Summary
Três ensaios, incluindo o efeito citopático (CPE) baseado em ensaio, o ensaio de dose-resposta e (TOA) ensaio de Tempo-de-adição ter sido desenvolvido, optimizado e validado e utilizado para identificar novos medicamentos antivirais contra o vírus da febre catarral (VFC), bem como para determinar o possível mecanismo de ação-de-(MOA) para antivirais recentemente identificados.
Abstract
Para identificar potenciais antivirais contra BTV, temos desenvolvido, otimizado e validado três ensaios aqui apresentados. O ensaio baseado CPE foi o primeiro ensaio foi desenvolvido para avaliar se um composto mostrou qualquer eficácia antiviral e foram utilizados para rastrear o composto biblioteca grande. Enquanto isso, a citotoxicidade dos antivirais podem também ser avaliadas utilizando o ensaio baseado em CPE. O ensaio dose-resposta foi concebido para determinar a gama de eficácia para o antiviral seleccionado, isto é, 50% da concentração inibitória (IC50), ou a concentração eficaz (EC 50), bem como a sua gama de citotoxicidade (CC 50). O ensaio ToA foi utilizado para o estudo inicial Moa para determinar o mecanismo subjacente dos novos antivirais durante BTV ciclo de vida viral ou o possível efeito sobre acolhimento maquinaria celular. Estes ensaios são essenciais para a avaliação da eficácia antiviral no sistema de cultura de células, e têm sido usados para nossas pesquisas recentes levamção para a identificação de uma série de novos medicamentos antivirais contra BTV.
Introduction
BTV é um protótipo de cadeia dupla de RNA vírus do gênero Orbivirus, família Reoviridae. BTV é uma das doenças mais importantes da pecuária nacional, incluindo ovelhas, cabras, gado e outros animais domésticos, com a perda de 3.000 milhões dólares americanos / ano em todo o mundo 1,2. O exótico sorotipo BTV é um importante patógeno animal enumerados nas "USDA alta Consequence Pecuária Patógenos". Recentemente, o re-emergente de BTV causou um grande surto da doença em bovinos e ovinos em vários países em todo o norte da Europa 3,4. Como resultado do seu significado económico e como um sistema modelo, BTV tem sido o objecto de estudos moleculares, genéticos e estruturais extensas, e várias vacinas têm sido desenvolvidos. No entanto, devido à falta de ensaios adequados para a descoberta da droga anti-viral, não existem medicamentos antivirais disponíveis contra BTV.
Em recente pesquisa de alto rendimento campanha (HTS), utilizando o sistema BTV como modelo, nós developed, otimizado e validado um ensaio baseado em CPE para identificar potenciais antivirais de amplo espectro contra arbovírus 5. Ensaio baseado CPE é um ensaio bem conhecido que tem sido utilizado na descoberta de drogas anti-viral contra um número de vírus que induzida rápida e observável CPE / apoptose 5-7. No nosso sistema, infecção pós BTV, CPE é evidente em células de vertebrados, incluindo HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE induzida por vírus da febre catarral pode ser monitorizada e quantificado usando vários métodos de detecção de viabilidade celular, incluindo o kit de reagente de viabilidade celular CellTiter Glo (kit CTG) 9. Este kit determina o número de células viáveis em cultura com base na quantificação de ATP celular apresentado, o que sinaliza a presença de células vivas, metabolicamente activas. Sob condições otimizadas, o ensaio baseado em CPE aqui apresentado mostrou sua viabilidade com o protocolo de um passo "misturar e medir", e flexibilidade com sinais luminescentes estáveis. Enquanto isso, os compostos tóxicos reducing viabilidade celular irá ser excluída no presente ensaio baseia-CPE. O ensaio baseado CPE mostrou a sua robustez e fiabilidade para a descoberta da droga anti-viral contra o vírus da febre catarral, e tem sido utilizada para rastrear o NIH Molecular Bibliotecas de Moléculas Pequenas Repository (MLSMR), que conduz à identificação de seis novos aglomerado de potencial composto principal antiviral (s ) 5.
