Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50820
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

Summary

وقد وضعت ثلاثة فحوصات، بما في ذلك تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) القائم على الفحص، فحص الجرعة والاستجابة والوقت من بين الجمع (قسم) مقايسة، إلى أقصى حد، والتحقق من صحة استخدامها لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق رواية (BTV)، فضلا لتحديد آلية ممكنة من بين العمل (وزارة الزراعة) لمضادات الفيروسات التي تم تشخيصها حديثا.

Abstract

لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات محتملة ضد BTV، وضعنا، والتحقق من صحتها ثلاثة الأمثل المقايسات المقدمة هنا. وكان الفحص القائم على CPE الفحص الأولى وضعت لتقييم ما إذا كان مركب أظهر أي فعالية المضادة للفيروسات والتي استخدمت لفحص مكتبة مجمع كبير. وفي الوقت نفسه، ويمكن أيضا أن يتم تقييم السمسة من الأدوية المضادة للفيروسات باستخدام مقايسة على أساس CPE. وقد تم تصميم مقايسة بين الجرعة والاستجابة لتحديد نطاق فعالية للفيروسات المحدد، أي 50٪ تركيز المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال (EC 50)، فضلا عن مجموعة من السمية الخلوية (CC 50). كان يعمل مقايسة قسم لدراسة وزارة الزراعة الأولية لتحديد الآلية الأساسية من الأدوية المضادة للفيروسات الرواية خلال دورة حياة BTV الفيروسية أو تأثير ممكن على المضيف الآلات الخلوية. هذه المقايسات الحيوية لتقييم فعالية المضادة للفيروسات في نظام الثقافة الخلية، واستخدمت لأبحاثنا الأخيرة تؤديجي إلى تحديد عدد من الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV.

Introduction

BTV هو النموذج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي للفيروس في جنس الفيروسة الوقبية، والأسرة Reoviridae. BTV هي واحدة من أهم الأمراض من الماشية المحلية، بما في ذلك الأغنام والماعز والأبقار والحيوانات الأليفة الأخرى، مع 3000000000 $ / سنوات الضياع في جميع أنحاء العالم 1،2. وBTV المصلي الغريبة هو الممرض الحيوانية الهامة المدرجة في "وزارة الزراعة الأميركية العليا العواقب الثروة الحيوانية مسببات الأمراض." في الآونة الأخيرة، وإعادة الظهور BTV وقد تسبب انتشار واسع للمرض في الماشية والأغنام في العديد من البلدان في جميع أنحاء شمال أوروبا 3،4. نتيجة للأهمية الاقتصادية وكنظام نموذج، كان BTV موضوع الدراسات الجزيئية والجينية وهيكلية واسعة النطاق كما تم تطوير العديد من اللقاحات. ولكن نظرا لعدم وجود فحوصات المناسبة لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات، لا توجد الأدوية المضادة للفيروسات المتاحة ضد BTV.

في الآونة الأخيرة إنتاجية عالية الفرز (HTS) الحملة باستخدام BTV كما في النظام النموذجي، ونحن دeveloped، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها مقايسة على أساس CPE لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف محتملة ضد arboviruses 5. مقايسة على أساس CPE هو فحص معترف بها التي استخدمت في اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد عدد من الفيروسات التي يسببها السريع ويمكن ملاحظتها CPE / موت الخلايا المبرمج 5-7. في نظامنا، بعد الإصابة BTV، CPE هو واضح في خلايا الفقاريات، بما في ذلك هيلا، BSR، وكلوة الجنين البشري 293T 8. ويمكن رصد CPE BTV التي يسببها وكميا باستخدام مختلف أساليب الكشف عن خلية الجدوى، بما في ذلك CellTiter جلو عدة بقاء الخلية كاشف (CTG عدة) 9. يحدد هذه المجموعة عدد من خلايا قابلة للحياة في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقدمة، وهو ما يشير إلى وجود الخلايا الحية عملية الأيض نشطة. في ظل الظروف الأمثل، القائم على الفحص CPE المقدمة هنا أظهر جدواه مع "مزيج وقياس" البروتوكول خطوة واحدة، والمرونة مع إشارات الانارة مستقرة. وفي الوقت نفسه، المركبات السامة reduالوراثة بقاء الخلية سيتم استبعاد في هذا الاختبار القائم على CPE. وأظهر الفحص القائم على CPE متانة وموثوقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد BTV، واستخدمت لفحص NIH المكتبات الجزيئية الصغيرة جزيء مستودع (MLSMR)، الأمر الذي يؤدي إلى تحديد ستة العنقودية رواية المحتملة المضادة للفيروسات مركب الرصاص (ق ) 5.

