Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

نيوكاسل فيروس المرض (NDV) وقد درس على نطاق واسع في السنوات القليلة الماضية من أجل تطوير ناقلات جديدة للتطعيم والعلاج وغيرها. وكانت هذه الدراسات ممكن نظرا لتقنيات لانقاذ الفيروس المؤتلف من [كدنا]، مثل تلك التي وصفنا هنا.

Abstract

نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، عضو النموذج الأولي للجنس Avulavirus من عائلة الفيروسات المخاطانية 1، هو غير مجزأة، السلبية، بمعنى، واحد الذين تقطعت بهم السبل، ويلفها فيروس الحمض النووي الريبي (الشكل 1) مع التطبيقات المحتملة كناقل للتطعيم و علاج الأمراض التي تصيب الإنسان. أصبح في عمق استكشاف هذه التطبيقات ممكنا إلا بعد إنشاء الوراثة تقنيات العكسي لانقاذ الفيروسات المؤتلف من البلازميدات ترميز الجينوم الخاصة بهم على أكمل وجه [كدنا] 2-5. [كدنا] الفيروسية يمكن تعديلها بسهولة في المختبر باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية لتغيير التركيب الوراثي للفيروس و / أو لتشمل وحدات جديدة النسخي. إنقاذ مثل هذه الفيروسات المعدلة وراثيا يوفر أداة قيمة لفهم العوامل التي تؤثر على مراحل متعددة من العدوى، وكذلك يسمح لتطوير وتحسين ناقلات للتعبير وإيصال المستضداتللتطعيم والعلاج. نحن هنا وصف بروتوكول لإنقاذ NDVs المؤتلف.

Introduction

نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، والفيروسة المخاطانية الطيور تنتمي إلى جنس Avulavirus 1، هو وكيل الحيوانية ذات الصلة من الناحية الاقتصادية، وبالتالي بحثها على نطاق واسع وsurveilled، والتي يمكن أن تؤثر بشدة على تربية الدواجن في جميع أنحاء العالم. وإن لم يكن العامل الممرض الإنسان، NDV كما تم دراسة وافية وراء المجال البيطري على حد سواء باعتبارها نموذجا الفيروسة المخاطانية ونظرا لاهتمام للغاية، والخصائص الطبيعية حال الورم 6. البحث عن NDV استفادت كثيرا من تطوير تقنيات الوراثة العكسية لاحد الذين تقطعت بهم السبل، غير مجزأة فيروسات RNA-بالمعنى السلبي، وصف لأول مرة لفيروس داء الكلب من قبل Conzelmann وcoleagues 2. مجموعة متنوعة من NDVs المعدلة وراثيا، التي تحمل الجينات أو تعديلات على النوع البري الجينوم الأجنبية وقد درس على نطاق واسع منذ ذلك الحين. العمل مع هذه الفيروسات المؤتلف كانت حاسمة لتوصيف عوامل الفوعة مختلفة ليس فقط من NDV ولكن أيضا من هوما الأخرى ذات الصلةن مسببات الأمراض مثل فيروس الانفلونزا 7 - أو الناشئة نيباه فيروس 8. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الدراسات المختلفة قد استكشفت استخدام هذه التقنيات لتحسين النشاط antitumoral الفطرية NDV 6،9،10، معظمها من خلال تعزيز خصائص مناعة من الفيروس. وكانت منطقة أخرى ذات الصلة من البحوث حول NDVs المؤتلف الجيل المرشحين لقاح ضد الأمراض الفيروسية الأخرى مثل الأنفلونزا 5،11،12، 13 فيروس نقص المناعة البشرية، والحصبة 14، 15 السارس، أو أن يسببها فيروس sincytial التنفسي (RSV) 16. بين مختلف المزايا التي تقدمها يذكر NDV هي نقص المناعة الموجودة مسبقا في التجمعات البشرية، واستقرار إدراج الأجنبية الوراثية، وقلة النشاط recombinatory وعموما لمحة سلامة عالية جنبا إلى جنب مع خصائص مناعة الطبيعية المذكورة آنفا 17. ومن الجدير بالذكر أيضا إمكانية استخدام لقاحات الثنائي التكافؤ المؤتلف في عoultry والفيروسات واقية ضد كل من NDV وأنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض 11،12. وهذا قد يكون وسيلة ممتازة لتقليل فرص انتشار هذا الأخير من البرية للحيوانات المستأنسة، مما يساعد أيضا على منع ممكن قفزة أمور محددة من إنفلونزا الطيور إلى البشر اللعين. أخيرا، استخدمت NDV، معربا عن مراسل لتقييم الاستجابات المناعية الفطرية وكذلك تحديد مضاد للفيروسات مضاد الفيروسات المشفرة بواسطة عدة 18-27.