Quando um composto antiviral potencial foi identificado usando o ensaio baseado em CPE, que terá de ser submetida ao ensaio de dose-resposta de dez concentração para determinar o intervalo de eficácia antiviral e citotoxicidade 2. A eficácia antiviral, representada como a concentração inibidora 50% (IC50) ou a concentração eficaz 50% (CE 50), é a concentração de uma droga que inibe a CPE induzida por vírus a meio caminho entre a linha de base e no máximo. A citotoxicidade dos antivirais, ou seja, a concentração de 50% de citotoxicidade (CC 50), é a concentraçãode um fármaco induzir 50% de citotoxicidade entre a linha de base e no máximo. O índice selectivo (SI), denotada como 50% de Si (SI 50) é calculado a partir de CC50 / IC 50, que determina a especificidade do anti-viral contra a CPE induzida por vírus. A IC50 (ou EC50), CC 50 e SI 50 valores são medidas importantes para determinar se um composto antiviral é potente e selectivo para o desenvolvimento de drogas.
Quando um antiviral mostrou nenhuma toxicidade manifesta in vitro, no entanto, impedido de vírus induzido CPE e o ciclo de vida viral produtiva, é importante caracterizar a sua MOA 2. Iniciamos tal caracterização através da realização de ensaio ToA para determinar a possível etapa (s) do ciclo de vida viral que é afetada pelo antiviral. Geralmente, composto antiviral foram adicionados às células em diferentes épocas pré-ou pós-infecção de vírus. Se os antivirais foram adicionados às células infectadas pôr ao seu alvo step durante o curso da infecção, ela iria resultar em menor actividade, quando comparada com a que foi adicionada antes do passo. Assim, o estudo ToA é crítico para a determinação da eficácia anti-viral de um composto, e o seu alvo potencial, quer no ciclo de vida viral ou a máquina hospedeira envolvidas no ciclo de vida viral.
Para todos os três ensaios, a viabilidade celular foi determinada utilizando o kit CTG seguindo as instruções do fabricante 5. Este sistema de detecção emite sinais de luminescência adequadas que poderiam ser analisadas por diversos softwares em casa. Cada ensaio foi validado e executada, pelo menos, em triplicado, com oito réplicas. Para todos os dados obtidos, três parâmetros, incluindo o valor médio (AVE), o desvio padrão (STDEV), e variação de co-eficiente (CV) foram analisados para determinar a robustez do ensaio. Uma vez que a robustez do ensaio foi determinado, os dados irão ser ainda analisada e representada usando vários biostatics e graficaferramentas c 2.
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Protocol
1. Células, vírus e a compostos antivirais
- Manter células BSR, de um derivado de rim de hamster bebé (BHK), células 10, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 100U/ml penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
- Para todos os três ensaios, células da placa em DMEM com 1% de FCS, 100U/ml penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, como anteriormente 5 optimizado. Este meio é referido como meio de ensaio para os três ensaios.
- Incubar todas as células na incubadora a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade.
- Placa-purificar e propagar o tipo 10 BTV (BTV-10), tal como descrito anteriormente 8. Diluir BTV-10 em meio de ensaio para cada ensaios designados.
- Dissolve-se todos os compostos de ensaio em DMSO para formar uma unidade com a concentração de 10 mM. Guarde os estoques a -20 ° C.
- Dilui-se os compostos a concentrações desejadas, utilizando meio de ensaio para o designadod ensaios 2.
2. Ensaio baseado no CPE utilizando o kit CTG
- Células BSR semente em um de 384 poços de microplacas (preto, formato de 16 x 24), através de MicroFlo selecione distribuidor. A densidade de sementeira é de 5.000 células / poço, e o volume de sementeira é de 20 uL para análise de eficácia antiviral.
- Incubar as células por 2-3 horas até obter células aderente à placa completamente.
- Adicionar composto antiviral com uma concentração final de 10 uM a cada poço. Misturá-lo completamente.
- Diluir a BTV título desejado e adicionar 5 mL de BTV com denotado MOI para cada poço. Para o controle bem, adicione 5 mL de meio de ensaio. Incubar as células infectadas durante 72 horas a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade.