عندما تم التعرف على مركب مضاد للفيروسات المحتملة باستخدام مقايسة على أساس CPE، وسوف تحتاج إلى أن تخضع لعشرة تركيز الجرعة والاستجابة فحص لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات والسمسة 2. فعالية المضادة للفيروسات، ممثلة على النحو تركيز 50٪ المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال 50٪ (EC 50)، هو تركيز للدواء الذي يثبط التي يسببها فيروس CPE في منتصف الطريق بين خط الأساس والحد الأقصى. السمسة الأدوية المضادة للفيروسات، أي تركيز السمسة 50٪ (CC 50)، هو تركيزمن المخدرات حمل 50٪ من السمسة بين خط الأساس والحد الأقصى. ويتم احتساب المؤشر انتقائية (SI)، كما تدل 50٪ SI (SI 50) من CC 50/50 IC الذي يحدد خصوصية المضادة للفيروسات ضد CPE التي يسببها الفيروس. وIC 50 (أو EC 50)، CC 50 و 50 SI القيم هي تدابير حاسمة لتحديد ما إذا كان مركب مضاد للفيروسات هو قوية وانتقائية لمزيد من التطوير المخدرات.

عندما أظهرت المضادة للفيروسات لا سمية العلني في المختبر، ولكن الفيروس منعت يسببها CPE والفيروسية دورة الحياة الإنتاجية، فمن المهم لتوصيف وزارة الزراعة 2 منها. بدأنا هذا التوصيف من خلال تنفيذ قسم فحص لتحديد الخطوات الممكنة (ق) من دورة الحياة الفيروسية التي يتأثر المضادة للفيروسات. عموما، أضيفت مجمع المضادة للفيروسات إلى الخلايا في أوقات مختلفة قبل أو عدوى فيروس آخر. إذا أضيفت مضادات الفيروسات إلى الخلايا المصابة إضافة إلى المستهدف قTEP أثناء الإصابة، فإنه من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بالمقارنة مع واحد والتي تم إضافتها قبل الخطوة. وبالتالي، دراسة قسم هو أمر حاسم لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات من مركب، والهدف إمكاناته، إما على دورة الحياة الفيروسية أو آلات المضيفة المشاركة في دورة الحياة الفيروسية.

لجميع المقايسات الثلاثة، تم تحديد بقاء الخلية باستخدام عدة CTG التالية تعليمات الشركة الصانعة 5. هذا النظام بإخراج الإشارات الكشف التلألؤ الكافية التي يمكن تحليلها باستخدام برامج مختلفة في المنزل. تم التحقق من صحة كل فحص، وأجرى على الأقل في ثلاث نسخ مع ثمانية النسخ المتماثلة. لجميع البيانات التي تم الحصول عليها، تم تحليل ثلاثة معايير، بما في ذلك القيمة المتوسطة (AVE) والانحراف المعياري (STDEV)، وشارك في كفاءة الاختلاف (CV) لتحديد متانة مقايسة. مرة واحدة وقد تم تحديد متانة الفحص، سيتم زيادة تحليل البيانات ورسم باستخدام مختلف الاستاتيكا البيولوجية والجرافيكأدوات ج 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الخلايا، والفيروسات والمركبات المضادة للفيروسات