عملية الانقاذ من المؤتلف، غير مجزأة، فيروس الحمض النووي الريبي السلبية تقطعت بهم السبل يتكون أساسا على إجبار مصطنع دورة تكاثر الفيروس في الخلايا المنتجة عليها بنقل كدنا] ترميز الحد الأدنى من الآلات الجزيئية المعدية، والمعروفة باسم بروتين نووي ريبوزي أو الأداء الملاحي المطلوب (الشكل 2). تتكون RNPs من بوليميريز الفيروسية (P و L البروتينات)، والبروتين النووي (NP) وكامل طول الحمض النووي الريبي antigenomic الفيروس. هذا الحمض النووي الريبي + antigenome هو القالب البريد اللازمة لجيل من الحمض النووي الريبي التكميلية-الجينوم، والتي، ويرتبط أيضا مع بقية البروتينات الفيروسية من الأداء الملاحي المطلوب، يلخص نفس المجمع المعدية أن الفيروس الطبيعية ستفرج عن سيتوبلازم الخلية على العدوى (الشكل 2A ). من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن للدورة الفيروسية المضي قدما بشكل طبيعي وvirions المؤتلف، encapsidating الجينوم تعديل، سيتم إنشاء (الشكل 2B). بشكل ملحوظ، ترنسفكأيشن من [كدنا] الجيني بدلا من [كدنا] antigenomic يضعف إلى حد كبير أو كليا تلغي الكفاءة الانقاذ 2،28-30. حتى عندما يتم transfected كدنا] antigenomic، كفاءة encapsidation من الحمض النووي الريبي المؤتلف في RNPs في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل هو على الارجح منخفضة للغاية. وبسبب هذا، بروتوكولات الانقاذ لNDV غالبا ما تشمل الخطوات المختلفة لالتضخيم من عدد قليل من الجسيمات الفيروسية التي صدرت من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل أصلا من قبل coculturing لهم خلايا متساهلة و / أو من قبلإصابة البيض المحتوي.

قبل الإنقاذ، [كدنا] يمكن التلاعب بها من إجراءات الاستنساخ القياسية من أجل توليد التعديلات المرغوبة. بينما الطفرات محددة من المنتجات المختلفة وتسلسل الجينات التنظيمية للفيروس يمكن أن يتحقق بشكل مباشر بهذه الطريقة، فإن العديد من الأعمال المنشورة التي تنطوي المؤتلف NDV وقد تطلب إضافة وحدة جديدة النسخي في جينوم فيروس النيوكاسل. مثل أعضاء آخرين من عائلة الفيروسة المخاطانية، الجينوم NDV بترميز ثمانية بروتينات مختلفة في ست وحدات النسخي، والتي يتم التعبير عنها بشكل مختلف اعتمادا على الاحترام مواقعها إلى 3 'نهاية التدرج في خفض الحرجة لدورة حياة الفيروسية 1. بسبب هذا، وموقع وحدة النسخي جديدة داخل الجينوم يجب اختيارها بعناية لتحقيق التوازن بين التعبير عن التحوير وضعف من تكاثر الفيروس. وقد استخدمت الإدراج بين P والجينات M أكثر، ركما تم اختبار مواقع أخرى هوغ 13،31.

مهما كانت إدراج، استنساخ [كدنا] في NDV يحتاج إلى اتباع بعض القواعد لإنشاء بناء rescuable: (ط) أي الجينات الجديدة التي ستدرج في جينوم NDV يجب أن يكون تحت سيطرة الإشارات المناسبة لالفيروسي RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي البلمرة. يجب إضافة هذه المتتاليات المنبع من إطار القراءة المفتوح الجديد (ORF) حتى بوليميريز يمكن التعرف على نهاية الجين السابق (GE) وبداية جديدة التحوير (GS)، متباعدة من جانب واحد النوكليوتيدات تسلسل بين الجينات (IG) . ينصح بإضافة كوزاك صالح (K) تسلسل لتحسين ترجمة حقيقية النواة الريباسي أيضا لتحسين بروتين الأجنبية التعبير 32، (ب) النسخ المتماثل كفاءة NDV، كما لمعظم أعضاء الأسرة الفيروسات المخاطانية، تعتمد على طول الجينوم كونها متعددة من 33 ستة، وبالتالي، فإن أي الإدراج في NDV أن يتبع هذا "حكم ستة". إذا لزم الأمر، مساالنيوكليوتيدات إضافية uired يمكن أن تضاف إلى المصب ORF جديدة، و (ج) يجب فحص تسلسل التحوير للعثور ممكن GE وGS مثل متواليات التي يمكن أن تضعف كفاءة الإنقاذ، والتعبير التحوير و / أو بقاء الفيروس. إذا كان موجودا، ويجب إزالة هذه تسلسلات الطفرات الصامتة. توليد المؤتلف طول كامل [كدنا] التالية القواعد المذكورة أعلاه هي الخطوة الأولى من أجل إنتاج بكفاءة NDV المعدلة وراثيا كما هو مفصل هنا.