- Aos 72 hpi, degelo e equilibrar tampão CTG CTG e o substrato liofilizado até à temperatura ambiente antes de usar. Reconstituir a solução homogénea reagente CTG misturando o liofilizado enzima / substrato e o reagente de tampão de acordo com a poinstruções e do fabricante.
- Equilibrar as placas de ensaio a temperatura ambiente durante 15 min.
- Adicionar um volume igual (25 ul) de reagentes de CTG para cada poço de um distribuidor. Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente na escuridão, medir os sinais de luminescência utilizando um leitor multi-modo, com um tempo de integração de 0,1 seg.
3. Ensaio de dose-resposta
- As células BSR semente em uma de 384 poços de microplacas (preto; formato de 16 x 24), através de um dispensador, com uma densidade de sementeira de 5000 células / cavidade em um volume de 20 ul de semeadura para ensaio de eficácia antiviral e 25 uL para o ensaio de citotoxicidade, respectivamente .
- Incubar as células durante 2-3 horas a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade até que as células estão bem ligados à placa.
- Processo de ensaio de um quarto da área da placa de 384 poços, para cada composto (equivalente a uma placa de 96 poços), como mostrado na Tabela 1. Alocar oito repetições para cada concentraçãonum único ensaio. Atribuir a primeira coluna como o controlo positivo sem adição de composto e vírus, e a última coluna (12 ª) como controlo negativo, adicionando apenas o vírus sem compostos.
- Dilui-se os compostos para 50 uM em meio de ensaio e adicionado à coluna 2 nd a 20 ul / poço para o ensaio de eficácia antiviral. Misturar o composto cinco vezes usando uma pipeta de 8 canais semi-automático para uma concentração de 25 uM.
- Usando uma pipeta semi-automática de 8 canais, transferir 20 ul de mistura em 2 ª coluna para a coluna seguinte (3 º), misturar bem para formar uma concentração de 12,5 | iM. Repetir este processo por meio da transferência de 20 uL de mistura de 3 a coluna para a coluna seguinte (4 mil) para formar uma outra diluição de duas vezes com uma concentração de 6,25 uM. Repita esta diluição em série de duas vezes até a 11 ª coluna. Aspirar e descartar 20 ul da mistura em 11 ª coluna após a adição e a mistura da amostraound.
- Adicionar BTV-10, com base na MOI de 0,01, para cada poço da coluna 2 para a coluna 11 com um volume de 5 ul / poço. Após a adição do vírus, a concentração de composto final em cada coluna devem ser: 20 uM em coluna de 2, 10 ^ M na coluna 3, e continuou com uma diluição de duas vezes para baixo para a coluna 11 com uma concentração final de 0,04 uM.
- Adicionar 5 mL de meio para a coluna como uma célula única de controlo (positivo) e 5 ul / poço de VFC à coluna 12, tal como infecção por vírus da febre catarral apenas controle (negativo).
- Dilui-se os compostos para uma concentração inicial de 200 pM para o ensaio de citotoxicidade. Da mesma forma, adicionar 25 ul / poço de composto para a coluna 2 e 5x misturado com pipeta semi-automática de 8 canais para uma concentração de 100 uM. Não adicione BTV.
- Realizar a diluição série de duas vezes por aspiração 25 mL da coluna 2 para a coluna vizinha 3, e continuou até a última coluna (12 º). Na coluna 12, depois de mistura, aspirado e descartar 25 ul de mixture. A concentração final na coluna 2 deve ser de 100 ^ M e a 12 ª coluna deve estar a 0,2 uM. A coluna 1 é o único controlo celular.
- Para ambos os ensaios de citotoxicidade e eficácia antiviral, incubar as placas a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade durante 72 horas pós-tratamento. Medir a viabilidade celular utilizando o kit CTG como descrito acima (protocolo passos 2,5-2,7).
4. Time-of-Adição (TOA) Assay
- Células BSR Semente da coluna 1-24 em 384 poços de microplacas (preto, formato de 16 x 24), através de um distribuidor em 5.000 células / poço e que o volume de semeadura é de 15 mL / poço.