  1. الحفاظ على خلايا BSR، وهو مشتق من الطفل الهامستر الكلى (BHK) الخلايا 10، في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تحتوي على 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
  2. لجميع المقايسات الثلاث، لوحة الخلايا في DMEM مع 1٪ FCS، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، كما الأمثل سابقا 5. يشار هذه الوسيلة كما مقايسة المتوسطة لجميع المقايسات الثلاثة.
  3. احتضان كل الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة.
  4. لوحة، وتنقية نشر 10 نوع BTV (BTV-10) كما هو موضح سابقا 8. تمييع BTV-10 في مقايسة المتوسطة لكل فحوصات معينة.
  5. حل جميع مركبات اختبار في DMSO لتشكيل الأوراق المالية مع التركيز على 10 ملي. تخزين الأسهم في -20 درجة مئوية.
  6. تمييع مركبات لتركيزات المطلوب باستخدام مقايسة المتوسطة لالمكلفد المقايسات 2.

2. الفحص استنادا CPE-باستخدام CTG كيت

  1. خلايا BSR البذور إلى 384 صفيحة ميكروسكوبية جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق MicroFlo حدد موزع. كثافة البذر هو 5،000 خلية / جيدا، وحجم البذر هو 20 ميكرولتر لتحليل فعالية المضادة للفيروسات.
  2. احتضان الخلايا لمدة 2-3 ساعة حتى الحصول على خلايا ملتصقة إلى لوحة بدقة.
  3. إضافة مركب مضاد للفيروسات مع تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى كل بئر. مزجها تماما.
  4. تمييع BTV لعيار المطلوب وإضافة 5 ميكرولتر BTV مع تدل وزارة الداخلية إلى كل بئر. للتحكم بشكل جيد، إضافة 5 ميكرولتر من وسائل الاعلام الفحص. احتضان الخلايا المصابة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة.
  5. في 72 HPI، ذوبان الجليد وتتوازن CTG العازلة وحكومة تصريف الأعمال الركيزة مجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. إعادة تشكيل متجانس حل كاشف CTG عن طريق خلط مجفف بالتجميد انزيم / الركيزة وكاشف العازلة وفقا لالتعليمات الشركة الإلكترونية لل.
  6. تتوازن لوحات مقايسة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  7. إضافة حجم مساو (25 ميكرولتر) من الكواشف CTG إلى كل بئر من قبل موزع. بعد احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وقياس الإشارات التلألؤ باستخدام قارئ متعدد الأوضاع مع الوقت التكامل من 0.1 ثانية.