في النظام جميع بنيات الحمض النووي هي تحت سيطرة الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 المروج (الشكل 3). يتم توفير هذه البلمرة حشوية في العابرة عن طريق عدوى مرافقة مع المؤتلف تعديل اللقاحية أنقرة فيروس (MVA-T7) 34. إظهار الشكل 3A البلازميد pNDV-B1، التي بترميز كامل طول كدنا] antigenomic 5. يبين الشكل 3B البلازميدات pTM1 ترميز NP، P و L ORFS. البلازميدات pCITE-GFP، الذي يشفر، شالتانجو المروج T7، وبروتين الفلورية الخضراء (GFP)، وpCAGGs GFP 18، الذي يشفر نفس ORF تحت المروج الدجاج بيتا أكتين 35، وتستخدم والضوابط. في هذا البروتوكول نقدم لك مجموعة من الإجراءات لإنقاذ المؤتلف NDV من [كدنا] من lentogenic NDV سلالة Hitchner B1 5 (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد خلايا الثدييات (الشكل 4A، يوم 1)

تقسيم التهاب الكبد-2 أو A549 الخلايا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن في 6 لوحات جيدة. كثافة الخلايا ينبغي أن تصل إلى 80-90٪ التقاء في اليوم التالي. عادة، يمكن تقسيم متموجة 100 مم طبق في 8 آبار (حوالي 1 × 10 6 خلايا لكل بئر). لكل فيروس لانقاذهم، ينبغي أن تدرج 2-4 آبار مختلفة، فضلا عن 2 آبار اضافية لعناصر pCAGGs-GFP وpCITE-GFP 18، والتي تهدف إلى مراقبة ترنسفكأيشن وMVA-T7 الكفاءة العدوى، على التوالي.

2. إصابة خلايا الثدييات مع المؤتلف التعديل فيروس الوقس أنقرة وإذ تعرب عن الجراثيم T7 RNA البلمرة (MVA-T7) (4A الشكل، يوم 2)

  1. الاحماء PBS 1x/BA/PS وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية.
  2. غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x/BA/PS.
  3. تصيب خلايا الثدييات مثقف مع فيروس MVA-T7 في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 1 PFU / خلية في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني / BA / فرع فلسطين لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. أثناء الحضانة الفيروسي العدوى، وإعداد خليط ترنسفكأيشن كما هو موضح في 3.

3. ترنسفكأيشن من خلايا الثدييات (الشكل 4A، يوم 2)

  1. إعداد Lipofectamine: مزيج 1-2 ميكروغرام من LPF2000 مع 250 ميكرولتر من OptiMEM في محاولة الانقاذ واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد الحمض النووي: إصنع كوكتيل البلازميد لكل الانقاذ في 50 ميكرولتر من OptiMEM. إضافة 0.4 ميكروغرام من pTM1-NP، 0.2 ميكروغرام من pTM1-P، و 0.2 ميكروغرام من pTM1-L في الأنبوب. إضافة 1 ميكروغرام من كامل طول استنساخ [كدنا] من NDV لانقاذهم لكل أنبوب. أيضا بإعداد اثنين transfections السيطرة، واحدة مع 2 ميكروغرام من pCAGGs-GFP (للتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن) والآخر مع 2 ميكروغرام من pCITE-GFP (للتحقق T7 البلمرة مدفوعة التعبير من قبل MVA-T7).
  3. بعد أن تم preincubated الحل LPF2000-OptiMEM لمدة 5 دقائق (الخطوة 3.1)، إضافة 250ميكرولتر من الحل للأنابيب الحمض النووي (الخطوة 3.2)، واحتضان لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد الحضانة مع MVA-T7، إزالة الفيروس عن طريق اللقاح الطموح واستبدال مزيج ترنسفكأيشن الحمض النووي LPF2000 (الخطوة 3.3).
  5. إضافة 1 مل من DMEM 10٪ FBS / PS إلى كل طبق.
  6. احتضان الخلايا المصابة / transfected لمدة 6-8 ساعة (أو بين عشية وضحاها) عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ثم قم باستبدال وسائل الإعلام ترنسفكأيشن مع 1.5 مل من DMEM الطازجة 10٪ FBS / PS.
  7. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، آبار المراقبة يمكن ملاحظتها تحت المجهر مضان لتقييم كفاءة ترنسفكأيشن (pCAGGs-GFP) والنشاط بوليميريز T7 (pCITE-GFP) (الشكل 5A). المضي قدما في التعاون ثقافة / الخلايا المصابة transfected مع الخلايا الليفية الطيور كما هو موضح أدناه.