- Para cada composto, utilizam todos os vinte e quatro colunas com oito réplicas para cada ponto de tempo no meio da placa de 384 poços (Tabela 2). Atribuir coluna 1 como células só controle adicionando 10 ul / poço de meio de ensaio. Mark coluna 24, tal como infecção por vírus da febre catarral apenas controle (controle negativo) pela adição de 5 ul / poço de ensaio meio de umd 5 ul / poço de vírus a uma MOI de 0,01 e um volume final de 25 ul / poço.
- Selecione as colunas de números pares da coluna 2-22 como antiviral coluna avaliação da eficácia em diferentes horas após a infecção (hpi). Nessas colunas, infectar as células com 5 mL / poço BTV no MOI de 0,01. No hpi diferente, também adicionar 5 uL / poço composto diluído a cada poço para formar um volume final de 25 ul / poço. Para o denotado -2 e -1 hpi adicionar composto de células BSR antes da infecção BTV. Para 0 hpi, adicione o composto e BTV para a cultura ao mesmo tempo.
- Em paralelo, designam as colunas com números ímpares de coluna de 3-23 como composto apenas controla, de que o composto foi adicionado em diferentes pontos de tempo como designado (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). Nestas colunas, adicionar 5 mL de meio / poço de ensaio e 5 pL / cavidade diluída composto para proporcionar um volume final de 25 ul / poço.
- Após o tratamento, as células incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, com 80-95% de humidade.
- Determinar a viabilidade celular às 72 hpi usando o kit de CellTiter-Glo, tal como descrito anteriormente (protocolo de passos de 2,5-2,7).
5. Análise de Dados
- Processar todos os dados utilizando software apropriado primeira in-house com base nos sinais luminescentes obtidos através do leitor multi-modo. Determinar o valor médio (média), o desvio padrão (STDEV) de cada tratamento, bem como as variações de coeficientes (CV), que requer um valor não superior a 10%.
- Transfira os dados processados a partir do software acima para uma ferramenta de software bioestático e gráfico. Levar a cabo a análise de regressão não-linear para determinar os valores de EC 50 e CC 50.
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Representative Results
1. Eficácia antiviral de composto
O ensaio de ECP de base celular foi desenvolvido, optimizado e validado in vitro utilizando o kit à base de CTG luminescente para identificar novos medicamentos antivirais contra BTV como descrito anteriormente de 2,5. O ensaio de resposta de dez dose foi empregada para reflectir a eficácia antiviral e citotoxicidade de um composto de chumbo identificados medindo o número de células metabolicamente viáveis em cultura com base na quantificação de ATP celular apresentado nas células vivas 5,11. No nosso relatório anterior, foram avaliados um número de potenciais compostos antivirais, incluindo compostos de cada cluster identificados via HTS contra BTV 5, e seus derivados por meio de síntese de novo 2. Com base na sua CE50, CC50 e SI 50, vários compostos de chumbo promissores foram identificados com potente eficácia antiviral, uma baixa toxicidade e uma elevada selectividade. Por exemplo, compound052 (C052)foi determinado para ter uma CE 50 de 0,27 ± 0,12 ^ M (Figura 1) 2 e um CC 50 de 82,69 uM, ambos mostrando curvas típicas regressivas sob a regressão não-linear analisa 2. O SI 50 de C052 foi determinada a 306 com base em suas EC 50 e CC 50 valores. A eficácia escala nanomolar antiviral, baixa toxicidade e, conseqüentemente, alta SI 50 indicou que C052 pode ser um antiviral potente e seletivo contra BTV.
2. MOA potencial para o composto antiviral
O ensaio ToA teve como objetivo determinar o estágio possível (s) do ciclo de vida viral alvo de compostos. Quando a adição de C052 a 1 ou 2 horas antes da infecção do vírus da febre catarral, ou seja, -1 e -2 hpi, as eficácias antivirais permaneceu na escala nanomolar (Figura 2) 2, o que indica que C052 pode agir para além da fase inicial do ciclo de vida viral, tais como a entrada do vírus. Furthermore, a eficácia antiviral permaneceu inalterada até C052 foi adicionado às células infectadas, como mais tarde como 24 hpi. Quando adicionado a 32 hpi, a percentagem de células viáveis diminuiu em células C052 de tratamento, indicando que o C052 foi menos protectora, nesta fase do ciclo de vida viral. Quando adicionado às 48 hpi, não havia proteção para as células BSR da CPE induzido por BTV. Uma vez que o primeiro ciclo de replicação viral BTV geralmente concluída em células infectadas dentro de 24 hpi, os nossos resultados sugerem que o C052 pode actuar nas fases tardias do ciclo de vida do vírus, tais como vírus da febre catarral, a replicação do vírus, a embalagem, a maturação e saída. Entretanto, é também possível que C052 pode actuar em máquinas celulares hospedeiras que foram envolvidas durante o final do ciclo de vida viral 2.