3. الفحص الجرعة والاستجابة

  1. خلايا BSR البذور إلى 384 صفيحة ميكروسكوبية جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق موزع، مع كثافة البذر من 5،000 خلية / جيدا في حجم البذر من 20 ميكرولتر لفحص فعالية المضادة للفيروسات و 25 ميكرولتر من أجل سمية الخلايا الفحص، على التوالي .
  2. احتضان الخلايا لمدة 2-3 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة حتى الخلايا هي التي تعلق على لوحة جيدا.
  3. فحص عملية في منطقة الربع من لوحة 384 جيدا لكل مركب (أي ما يعادل 96 لوحة جيدا)، كما هو مبين في الجدول رقم 1. تخصيص ثمانية مكررات لكل تركيزفي فحص واحد. تعيين العمود الأول باسم مراقبة إيجابية دون إضافة مركب والفيروسات، والعمود الأخير (ال 12)، والسيطرة السلبية بإضافة الفيروس فقط دون المركبات.
  4. تمييع المركبات إلى 50 ميكرومتر في مقايسة المتوسطة وإضافة إلى العمود 2 الثانية في 20 ميكرولتر / جيد للفيروسات فعالية الفحص. مزج مركب خمس مرات باستخدام ماصة 8 قنوات شبه التلقائي إلى تركيز 25 ميكرومتر.
  5. باستخدام ماصة 8 قنوات شبه التلقائي، ونقل 20 ميكرولتر خليط 2 في العمود الثاني إلى العمود التالي (3 ش)، وتخلط جيدا لتشكيل تركيز 12.5 ميكرومتر. كرر هذه العملية عن طريق نقل 20 ميكرولتر من خليط العمود 3 الثالثة إلى العمود التالي (4 عشر) لتشكيل التخفيف شقين آخر مع تركيز 6.25 ميكرومتر. كرر هذا التخفيف المسلسل شقين حتى العمود ال 11. نضح وتجاهل 20 ميكرولتر من الخليط في العمود ال 11 بعد إضافة وخلط شركاتس اوند.
  6. إضافة BTV-10، على أساس من 0.01 وزارة الداخلية، إلى كل بئر من العمود إلى العمود 2 11 مع حجم 5 ميكرولتر / جيد. بعد إضافة الفيروس، ينبغي تركيز مركب النهائي في كل عمود يكون: 20 ميكرومتر في العمود 2، 10 ميكرومتر في العمود 3، واستمر مع التخفيف من شقين وصولا الى العمود 11 مع تركيز النهائي من 0.04 ميكرومتر.
  7. إضافة 5 ميكرولتر من المتوسطة إلى العمود 1 كما خلية التحكم فقط (إيجابية) و 5 ميكرولتر / جيد من BTV إلى العمود 12 كما العدوى BTV التحكم فقط (سلبي).
  8. تمييع المركبات إلى التركيز الأولي من 200 ميكرومتر لسمية الخلايا الفحص. وبالمثل، إضافة 25 ميكرولتر / جيد من مركب إلى العمود 2 5x ومختلطة مع 8 قنوات ماصة شبه التلقائي إلى تركيز 100 ميكرومتر. لا تضيف BTV.
  9. تنفيذ سلسلة التخفيف من شقين بواسطة الشفط 25 ميكرولتر من العمود إلى العمود 2 3 المجاورة، واستمرت حتى العمود الأخير (ال 12). في العمود 12، وبعد الاختلاط، ونضح وتجاهل 25 ميكرولتر من مixture. تركيز النهائي في العمود 2 ينبغي أن تكون 100 ميكرومتر ويجب أن يكون العمود 12 عشر عند 0.2 ميكرومتر. العمود 1 هو سيطرة خلية فقط.
  10. لكل فعالية وسمية الخلايا المضادة للفيروسات المقايسات، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة لمدة 72 ساعة بعد العلاج. قياس بقاء الخلية باستخدام عدة CTG كما هو موضح أعلاه (بروتوكول الخطوات 2،5-2،7).

4. الوقت من إضافة (قسم) الفحص

  1. خلايا BSR البذور من 1-24 عمود في صفيحة ميكروسكوبية 384 جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق موزع على 5،000 خلية / جيدا وحجم البذر هو 15 ميكرولتر / جيد.
  2. لكل مركب، والاستفادة من كافة الأعمدة الأربعة والعشرين مع ثمانية النسخ المتماثلة لكل نقطة في نصف الساعة من لوحة 384 جيدا (الجدول 2). تعيين العمود 1 كخلايا التحكم فقط عن طريق إضافة 10 ميكرولتر / جيد المتوسطة الفحص. العمود علامة 24 كما العدوى BTV التحكم فقط (مراقبة سلبية) وذلك بإضافة 5 ميكروليتر / الفحص جيدا والمتوسطةفيروس د 5 ميكرولتر / جيد في وزارة الداخلية من 0.01 إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد.
  3. حدد الأعمدة الزوجية من العمود 2-22 المضادة للفيروسات كما عمود تقييم فعالية في مختلف عدوى آخر ساعة (HPI). في هذه الأعمدة، تصيب الخلايا مع 5 ميكرولتر / جيد BTV في وزارة الداخلية من 0.01. في HPI مختلفة، وأيضا إضافة 5 ميكرولتر / مجمع المخفف جيدا إلى كل بئر لتشكيل الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد. لتدل -2 و -1 HPI إضافة المجمع لخلايا BSR قبل الإصابة BTV. ل0 HPI، إضافة المجمع وBTV للثقافة في وقت واحد.
  4. في موازاة ذلك، تعيين الأعمدة الفردية من العمود 3-23 كما مركب تسيطر فقط، منها مجمع أضيفت في مختلف نقاط الوقت كما المعينة (-2، -1، 0، 1، 2، 4، 8، 16، 24، 48 HPI). في هذه الأعمدة، إضافة 5 ميكرولتر المتوسطة / الفحص جيدا و5 ميكرولتر / جيد المخفف مجمع لتشكيل الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد.
  5. بعد العلاج، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 مع 80-95٪ الرطوبة.
  6. تحديد بقاء الخلية في 72 HPI استخدام عدة CellTiter-جلو كما هو موضح سابقا (بروتوكول الخطوات 2،5-2،7).