4. شارك في ثقافة خلايا الثدييات مع خلايا الطيور (4A الشكل، يوم 3)

عادة، وهي متكدسة 100 ملم الأنسجة طبق الدجاج ثقافة (CEFs) سيستخدم بطة ص (DEFs) الخلايا الليفية الجنين في بئرين transfected. تأكد أن تعد، في وقت مبكر، وهو ما يكفي 100 ملم أطباق زراعة الأنسجة من خلايا الطيور في كل محاولات الإنقاذ. لإنقاذ كفاءة من الفيروس، وتستكمل DMEM 10٪ FBS / PS سائل الإعلام مع 5٪ من السوائل السقاء و 30 ملي MgCl 2. عند هذه النقطة، 24 ساعة بي، قد تبدأ خلايا الثدييات يظهر تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) بسبب الإصابة MVA-T7، asevident في الشكل 5A.

  1. الاحماء برنامج تلفزيوني 1X وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية.
  2. غسل خلايا الثدييات، 2X، مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  3. يعرض للتريبسين خلايا الثدييات مع 0.2 مل من EDTA-التربسين حتى فصل. resuspend الخلايا في 1 مل من DMEM 10٪ FBS / فرع فلسطين، والسوائل السقاء 5٪، 30 ملي MgCl 2 ونقل إلى 100 ​​ملم الأنسجة طبق الثقافة. إضافة 3 مل من نفس وسائل الإعلام.
  4. غسل خلايا الطيور، مرتين، مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  5. يعرض للتريبسين خلايا الطيور مع 1 مل من EDTA-التربسين واحتضان لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا. ال في resuspendخلايا البريد مضيفا 8 مل من DMEM 10٪ FBS / فرع فلسطين، والسوائل السقاء 5٪، 30 ملي MgCl 2 وإضافة 4 مل من الخلايا trypsinized إلى خلايا الثدييات في شارك في تربيتها 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة لحجم إجمالي 8 مل (4 مل الثدييات، 4 مل خلايا الطيور).
  6. يهز بلطف باليد الخلايا شارك في تربيتها في 100 مم في طبق أجل الحصول على توزيع موحد ومن ثم وضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام. معايير اصابة البيض بعد 3 أو 4 أيام شارك في ثقافة خلايا الثدييات والطيور يعتمد على مدى تأثير الاعتلال الخلوي لوحظ (التقريب الخلية والوفاة ومفرزة من على سطح الأرض، الخ.) في عدوى فيروسية MVA-T7.

5. إصابة أجنة الدجاج البيض (4A الشكل، يوم 6-7)

  1. بعد 3-4 أيام من ثقافة مشتركة من خلايا الثدييات والطيور، وإزالة 1 مل من طاف زراعة الأنسجة وإضافة إلى أنبوب إيبندورف.
  2. أجهزة الطرد المركزي لطاف زراعة الأنسجة لمدة 1 دقيقة في 12،000 دورة في الدقيقة في مقاعد البدلاءأجهزة الطرد المركزي لإزالة الحطام أعلى الخلوية.
  3. شمعة البيض باستخدام مربع تشميع الضوء لرؤية التفاعل بين كيس الهواء وجوف السقاء. جعل علامة على الحدود اجهة تجنب الأوعية الدموية التعريب. رذاذ الايثانول 70٪ على البيض لإقامة ظروف معقمة. جعل بلطف ثقب في قشر البيض على الفور ملحوظ وتطعيم 500 ميكرولتر من طاف باستخدام الأنسولين (1 مل) حقنة، وتهدف الإبرة عموديا ومباشرة في جوف السقاء. (الشكل 4B).
  4. ختم نيك في قشر البيض مع ذاب الشمع أو البارافين.
  5. احتضان البيض لمدة 2-3 أيام في 37 درجة مئوية.

6. حصاد السقاء من السوائل المصابة الدجاج أجنة بيض (4A الشكل، يوم 8-10)

  1. احتضان البيض المصابة لمدة 2-4 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لقتل الجنين الدجاج وتخثر الدم.
  2. رش البيض مع الايثانول 70٪ (للحفاظ على ظروف معقمة).
  3. الاستفادة بعناية القسم القمي من البيض، وأكثر من تجويف الهواء، مع ملعقة. بمجرد تصدع قشر البيض، وإزالة شظايا بالكامل مع ملقط وفضح غشاء السقاء.
  4. فضح جوف السقاء بواسطة استئصال الغشاء السقاء مع ملقط ومقص، وتجنب الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية وصفار البيض.
  5. دفع بعناية أسفل الجنين مع ملعقة وجمع السوائل السقاء upflowing (8-12 مل لكل بيضة) مع ماصة 10 مل. تجنب إتلاف غشاء الصفار. نقل السوائل السقاء إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل على الجليد (استخدام أنبوب واحد لكل بيضة).
  6. توضيح السوائل السقاء بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،500 دورة في الدقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد دون الإخلال بيليه.
  7. مخزن العينات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع، حتى فحصها لوجود NDV بواسطة التراص الفحص.