Tabela 1. O layout da placa para o ensaio de dose-resposta. A eficácia antiviral do C052 foi avaliard em uma escala de 96 poços na placa de 384 poços. Cada tratamento, incluindo a infecção pelo vírus da febre catarral mais diferentes concentrações C052, foi realizada com oito réplicas. Aos 72 hpi, a viabilidade celular foi determinada utilizando o kit CTG.
Table. 2 A disposição da placa para o ensaio de Tempo de adição (TOA). ToA O ensaio de C052 foi avaliada na placa de 384 poços, tal como indicado no esquema. Cada tratamento, incluindo a infecção pelo vírus da febre catarral, mais o tempo de adição de C052, foi realizada com oito réplicas. Os hpi -2 e -1 indicam que C052 foi adicionado às células antes da infecção por vírus da febre catarral. Em 0 hpi, BTV e C052 foram adicionados simultaneamente. Aos 72 hpi, a viabilidade celular foi determinada utilizando o kit CTG. Clique aqui para visualizar a tabela .
Figura 1. A eficácia antiviral de C052. Células foram infectadas com o vírus da febre catarral a MOI de 0,01, na presença de dez diferentes concentrações de C052, como indicado na figura. A viabilidade celular foi determinada às 72 hpi, utilizando o kit de CTG. Cada ponto representa média e desvio padrão de cinco repetições. Este valor foi modificado de Gu et al. 2012 2.
Figura 2. O ensaio do tempo-de-adição de C052. C052 a 2,5 mM e 0,27 mM, respectivamente, foi adicionado às células infectadas BTV em hpi diferente, como indicado, e a protecção contra o efeito citopatogénico do C052 BTV induzida, ou viabilidade celular, foi medida usando o kit CTG em 72 hpi Cada pontos de dados representado o valor médios e SD de oito repetições independentes. Este valor foi modificado de Gu et al., 2012 2.
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Discussion
Para a identificação inicial de visitas antivirais, um dos passos chave para a descoberta da droga anti-viral e de desenvolvimento consiste em desenvolver ensaios robustos, que inclui a selecção de um marcador quantificável, o desenvolvimento de um protocolo simples, obter sinais suficientes e menos do que 10% CV. A maioria das telas bioquímicos ou à base de células são projetados para fornecer um ponto de partida química baseada na mais robusta, ensaio simples e barato, devido à reprodutibilidade requerida no processo de seleção eo número potencialmente grande de moléculas a serem rastreados. O ensaio baseado em CPE foi designado para atender a esses requisitos para identificar acessos eficazes a partir de uma biblioteca de compostos de grande porte. CPE refere-se ao efeito adverso sobre as células em cultura associados com a multiplicação do vírus. Vários ensaios estão disponíveis para utilizar o indicador de CPE através de medição de uma variedade de diferentes marcadores que indicam o número de células mortas (morte celular), o número de células vivas (viabilidade), e o mecanismode morte celular (apoptose). Os reagentes comerciais para ensaio baseado CPE estão disponíveis com um protocolo de ensaio simples. Por exemplo, o kit inclui o CTG único "misturar e medir" passo e tem sido amplamente utilizada para quantificar o CPE induzido pelo vírus. No entanto, o ensaio à base de CPE é limitado a vírus que podem induzir CPE rápida. No caso de vírus que não induzem CPE rápida, vários ensaios foram desenvolvidos. Por exemplo, o ensaio baseado em replicão usando a linha celular albergando replicão permite o rastreio de inibidores da replicação virai, incluindo a tradução, processamento da poliproteína, e menos-e de cadeia positiva, a síntese de RNA de 12-14. As estratégias de RNA anti-sentido e da avaliação virtual de bibliotecas de moléculas pequenas podem também ser utilizados para identificar possíveis antivirais 15,16. No entanto, é fundamental que a eficácia de um fármaco anti-viral ser validado no ensaio à base de células in vitro que permite a avaliação da eficácia antiviral contra o ciclo de vida viral. Baseado no CPEensaio foi adaptado com sucesso para o formato de alta taxa de transferência e é uma das ensaio mais fiável e robusto para o rastreamento de bibliotecas de compostos de grande porte, incluindo recentemente realizadas HTS exames contra o vírus da gripe 6,17, grave síndrome coronavírus respiratória aguda (SARS-CoV) 18 , arenavírus 19 e Reovirus (vírus da língua azul) 5.