5. تحليل البيانات

  1. معالجة كافة البيانات أولا باستخدام المناسبة البرمجيات في المنزل استنادا إلى إشارات الانارة التي تم الحصول عليها عن طريق قارئ متعدد الأوضاع. تحديد القيمة المتوسطة (متوسط) والانحراف المعياري (STDEV) لكل معاملة، فضلا عن الاختلافات معامل (CV)، الأمر الذي يتطلب قيمة لا يزيد عن 10٪.
  2. نقل البيانات التي تتم معالجتها من البرنامج أعلاه إلى أداة البرمجيات biostatic والرسوم البيانية. تنفيذ تحليل الانحدار غير الخطية لتحديد قيم EC 50 CC و50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. فعالية المضادة للفيروسات من مجمع

تم تطوير CPE فحص خلية مقرها، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها في المختبر باستخدام القائمة على الانارة CTG عدة لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV كما هو موضح سابقا 2،5. كان يعمل الاستجابة فحص جرعة عشرة لتعكس فعالية المضادة للفيروسات والسمسة من مركب الرصاص حددت من خلال قياس عدد خلايا قابلة للحياة عملية الأيض في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقدمة في الخلايا الحية 5،11. في تقريرنا السابق، تم تقييم عدد من المركبات المضادة للفيروسات المحتملة، بما في ذلك مركبات من كل مجموعة تحديد عبر HTS ضد BTV 5، ومشتقاتها عن طريق دي نوفو توليف 2. استنادا EC الخاصة 50، 50 CC وSI 50، تم تحديد العديد من مركبات الرصاص واعدة مع فعالية المضادة للفيروسات قويا، سمية منخفضة والانتقائية العالية. على سبيل المثال، compound052 (C052)تقرر أن يكون لها EC 50 0.27 ± 0.12 ميكرومتر (الشكل 1) 2 وCC 50 من 82.69 ميكرومتر، على حد سواء تظهر منحنيات تنازلية نموذجية تحت الانحدار غير الخطية تحليل 2. وSI 50 من C052 تم تحديده في 306 استنادا EC 50 CC 50 وقيمها. وأشار فعالية على نطاق وnanomolar المضادة للفيروسات، سمية منخفضة، وبالتالي ارتفاع SI 50 C052 التي قد تكون مضادة للفيروسات قوية وانتقائية ضد BTV.