7. التراص (HA) الفحص

وجود الفيروس في allantالسائل منظمة المؤتمر الإسلامي من البيض المصابة يمكن تحديد ظاهريا من خلال قدرتها على hemagglutinate تركيا خلايا الدم الحمراء (RBC). في حالة NDV، يطلب ما يقرب من 10 6 البلاك تشكيل وحدات (PFU) لكل مل لإعطاء إشارة إيجابية في الفحص HA. وتجرى فحوصات HA في لوحات 96-V-جيدا أسفل. السلبية (PBS 1X، السوائل السقاء غير مصاب)، وكذلك إيجابية (السوائل السقاء من أي فيروس NDV) ينبغي أن يكون دائما وشملت عينات السيطرة في أي فحص HA للتحقق من صحة ذلك. لإجراء فحص HA:

  1. ماصة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر في لوحة V-96-أسفل جيدا.
  2. ماصة 50 ميكرولتر من العينات السوائل السقاء في الآبار في العمود الأول من لوحة. أداء التخفيفات التسلسلي 2 أضعاف خلال ما تبقى من لوحة وتجاهل الماضي، من خارج 50 ميكرولتر من الآبار في العمود الأخير.
  3. الاستغناء 50 ميكرولتر من 0.5٪ تركيا RBC في برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر. يهز بلطف لوحة عن طريق التنصت.
  4. احتضان لوحة في 4 ° C (أو الجليد) وأو يتم تشكيل 30-45 دقيقة أو حتى بيليه واضحة في آبار المراقبة السلبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنقاذ NDV هو إجراء راسخة، يقوم بشكل روتيني في المختبرات التي يمكنها الوصول إلى كدنا] كاملة من الفيروس. ومع ذلك، فإن الطبيعة العشوائية لا يتجزأ من أسلوب يجعل من الصعب تحقيق الكفاءة الإنقاذ 100٪. رصد خطوات مبكرة من العملية، خصيصا كفاءة ترنسفكأيشن والعدوى مع MVA-T7، ويساعد على تحديد المشاكل المحتملة ويبين الشكل 5A ترنسفكأيشن القياسية والكفاءة ترنسفكأيشن / العدوى التي تكفي لإنقاذ NDV ناجحة. بعد جولات من التضخيم في المشترك الثقافات الطيور والثدييات البيض المحتوي، تم الكشف عن وجود فيروس انقاذهم من قبل آبار إيجابية في الفحص HA. NDV يدفع التراص من خلال ربط كريات الدم الحمراء ويمنع ترسيب في أسفل على شكل حرف V بشكل جيد الآن. وبالتالي، قلة النشاط HA يمكن بسهولة أن تتميز تشكيل الأحمر، بيليه جولة من RBC (الشكل 5B). نتائج سلبيةفي مقايسة HA يمكن أن يكون راجعا إلى عدم كفاية عيار الفيروس في السوائل السقاء: الحد الأدنى من عيار 10 ما يقرب من 6 PFU / مل مطلوب أن يكون لها نتيجة إيجابية HA. لا يزال من الممكن الكشف عن التتر الفيروسية أقل بنسبة مقايسة التألق المناعي (IFA) باستخدام أجسام مضادة محددة لمكافحة فيروس النيوكاسل. ينصح مرور جديدة على البيض لمزيد من التضخيم من الفيروس الموجود في البيض الملقح لأول مرة في هذه الحالات.

الشكل 1
الشكل 1. تنظيم جينوم فيروس مرض نيوكاسل (NDV) وغير مجزأة، واحد الذين تقطعت بهم السبل، بالمعنى السلبي RNA جينوم فيروس النيوكاسل هو 15،186 النيوكليوتيدات (NT) لفترة طويلة وبترميز ثمانية البروتينية مختلفة في ست وحدات النسخي: NP، P، M، F، وبالإضافة إلى HN L V W والبروتينات، نشأت بعد التحولات في إطار القراءة من خلال P ORF النسخ. غير المكودة، متواليات التنظيمية الجناحالجينوم في 3 منه "(الزعيم) و 5 '(مقطورة) وينتهي. مزيد من غير المكودة نهاية الجين (GE)، بين الجينات (IG) وبداية الجين (GS) متواليات تنظيم النشاط بوليميريز الفيروسية في بين ORFS مختلفة. مستويات التعبير عن الجينات المختلفة على الجينوم الفيروسي تعتمد على احترامهم الموقع النسبي لنهاية 3 '(أي النصوص NP هي الأكثر وفرة، L النصوص على الأقل)، على نحو فعال خلق التدرج حاسمة للفيروس "دورة الحياة 1.

الرقم 2
الشكل 2. أساس NDV الانقاذ من الحمض النووي المستنسخة. مقارنة تخطيطي بين الطبيعي (A) واصطناعي (B) دورة خلال عملية الإنقاذ. (A) وبعد ربط إلى الخلية المستهدفة، وفيروس يطلق محتواه الجيني في السيتوبلازم encapsidated في RNPs. بوليميريز RNA المحاضر الحمض النووي الريبي الجينوم في المختلف في mRNA من البروتينات الفيروسية والى التكميلية، كامل طول الحمض النووي الريبي antigenomic + نسخة، وهو قالب لإنتاج نسخ متعددة من جينوم الأصلية التي سيتم دمجها في virions الوليدة. (B ) أثناء عملية الإنقاذ، ويتم توفير مكونات RNPs (NP، P و L البروتينات، فضلا عن كامل طول أو تعديلها عادة الحمض النووي الريبي antigenomic) من قبل [كدنا] ترنسفكأيشن. عند إعادة تشكيل RNPs antigenomic في سيتوبلازم الخلية transfected، فإنها يمكن أن تنتج التكميلية، RNPs الجينوم المؤتلف ويمكن لدورة كاملة ثم البدء من جديد، وتنتهي مع الافراج عن الفيروسات المؤتلف.

الرقم 3
الرقم 3. T7 يحركها البلازميدات التعبير لتوليد المؤتلف NDV. (A) طول كامل [كدنا] الفيروسية: ثه طول كامل pNDV-B1 الأمبيسلين المقاومة البلازميد القيادة تعبير عن lentogenic NDV سلالة Hitchner B1 antigenome تحت المروج T7 (P T7) وتسلسل T7 فاصل (T T7) تحتوي على التهاب الكبد دلتا Ribozyme (HDR) الانقسام. تم تصميم pNDV-B1 أصلا لحمل إدراج الأجنبي بين P و M الجينات 5. إدخال جين جديد (موقع XbaI) يتطلب إضافة نهاية الجين التنظيمية (GE)، بين الجينات (IG) وبداية الجين (GS) تسلسل للسماح اعترافها وظيفية من قبل البلمرة الفيروسية. الكفاءة التعبير عن التحوير يمكن تحسينها مع إضافة سلسلة كوزاك (K) المنبع بداية كودون 32. الكاسيت كله أدخلت على NDV [كدنا تحتاج إلى وجود عدد من النيوكليوتيدات القسمة على ستة لمتابعة "حكم ستة" 33 الذي يدفع تكرار كفاءة معظم الجينوم paramyxovius (B) البلازميدات التعبير البروتين:. الفيروسي NP، P، و ORFS L، يحيطبواسطة المروج T7 (P T7)، وUTR الفيروس encephalomyocarditis (EMC) وفاصل T7 (T T7) تم استنساخ تسلسل في العمود الفقري pTM1 الأمبيسلين مقاومة ناقلات الأمراض 5،36.

الرقم 4
الشكل 4. استنادا البلازميد تقنيات الوراثة العكسية لتوليد المؤتلف فيروس مرض نيوكاسل. (A) الفيروسية الإنقاذ: يصاب A549 أو التهاب الكبد-2 الخلايا مع فيروس اللقاحية تعديل أنقرة معربا عن T7 بوليميريز الجراثيم (MVA-T7). بعد العدوى الفيروسية، وخلايا وشارك transfected مع البلازميد التعبير اللازمة لتكرار ونسخ من NDV الجينوم الفيروسي (NP، P، وL)، جنبا إلى جنب مع كامل طول NDV [كدنا]، تحت المروج T7. أربع وعشرين ساعة post-infection/transfection، خلايا الثدييات هي شارك في تربيتها مع الدجاج أو البط الجنين الخلايا الليفية (CEF وDEF، على التوالي). بعد ثلاثة إلى أربعة أيام يتم تلقيح ثقافة مشتركة، والدجاج بعمر يوم و8-10 أجنة البيض مع supernatants زراعة الأنسجة من خلايا شارك في ثقافة لمزيد من التضخيم. بعد يومين إلى ثلاثة أيام حضانة البيض القديم يوم 8-10 عند 37 درجة مئوية، يتم حصاد السوائل السقاء من البيض وتحليلها لانقاذ ناجحة من الفيروس المؤتلف بواسطة HA الفحص. قد يكون) HA النتائج نظرا لعدم وجود ما يكفي من الفيروسات أن تكون - وتتميز الموجب (+) فيروسات أخرى في الإنقاذ الجيني (RT-PCR) والبروتين (مثل مقايسة التألق المناعي (IFA) وصمة عار الغربية (WB) مستويات السلبية (. . الكشف عنها بواسطة HA الإصابة مرة أخرى من الدجاج أجنة البيض الطازج لتضخيم الفيروس هو مبين (B) العدوى من الدجاج أجنة البيض: يتم candled 8-10 الدجاج البيض المحتوي للاحتفال واجهة بين كيس الهواء وجوف السقاء مع وجود الأنسولين. (1 مل) حقنة، يصاب البيض مع ثقافة طاف الأنسجة داخل جوف السقاءتاي، كما هو مبين.

الرقم 5
الرقم 5. نتائج ممثل. ويوضح ممثل الفلورسنت (يسار) ومشرق (يمين) مجالات خلايا A549 transfected مع pCAGGS-GFP (أعلى) أو المصابين MVA-T7 وtransfected مع pCITE-GFP (القاع): (أ) ترنسفكأيشن وMVA-T7 الكفاءة العدوى . التأسيسية GFP التعبير مدفوعا pCAGGS هو مؤشر على كفاءة ترنسفكأيشن، في حين T7 المروج مدفوعة GFP التعبير pCITE هو السيطرة على العدوى MVA-T7 T7 والنشاط البلمرة. تم تصوير الخلايا في 24 ساعة post-transfection/post-infection (B) مقايسة التراص (HA): وجود الجسيمات الفيروسية في السائل السقاء يدفع التراص، والذي يظهر بسبب عدم وجود بيليه في الجزء السفلي من شكل حرف V أيضا. عدم وجود الفيروس يسمح تشكيل بيليه الأحمر في الجزء السفلي من اله أيضا. الرقم يظهر كل الضوابط اللازمة لأي فحص HA (السلبية، والسوائل السقاء النظيفة؛ الإيجابية، عينة NDV تتميز بالفعل)، ونتائج ثلاث عينات غير معروفة تم الحصول عليها بعد عملية انقاذ، مع اثنين من الموجب (+) والسالب واحد (-) نتيجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العديد من العوامل التي يتعين النظر فيها لتحقيق نتائج جيدة في حين إنقاذ NDV. أولا، كدنا] بناء كامل طول لاستخدامها يحتاج إلى أن تكون مصممة للسماح إدماج وظيفية من الجينات المحورة الجديدة / التعديلات في جينوم فيروس النيوكاسل. وهذا يعني، كما ذكر أعلاه، أن (ط) نهاية المناسبة الجين (GE)، بين الجينات (IG) وبداية الجين (GS) المتتاليات هي التي يمكن ان تضاف إذا لزم الأمر، (ب) لا توجد GE GS أو متواليات المفترضة في الخارجية الجين، و (iii) الجينوم الكامل المؤتلف يلي "حكم ستة".

أما بالنسبة لعملية الإنقاذ، ونوعية الاستعدادات البلازميد، الأسهم MVA-T7 وكذلك الصيانة السليمة من الخلايا هي الحاسمة. بالنسبة لمعظم الحالات، وتنقية maxiprep القياسية من الحمض النووي البلازميد هو بما فيه الكفاية، على الرغم من الاستنساخ والإنقاذ عمليات صعبة، نظرا لحجم أو طبيعة الجينات المحورة، يمكن تحسينها من خلال تنقية الحمض النووي من خلال CSCL التدرج الكثافة الطرد المركزي. كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام لىpofectamine هو عادة ما يكفي لانقاذ ناجحة، على الرغم من طرائق نقل أخرى مثل nucleofection يمكن أن تستخدم أيضا. في أي حال، فإن نسبة من البلازميدات مختلفة تحتاج إلى الحفاظ عليها بدقة (0.4:0.2:0.2:1 لNP-PL-pNDV، على التوالي). نظرا لطبيعة شاقة والعشوائية بطريقة أو بأخرى في عملية الانقاذ، ينبغي transfected 2-4 على الأقل آبار مختلفة في بناء لانقاذهم، ويجب أن يعاير استنساخ مختلفة من نفس التركيبة.

في البروتوكول الذي وصفناها هنا، ونحن نستخدم MVA-T7 أن تقدم في العابرة بوليميريز T7 المطلوبة للتعبير عن بنيات كدنا] الفيروسية. في حين أن هذا هو الإجراء العادي في المختبر لدينا، فإنه ليس النهج الوحيد الممكن. على سبيل المثال، مجموعات أخرى انقذت بنجاح NDV وغيرهم من غير مجزأة، الفيروسات السلبية حبلا الحمض النووي الريبي باستخدام خطوط الخلايا معربا جوهري مستويات عالية من T7 البلمرة 4،37. توفر ناقلات المؤتلفأو خط الخلية ترميز T7 البلمرة، فضلا عن أداء محددة إما النهج في مختبر معين، يجب أخذها في الاعتبار عند إنشاء نظام الإنقاذ من جديد لفيروس النيوكاسل.