O ensaio dose-resposta foi designado para validar adicionalmente a eficácia anti-viral dos acessos identificados através do ensaio baseado em CPE dose única, geralmente após o rastreio de uma biblioteca de compostos de grande porte. Estas visitas, embora identificado com atividade antiviral, precisamos mais uma confirmação para revelar suas potencialidades para se tornar uma droga. Antiviral eficácia de um composto pode ser revelada através da análise via EC 50, CC 50 e SI valor 50 usando a análise da resposta dose. Enquanto isso, fora fora do alvo ou falsos positivos serão identificados eo número de chumbo miniaturaounds poderia ser reduzida. Através desta análise, a ordem de potências e toxicidades de compostos pode ser classificada para dirigir futuro a descoberta da droga antiviral, especialmente para a relação estrutura-atividade (SAR) análise e futura modificação química medicinal. Na verdade, o composto C052 foi um derivado de C003 composto, o qual está relacionado com boas propriedades medicamentosas tanto in vitro como in vivo.
Para atender aos requisitos de uma droga, é uma obrigação para determinar sua Moa, ou seja, para caracterizar a interação de um composto com o seu alvo em concentrações fisiológicas. Diversos ensaios têm sido desenvolvidas de determinados medicamentos antivirais, ou seja, não só de inibir o alvo, mas para ter solubilidade aceitável, a permeabilidade, a proteína de ligação de perfis, selectividade, toxicidade e metabolismo. Uma vez que estudos moa era ensaio baixo rendimento que necessitam de esforços laboriosos, apenas algumas moléculas selecionadas, com potente EC 50, alta de 50 CC e high SI 50 valor, poderia ser facilmente analisado. Uma compreensão do MOA de um composto, nesta fase, pode adicionar profundidade a interpretação da atividade celular ou sua ausência. O estudo ToA é designado para diminuir a fase em que o antiviral interage com alvos virais ou do hospedeiro. Conhecendo um composto é competitivo com um substrato em determinado ciclo de vida viral fase poderia fornecer uma direção imediata, para posterior análise MOA. Alternativamente, ensaio baseado em células mais potente com mecanismo conhecido, incluindo um ensaio de tela diretamente para o HIV-1 inibidores da integrase 20, inibindo a ligação do vírus à superfície da proteína 21 poderia ser usado que fornecem conhecido MoA antes projeções atuais 22. Enquanto pode muito bem relacionada com estes hits de triagem para o MOA designado, não realmente MoA também pode precisar submeter à toa e outro mecanismo de estudos de ação.
Em resumo, utilizando os três ensaios aqui relatados, temos rastreados e identificados com sucessovários antivirais potentes contra BTV, incluindo C003 e C052 2. Em particular, o SI 50 (de C052 subiu a 306, o que sugere que a C052 é altamente seletiva contra BTV. Via Toa e outros estudos MoA apresentados no artigo original, propusemos que C052 pode ser um potencial agente antiviral interagindo com o apresentador máquinas autofagia, poderia ser desenvolvida em uma droga anti-BTV.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este projecto foi apoiado pela concessão 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 do NIH para Q. Li, e pelos fundos IMPACTO do Departamento de Medicina da UAB para Q. Li. O apoio do Fundo Molette e da Universidade de Auburn é apreciado. Agradecemos também as assistências técnicas de Ms. Pulin Che eo Sr. Volodymyr Musiienko durante o curso do trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
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