2. وزارة الزراعة المحتملة لمجمع المضادة للفيروسات

ويهدف الفحص إلى قسم تحديد مرحلة ممكنة (ق) من دورة الحياة الفيروسية التي استهدفتها المركبات. عند إضافة C052 في 1 أو 2 ساعة قبل العدوى BTV، أي -1 و -2 HPI، ظلت كفاءات المضادة للفيروسات على المستوى nanomolar (الشكل 2) 2، مشيرا إلى أن C052 قد تتصرف خارج مرحلة مبكرة من دورة الحياة الفيروسية، مثل دخول الفيروس. ابعد من ذلكrmore، ظلت فعالية المضادة للفيروسات دون تغيير حتى أضاف C052 إلى الخلايا المصابة في وقت لاحق إلى 24 HPI. عندما تضاف في 32 HPI، انخفضت النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة في الخلايا المعالجة C052، مشيرا إلى أن C052 كان أقل واقية في هذه المرحلة من دورة الحياة الفيروسية. عندما تضاف في 48 HPI، لم يكن هناك حماية للخلايا BSR من CPE BTV التي يسببها. منذ الدورة الأولى من تكاثر الفيروس BTV الانتهاء عادة في الخلايا المصابة خلال 24 HPI، اقترح نتائجنا أن C052 قد تتصرف في المراحل المتأخرة من BTV الفيروسية دورة الحياة، مثل تكاثر الفيروس، والتغليف، والنضج والخروج. وفي الوقت نفسه، فمن الممكن أيضا أن C052 قد تعمل على المضيف الأجهزة الخلوية التي شاركت في أواخر الفيروسية دورة الحياة 2.

الجدول 1
الجدول 1. وكانت فعالية المضادة للفيروسات من C052 تخطيط لوحة لفحص الاستجابة للجرعة تقييم د في نطاق 96 جيدا داخل لوحة 384 جيدا. تم إجراء كل معاملة، بما في ذلك العدوى BTV بالإضافة إلى تركيزات مختلفة C052، مع ثمانية النسخ المتماثلة. في 72 HPI، تقرر بقاء الخلية باستخدام عدة CTG.

الجدول 2
الجدول. 2 تخطيط لوحة للمرة عمرها بالإضافة إلى ذلك (قسم) مقايسة. تم تقييم الاختبار من قسم C052 في لوحة 384 جيدا كما هو مبين في التخطيط. كل معاملة، بما في ذلك العدوى BTV بالإضافة إلى وقت مضيفا C052، أجريت مع ثمانية النسخ المتماثلة. وHPI -2 -1 وتشير إلى أن C052 تم إضافتها إلى خلايا قبل الإصابة BTV. في 0 HPI، أضيفت BTV وC052 في وقت واحد. في 72 HPI، تقرر بقاء الخلية باستخدام عدة CTG. اضغط هنا لمشاهدة الجدول .

ithin صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. أصيب فعالية المضادة للفيروسات من C052. الخلايا مع BTV في وزارة الداخلية من 0.01 في وجود تركيزات مختلفة من عشرة C052، كما هو مبين في الشكل. تقرر بقاء الخلية في 72 HPI، وذلك باستخدام عدة CTG. تمثل كل نقطة بيانات الوسائل وSD من خمس مكررات. تم تعديل هذا الرقم من قو وآخرون. 2012 2.

الرقم 2
الشكل 2. تم إضافة فحص وقت من إضافة لC052. C052 عند 2.5 ملي و 0.27 ملم، على التوالي، إلى الخلايا المصابة في BTV HPI مختلفة كما هو مبين، وحماية ضد C052 CPE BTV التي يسببها، أو بقاء الخلية، تم قياسها باستخدام CTG مجموعة في 72 HPI كل نقاط البيانات يمثل قيمة المتوسطق و SD من ثمانية مكررات مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من قو وآخرون 2012 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتحديد الأولي من الزيارات المضادة للفيروسات، واحدة من الخطوات الرئيسية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات والتنمية هو وضع المقايسات قوية، والذي يتضمن اختيار علامة للقياس الكمي، ووضع بروتوكول بسيطة، والحصول على إشارات كافية وأقل من 10٪ السيرة الذاتية. وقد صممت معظم شاشات البيوكيميائية أو خلية مقرها لتوفير نقطة انطلاق الكيميائية على أساس أقوى وبسيطة وغير مكلفة الفحص، ويرجع ذلك إلى استنساخ المطلوبة في عملية الفرز وعدد كبير محتمل من الجزيئات ليتم عرضه. عين مقايسة على أساس CPE لتلبية هذه المتطلبات لتحديد الفعالية فعالة من مكتبة مجمع كبير. CPE يشير إلى تأثير سلبي على الخلايا المستزرعة المرتبطة تكاثر الفيروسات. هي فحوصات مختلفة متاحة للاستخدام من خلال مؤشر CPE قياس مجموعة متنوعة من علامات مختلفة تشير إلى عدد من الخلايا الميتة (سمية الخلايا)، وعدد من الخلايا الحية (الجدوى)، وآليةمن موت الخلايا (موت الخلايا المبرمج). تتوفر الكواشف التجارية للمقايسة على أساس CPE مع بروتوكول مقايسة بسيطة. على سبيل المثال، يتضمن عدة CTG في "خلط وقياس" خطوة واحدة واستخدمت على نطاق واسع لقياس الفيروس الناجم عن CPE. ومع ذلك، مقايسة على أساس CPE يقتصر على الفيروسات التي يمكن أن تحفز CPE السريع. بحثا عن الفيروسات التي لا تحفز CPE السريع، وقد وضعت مختلف المقايسات. على سبيل المثال، مقايسة على أساس ريبليكون باستخدام خط خلية إيواء ريبليكون يسمح الكشف عن مثبطات تكاثر الفيروس، بما في ذلك الترجمة، وتجهيز polyprotein، وناقص وزائد حبلا توليف الحمض النووي الريبي 12-14. كما يمكن استخدام استراتيجيات RNA العقاقير والفحص الظاهري للمكتبات الصغيرة جزيء لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات ممكن 15،16. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان أن فعالية العقاقير المضادة للفيروسات يمكن التحقق من صحة في فحص خلية مقرها في المختبر والتي تسمح بتقييم فعالية المضادة للفيروسات ضد كامل دورة الحياة الفيروسية. استنادا CPE-وقد تم تكييف الفحص بنجاح في شكل إنتاجية عالية ويعد واحدا من الفحص الأكثر موثوقية وقوية لفحص المكتبات مركب كبير، بما في ذلك إنجاز مؤخرا HTS غربلة ضد فيروس الانفلونزا 6،17، الحاد متلازمة الجهاز التنفسي التاجى (السارس COV) 18 ، arenaviruses 19، والفيروسة الريوية (فيروس اللسان الأزرق) 5.

عين مقايسة بين الجرعة والاستجابة لمزيد من التحقق من صحة فعالية المضادة للفيروسات من الضربات المحددة عن طريق جرعة القائم CPE فحص واحد، وعادة بعد الفرز مكتبة مجمع كبير. هذه الزيارات، على الرغم من تحديدها مع النشاط المضادة للفيروسات، تحتاج إلى مزيد من التأكيد لتكشف عن إمكاناتها لتصبح المخدرات. يمكن كشف فعالية المضادة للفيروسات من مركب من خلال تحليل عبر EC 50، CC 50 و 50 SI القيمة باستخدام تحليل الاستجابة للجرعة. وفي الوقت نفسه، من خارج الهدف أو ايجابيات كاذبة سيتم تحديدها، وعدد من الرصاص شركاتيمكن ضاقت ounds أسفل. من خلال هذا التحليل، يمكن أن يكون في المرتبة ترتيب الفعاليات المجمع والسميات لتوجيه المستقبل اكتشاف العقاقير المضادة للفيروسات، وخاصة بالنسبة للعلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) تحليل والمستقبل التعديل الكيمياء الطبية. في الواقع، كان مجمع C052 C003 مشتق من المركب، الذي يرتبط مع خصائص جيدة مثل المخدرات سواء في التجارب المختبرية والحية.