بعد تحديد وجود NDV في السوائل السقاء بواسطة HA، مزيد من الدراسات هي التي يتعين القيام بها لتحديد جميع خصائص الفيروس انقاذ حديثا، مثل RT-PCR تليها تسلسل الجينوم الفيروسي، IFA والغرب النشاف (WB) لتحديد التعبير من الجين الخارجية (إن وجدت). اعتمادا على طبيعة التعديلات التي فيروسات المؤتلف تحمل، ويمكن أيضا أن تكون هناك حاجة إلى نوع آخر من فحوصات البيوكيميائية والوظيفية.

إنقاذ المؤتلف NDV من [كدنا] هو تقنية مفيدة لأسباب متعددة. الأولى والأكثر وضوحا، ويوفر هذا الأسلوب مع القدرة على تحليل بيولوجيا NDV، وهو فيروس ذات الصلة اقتصاديا لصناعة الطيور، عن طريق تغيير الجينات تجريبيا ومتواليات التنظيمية. NDV هو الفيروسة المخاطانية ترتبط ارتباطا وثيقا مسببات الأمراض البشرية مثل الحصبة، النكاف أو فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي، وكذلك الناشئة، شديد العدوى والفيروسات هيندرا نيباه؛ البحوث على دورة الحياة الأساسية لهذه العائلة من الفيروسات المهم أن نفهم البيولوجيا الخاصة بهم. أبعد من البحوث الأساسية، NDVs المؤتلف لديها امكانات كبيرة لقاح وvectos حال الورم، والجمع بين إمكانية تحمل الجينات في الجينوم الجاليات الاجنبية مع ملف تعريف تقييمها بشكل جيد للسلامة الأحيائية. لجميع هذه الأسباب، ويمكن للبروتوكول الانقاذ NDV يكون رصيدا قيما للعديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم المهتمين في مجال البحوث الفيروس، تطوير لقاح وعلاج السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أدولفو غارسيا ساستري، هو مخترع براءات الاختراع على المؤتلف فيروسات مرض نيوكاسل التي يملكها مدرسة ايكان الطب في جبل سيناء.

Acknowledgments

سيكون الكتاب أود أن أشكر أعضاء في الماضي والحاضر في مختبرات الدكاترة. بيتر باليس وأدولفو غارسيا ساستري، لتطوير NDV عكس تقنيات الوراثة والمساعدة التقنية. ويتم تمويل البحوث في نيوكاسل فيروس المرض في AG-S المختبر جزئيا NIAD منح R01AI088770 وعن دائرة مركز الأمن الوطني للعلوم والتكنولوجيا التميز للالناشئة والأمراض الحيوانية المنشأ الحيواني (CEEZAD، الجائزة رقم 2010-ST-061-AG001). ويتم تمويل البحوث في LM-S المختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1 AI077719، R21NS075611-01، R03AI099681-01A1، ومراكز المعدية التميز لأبحاث الأنفلونزا والمراقبة (HHSN266200700008C)، وجامعة روتشستر المركز عن الدفاع البيولوجي المناعي النمذجة (HHSN272201000055C) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
  2. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
  3. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).
  4. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).
  5. Nakaya, T., et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).
  6. Zamarin, D., Palese, P. Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions. Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).
  7. Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction. J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).
  8. Park, M. S., et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins. J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).
  9. Zamarin, D., et al. Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses. Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).
  10. Vigil, A., et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus. Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).
  11. Swayne, D. E., et al. Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease. Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).
  12. Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).
  13. Carnero, E., et al. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. J. Virol. 83, 584-597 (2009).
  14. Kim, D., et al. Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies. J. Virol. 85, 200-207 (2011).
  15. DiNapoli, J. M., et al. Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).
  16. Martinez-Sobrido, L., et al. Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector. J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).
  17. Bukreyev, A., Collins, P. L. Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).
  18. Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).
  19. Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function. Virology. 331, 63-72 (2005).
  20. Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).
  21. Munoz-Jordan, J. L., et al. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).
  22. Cardenas, W. B., et al. Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).
  23. Mibayashi, M., et al. Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus. J. Virol. 81, 514-524 (2007).
  24. Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists. J. Virol. 81, 548-557 (2007).
  25. Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes. J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).
  26. Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels. J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).
  27. Andersson, I., et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).
  28. Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
  29. Kato, A., et al. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells. 1, 569-579 (1996).
  30. Durbin, A. P., et al. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology. 235, 323-332 (1997).
  31. Zhao, H., Peeters, B. P. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).
  32. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).
  33. Calain, P., Roux, L. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).
  34. Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells. Virology. 210, 202-205 (1995).
  35. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  36. Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. Product review. New mammalian expression vectors. Nature. 348, 91-92 (1990).
  37. Conzelmann, K. K. Reverse genetics of mononegavirales. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).

Tags

علم المناعة، العدد 80،
الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayllon, J., García-Sastre, A.,… More

Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter