir konsantrasyona kadar 8 kanallı yarı otomatik pipet kullanılarak bileşik beş kez karıştırın.
- 8 kanallı yarı otomatik pipet kullanılarak, 12.5 uM bir konsantrasyon elde etmek için iyice karıştırın, bir sonraki sütuna (3.) 2 nci sütunda 20 | il karışımı aktarın. 6.25 uM'lik bir konsantrasyon ile bir iki-kat seyreltme oluşturulması için bir sonraki sütuna (4.) 3 rd sütundan 20 ul karışım aktarılması ile bu işlemi tekrar edin. 11. sütun kadar bu iki kat seri seyreltme tekrarlayın. Aspire ve comp ekleme ve karıştırma sonrası 11. sütundaki karışımı 20 ul atmakound.
- 5 ul / göz hacminde ile sütun 11 den sütun 2 her bir göze, BTV'ye-10, 0.01, MOI göre ekleyin. Virüsü ilave edildikten sonra, her sütun içinde son bileşik konsantrasyonu olması gerekir: 2. sütunda 20 uM, sütun 3'te 10 uM ve 0.04 uM'lik nihai bir konsantrasyon ile sütun 11 aşağı iki kat seyreltme ile devam etti.
- Sütun 1, orta ve 5 ul hücre yalnızca (pozitif) kontrol ve BTV enfeksiyon olarak kolon 12 BTV 5 ul / göz tek kontrol (negatif) elde edildi.
- Sitotoksisite deneyi için 200 uM 'lik bir başlangıç konsantrasyonuna bileşikleri seyreltin. Benzer şekilde, 100 uM bir konsantrasyona 8 kanallı yarı otomatik pipet ile sütun 2 ve karışık 5x 25 ul / kuyucuk bileşik ekleyin. BTV katmayın.
- Komşu sütuna 3 sütun 2 25 ul aspire tarafından iki kat serisi seyreltme yürütmek ve son sütununda (12.) kadar devam etti. Kolon 12 de karıştırıldıktan sonra, aspirat ve m, 25 ul atmakkanşımı,. Sütun 2 de nihai konsantrasyon 100 uM olmalı ve 12. sütun 0.2 uM olmalıdır. Sütun 1, hücre tek kontrolüdür.
- Her ikisi de anti-viral etkinliği ve sitotoksisite analizi için,% 5 CO2 ve 72 saat sonra muamele için% 80-95 nem ve 37 ° C'de inkübe edin. (Protokol 2,5-2,7 adım) yukarıda tarif edildiği gibi CTG kiti kullanılarak hücre canlılığı ölçülür.
4. Time-of-ilavesi (TOA) Deneyi
- 5000 hücre / oyuk bir dağıtıcı ve tohum hacmi ile 15 ul / oyuk olan, bir 384-çukurlu bir mikrolevhadaki sütun 1-24 (x 24, 16 ile biçim siyah) elde edilen tohumlar BSR hücreleri.
- Her bir bileşik için, 384 oyuklu plakanın (Tablo 2) bir yarısında, her zaman noktası için sekiz kopyaları tüm yirmi dört sütun kullanır. 10 ul / oyuk deney ortamı ilave ederek hücreler sadece kontrol olarak sütun 1 atama. Mark sütun 24 5 ul / oyuk deney ortamı, bir ekleyerek BTV enfeksiyonu tek kontrol (negatif kontrol) ve25 ul / oyuk bir son hacme 0.01 MOl'de d 5 ul / kuyu virüs.
- Sütunda 2-22 farklı saat sonrası enfeksiyon (HPI) itibariyle antiviral etkinlik değerlendirme kolon, çift sayılı sütunları seçin. Bu sütunlar, 0.01 MOl'de 5 ul / oyuk ile BTV hücreleri enfekte etmektedir. HPI farklı olarak, ayrıca 25 ul / lik nihai bir hacim oluşturmak üzere her bir oyuğa 5 ul / göz miktarında seyreltilmiş bileşik ekleyin. Için belirtilen -2 ve -1 HPI önce BTV olduğu enfeksiyona BSR hücreleri bileşik ekleyin. 0 HPI için, aynı anda kültüre bileşik ve BTV'ye ekleyin.
- Bileşiği, sadece kontrol olarak Buna paralel olarak, (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16 belirlenmiş bu bileşik, farklı zaman noktalarında ilave edildi, sütun 3-23 arasındaki tek sayılı sütun tayin 24, 48 HPI). Bu sütunlar, 5 ul / oyuk deney ortamı ilave edin ve 5 ul / göz de 25 ul / lik nihai bir hacim oluşturmak için bileşik seyreltilmiştir.
- Tedaviden sonra, 37 ° C,% 5 CO2 ile% 80-95 nemde hücreleri inkübe.
- Daha önce (protokol 2,5-2,7 adımları) tarif edildiği gibi CellTiter-Glo kiti kullanılarak 72 HPI hücre canlılığı belirler.
5. Veri Analizi
- Çok modlu okuyucu yoluyla elde ışıldayan sinyallerine dayanan uygun içi yazılımı kullanarak önce tüm verileri işlemek. % 10 daha fazla bir değer gerektirir ortalama değeri (ortalama), her bir muamele için standart sapma (STDEV'leri) yanı sıra katsayı varyasyonu (CV), belirler.
- Bir biostatik ve grafik yazılım aracı için yukarıdaki yazılım işlenen verileri aktarın. EC 50 ve CC 50 değerlerini belirlemek için non-lineer regresyon analizi yürütmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Bileşik Antiviral etkinliği
Hücre bazlı CPE deneyi, geliştirilen en iyi ve daha önce tarif edildiği gibi 2,5 BTV karşı yeni antiviral belirlemek için ışık saçan tabanlı CTG kiti kullanılarak in vitro olarak doğrulanmıştır. On doz yanıt deney canlı hücreler 5,11 sunulan hücresel ATP miktarının göre kültür içinde metabolik olarak yaşayan hücrelerin sayısı ölçülerek belirlenmiş bir kurşun bileşiğinin antiviral etkinliği ve sitotoksisite yansıtmak için kullanılmıştır. Daha önceki çalışmada, potansiyel antiviral bileşiklerin bir dizi BTV 5 karşı HTS ile tanımlanan her bir kümeden bileşikler de dahil olmak üzere, değerlendirilir ve bunların türevleri ile de novo sentezi 2. edilmiştir. Kendi EC 50 göre, CC ve 50 SI 50, çok ümit vaat eden talebi bileşimleri kuvvetli antiviral etkinlik, düşük toksisiteli ve yüksek seçicilik ile tespit edilmiştir. Örneğin, compound052 (C052)0.27 ± 0.12 uM'lik bir EC50 (Şekil 1) 2 ve 82,69 uM bir CC 50, doğrusal olmayan regresyon altında hem de gösterilen tipik bir gerici eğrileri 2 analiz sahip olduğu saptanmıştır. C052 SI 50 kendi EC 50 ve 50 CC değerlere göre 306 belirlenmiştir. Nanomolar ölçek antiviral etkinlik, düşük toksisitesi, ve buna bağlı olarak yüksek SI 50 C052 BTV karşı güçlü ve seçici bir antiviral olabileceğini göstermiştir.
2. Antiviral bileşiği için potansiyel MoA
ÖY tahlil bileşikler tarafından hedef viral yaşam-döngüsü olası sahne (ler) belirlenmesi amaçlanmıştır. Önce BTV enfeksiyon 1 veya 2 saat sonra C052 eklerken, yani -1 ve -2 HPI, antiviral etkinliklerinin, C052 viral yaşam döngüsünün erken aşamalarında ötesinde hareket olabilir belirten nanomolar ölçek (Şekil 2) 2 kaldı Böyle virüs girdi olarak. FurtheC052 olarak, daha sonra 24 HPI olarak, enfekte olmuş hücrelere ilave edildi kadar rmore, antiviral etkinliği değişmemiştir. 32 HPI de ilave edildiği zaman, canlı hücre yüzdesi C052 viral yaşam döngüsünün bu aşamada daha az koruyucu olduğunu göstermektedir, C052 tedavi hücrelerinde azalmıştır. 48 hpi ilave edildiğinde, BTV-kaynaklı CPE den BSR hücrelere hiçbir koruma yoktu. Genellikle 24 hpi içinde enfekte hücrelerde tamamlanan BTV viral replikasyon ilk döneminden bu yana, bizim sonuçlar C052 gibi virüs çoğaltma, paketleme, olgunlaşma ve çıkış olarak BTV viral yaşam döngüsünün geç aşamalarında, hareket olabilir önerdi. Bu arada, C052 geç viral yaşam çevrimi esnasında 2 dahil edildi konakçı hücre makine üzerinde hareket edebilir olması da mümkündür.
Tablo 1. Doz-cevap analizi için plaka yerleşimi. C052 ve anti-viral etkinliği olduğu değerlendirilmesi384-kuyucuklu plaka içinde bir 96-çukurlu ölçekli d. BTV enfeksiyonu ayrıca farklı C052 konsantrasyonları dahil olmak üzere, her bir tedavi, sekiz kopyaları ile gerçekleştirildi. 72 HPI olarak, hücre canlılığı CTG kiti kullanılarak belirlenmiştir.
Tablo. Time-of-ilavesi (TOA) tahlili için yaklaşık 2 Plaka düzeni. Düzeni belirtildiği gibi C052 ve TOA deneyi 384-çukurlu plaka içinde değerlendirilmiştir. BTV enfeksiyon artı C052 ekleme süresi dahil her tedavi, sekiz kopyaları ile gerçekleştirilmiştir. -2 Ve -1 HPI C052 BTV enfeksiyondan önce, hücrelere ilave edildi olduğunu göstermektedir. 0 HPI olarak, BTV ve C052 aynı anda eklenmiştir. 72 hpi de, hücre canlılığı CTG kiti kullanılarak tespit edildi. tablosunu görmek için buraya tıklayın .
Şekil 1. Şekilde gösterildiği gibi C052. Hücreler antiviral etkinliği, C052 on farklı konsantrasyonları varlığında, 0.01 MOl'de BTV ile enfekte edilmiştir. Hücre canlılığı CTG kiti kullanılarak, 72 HPI belirlendi. Her veri noktası, beş kez tekrarlanmış olan araç ve SD temsil eder. Bu rakam, Gu ve diğ modifiye edilmiştir. 2012 2.
Şekil 2. Belirtildiği gibi, C052 için time-of-ilave deney. 2.5 mM ve 0.27 mM, sırasıyla, en C052, farklı HPI de BTV enfekte hücrelere ilave edildi ve BTV kaynaklı CPE veya hücre canlılığı C052 karşı korunması, kullanılarak ölçülmüştür 72 hpi Her veri noktalarında CTG kiti ortalama değeri temsilsekiz bağımsız suretin den s ve SD. Bu rakam, Gu ve diğ modifiye edilmiştir. 2012 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antiviral hit ilk tanımlanması için, antiviral ilaç keşfi ve geliştirilmesi için önemli adımlardan biri, ölçülebilir bir işaretleyici seçerek basit bir protokol geliştirme, yeterli sinyalleri ve daha az 10% CV elde içeren, sağlam deneyleri geliştirmektir. En çok biyokimyasal veya hücre bazlı ekranlar nedeniyle tarama işleminde gerekli tekrarlanabilirlik ve taranması için moleküllerinin potansiyel olarak çok sayıda, en sağlam, basit ve ucuz bir deneyde, dayanan kimyasal bir başlangıç noktası temin etmek üzere dizayn edilmiştir. CPE-bazlı analiz geniş bir bileşik kütüphaneden etkili hit belirlemek için bu gereksinimleri karşılamak için tayin edildi. CPE virüslerin çoğalması ile ilişkili kültürlenmiş hücreler üzerindeki olumsuz etkisi anlamına gelir. Çeşitli deneyler mekanizmasını ölü hücrelerin sayısı (sitotoksisite), canlı hücre sayısını (canlılığı) gösteren farklı işaretleri çeşitli ölçerek CPE gösterge kullanmak için kullanılabilir, vehücre ölümü (apoptosis). CPE-tabanlı tahlil için ticari reaktifler basit bir deney protokolü ile kullanılabilir. Örneğin, bir CTG kit "karıştır ve ölçmek" aşamasını kapsamaktadır ve yaygın virüs kaynaklı CPE ölçmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, CPE-bazlı analiz hızlı CPE neden olabilir virüs ile sınırlıdır. Hızlı CPE neden olmayan virüsler için, çeşitli tahliller geliştirilmiştir. Örneğin, replikon-barındıran hücre çizgisi kullanılarak replikon tabanlı tahlil, çeviri, poliprotein işleme, ve eksi ve artı-bükümlü RNA sentezi 12-14 dahil olmak üzere viral replikasyonu inhibitörleri için tarama sağlar. Antisens RNA stratejileri ve küçük-molekül kütüphanelerinin sanal eleme da mümkündür antiviral 15,16 tanımlamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, antiviral bir ilacın etkinliği, tüm viral yaşam döngüsü karşı antiviral etkinliğinin değerlendirilmesine izin in vitro hücre bazlı bir deneyde doğrulanmıştır olması önemlidir. CPE tabanlıDeney başarılı bir şekilde yüksek bir ürün formatında uyarlanmış ve influenza virüsü 6,17, ağır akut solunum yolu sendromu, koronavirüs (SARS CoV-) 18 karşı son HTS gerçekleştirilir gösterimleri de dahil olmak üzere geniş bir bileşik kütüphanelerinin taranması için en güvenilir ve sağlam tahlilinin biri olmuştur , 19, arenaviruses ve Reovirus (Bluetongue virüsü) 5.
Doz-cevap deneyi daha da genellikle büyük bir bileşiği kütüphanesinin taranması sonra tek doz CPE bazlı bir deneyde vasıtasıyla tanımlanan itibaren antiviral etkinliğini doğrulamak için tayin edildi. Bu şarkıları, antiviral aktivite ile özdeşleşmiş olsa da, bir ilaç haline gelmesi kendi potansiyellerini ortaya çıkarmak için desteklenmesi gerekmektedir. Bir bileşiğinin antiviral etkinliği EC 50, 50 CC ve doz tepki analizi kullanılarak SI 50 değeri ile analizi yoluyla ortaya olabilir. Bu arada, dışarı hedef dışı veya yanlış pozitif tespit edilecek ve kurşun comp sayısıbileşikleridir daralmış olabilir. Bu analiz yoluyla, bileşik yetilerin ve toksisitelerin düzen, özellikle yapı-aktivite ilişkisi (SAR) analiz ve gelecekteki tıbbi kimya değişiklik için, gelecek antiviral ilaç keşfi doğrudan sıralanır olabilir. Aslında, bileşim C052 in vitro ve in vivo hem de iyi bir ilaç-benzeri özellikleri ile ilişkili bileşik, C003, bir türevi oldu.
Bir ilaç için gereksinimlerini karşılamak için, fizyolojik konsantrasyonlarda hedefi olan bir bileşik arasındaki etkileşimi karakterize olan Moa, yani tespit etmek şarttır. Çeşitli deneyler, örneğin, hedef inhibe etmek için değil, aynı olarak kabul edilebilir çözünürlük, geçirgenlik, bağlayıcı proteinin, seçicilik, metabolizma ve toksisite profili olması, özellikle de antiviral geliştirilmiştir. MoA çalışmalar zahmetli çabaların, güçlü EC 50, yüksek CC 50 ve h ile sadece birkaç seçilmiş molekülleri, gerek düşük verim deneyi beriüksek SI 50 değeri, kolayca analiz edilebilir. Bir bu aşamada bir bileşiğin Moa anlamak hücresel aktivite yorumlanması veya onun yokluğu derinlik ekleyebilirsiniz. ÖY çalışma antiviral viral veya ana hedefleri ile etkileşime girdiğinde sahne daraltmak için atanır. Bir bileşiğin bilmek daha MoA analizi için hemen bir yön olabilir bazı kademeli viral yaşam döngüsü içerisinde bir alt-tabaka ile rekabet edebilir. Seçenek olarak ise, deneyde de dahil olmak üzere bilinen bir mekanizma ile daha kuvvetli bir hücre bazlı deney, direkt olarak protein 21 yüzey bağlanmasını inhibe virüsü, HIV-1 integraz önleyicileri 20 taranması gerçek gösterimleri 22 daha önce bilinen Moa sağlarlar kullanılabilir. Bu tarama gelen vurur belirlenen MoA iyi ilgili olsa da, aslında MoA de ÖY ve aksiyon çalışmaların diğer mekanizmasına tabi orada gerekebilir.
Özet olarak, burada rapor edilen üç tahliller kullanılarak, başarılı bir şekilde elenir ve belirledikC003 ve C052 2 dahil BTV karşı birkaç güçlü antiviral,. Özellikle, C052 SI 50 (C052 BTV karşı oldukça seçici olduğunu düşündürmektedir ki, 306 kadar oldu. ÖY ve orijinal çalışmada sunulan diğer MoA çalışmalar Via, biz C052 ev sahibi ile etkileşim potansiyel bir antiviral ajan olabileceğini önerdi otofaji makine, bir anti-BTV ilaç haline geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu proje hibe 1R03MH08127-01 ve NIH S. Li 7R03MH08127-02 tarafından desteklenen ve UAB Tıp Bölümü'nden IMPACT fonları tarafından S. Li edildi. Molette Fonu ve Auburn Üniversitesi desteği takdir edilmektedir. Biz de işin sırasında Bayan Pulin Che ve Sayın Volodymyr Musiienko gelen teknik yardımların teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