لتلبية متطلبات المخدرات، فإنه أمر لا بد منه لتحديد وزارة الزراعة لها، أي لوصف تفاعل مركب مع هدفه في تركيزات الفسيولوجية. وقد وضعت فحوصات مختلفة من الأدوية المضادة للفيروسات معينة، أي لمنع ليس فقط الهدف ولكن لديها القابلية للذوبان مقبولة، النفاذية، بروتين ملزمة، والانتقائية، والتمثيل الغذائي وسمية الملامح. منذ كانت دراسات وزارة الزراعة المنخفضة الإنتاجية التي تحتاج إلى جهود شاقة مقايسة، سوى عدد قليل من جزيئات محددة، مع امكانات EC 50، CC عالية و50 ساعةIGH SI 50 قيمة، يمكن تحليلها بسهولة. على فهم وزارة الزراعة من مركب في هذه المرحلة يمكن أن تضيف عمقا لتفسير النشاط الخلوي أو عدم وجوده. تم تعيينه في قسم دراسة لتضييق المرحلة عندما يتفاعل مع الأهداف المضادة للفيروسات الفيروسية أو المضيف. مع العلم مركب قادر على المنافسة مع الركيزة في بعض مراحل دورة الحياة الفيروسية يمكن أن توفر التوجيه الفوري لمزيد من التحليل وزارة الزراعة. بدلا من ذلك، فحص الخلايا أكثر فعالية تستند آلية مع المعروفة، بما في ذلك فحص الشاشة مباشرة لمثبطات HIV-1 integrase 20، تثبيط الفيروس ملزمة لسطح البروتين 21 يمكن استخدامها والتي توفر المعروف وزارة الزراعة قبل غربلة الفعلية 22. بينما يضرب من هذه الغربلة قد تتعلق جيدا إلى وزارة الزراعة المعين، وهناك في الواقع قد تحتاج أيضا إلى وزارة الزراعة تخضع لقسم وآلية أخرى من دراسات العمل.

باختصار، باستخدام ثلاثة فحوصات ذكرت هنا، قمنا بنجاح فحص وتحديدالعديد من الأدوية المضادة للفيروسات فعالة ضد BTV، بما في ذلك C003 C052 و2. على وجه الخصوص، كان SI 50 (من C052 وصلت إلى 306، مما يوحي بأن C052 هو انتقائية للغاية ضد BTV. فيا لقسم الدراسات وزارة الزراعة الأخرى المقدمة في الورقة الأصلية، اقترحنا أن C052 يمكن أن يكون وكيل المضادة للفيروسات المحتملة التفاعل مع المضيف آلات الالتهام الذاتي، ويمكن وضع في عقار مضاد للBTV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا المشروع من خلال منحة 1R03MH08127-01-02 و7R03MH08127 من المعاهد الوطنية للصحة لQ. لي، والأموال IMPACT من قسم الطب في البنك العربي المتحد إلى Q. لى. هو محل تقدير الدعم من صندوق Molette وجامعة أوبورن. نحن نشكر أيضا المساعدات الفنية من السيدة Pulin تشي والسيد فولوديمير Musiienko أثناء العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM medium Gibco 1134218 For cell culture
FBS Gibco 16000044 For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 1000185 For cell culture
DPBS Gbico 1049769 For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit Promega TB288 For cell viability measurement
70% ethanol Fisher S25309B Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10 ATCC VR-187
BSR cell Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader BioTek For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser BioTek Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate CORNING 28908031 For cell culture
Gen. 5 software BioTek For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5 GraphPad Version 5 For biostatic analysis and plot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Tags

علم المناعة، العدد 80، واكتشاف المخدرات، تقييم الدواء، ما قبل السريرية، الدراسات والتقييم، كما المواضيع، تقييم الدواء، دراسات الجدوى والبيولوجية الفحص والتكنولوجيا، الصيدلة، الفرز الفائق الإنتاجية فحوصات، أمراض الحيوان، تقنيات التحقيق، المضادة للفيروسات، فعالية، اللسان الأزرق الفيروسات، تأثير الاعتلال الخلوي، الاستجابة للجرعة، الوقت من بين الجمع وآلية للعمل،
فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q.… More

Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q. Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus. J. Vis. Exp. (80), e50820, doi:10.3791/50820 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter