Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolation, Kultur og transplantation af Muskel satellit celler

Published: April 8, 2014 doi: 10.3791/50846
Automatic Translation
1, 1, 1
1Stem Cell Institute, Paul and Sheila Wellstone Muscular Dystrophy Center, Department of Neurology, University of Minnesota Medical School

Summary

Isoleringen og kultur af en ren population af hvilende satellit-celler, en muskel stamcellepopulation, er afgørende for forståelsen af ​​muskel stamcellebiologiske og regenerering, samt stamcelletransplantation terapier i muskelsvind og andre degenerative sygdomme.

Abstract

Muskel satellit celler er en stamcelle population kræves for postnatal skeletmuskulatur udvikling og revitalisering, der tegner sig for 2-5% af sublaminal kerner i muskelfibrene. Hos voksne muskel, satellit-celler normalt mitotisk hvilende. Efter skaden dog satellit celler indlede cellulær proliferation at producere myoblaster, deres afkom, for at mægle regenerering af musklen. Transplantation af satellitbaserede celleafledte myoblaster er blevet bredt undersøgt som en mulig behandling for flere regenerative sygdomme herunder muskeldystrofi, hjertesvigt og urologiske dysfunktion. Myoblast transplantation i dystrofisk skeletmuskulatur, infarktramte hjerte, og funktionsforstyrrelser urin kanaler har vist, at transplanteret myoblaster kan differentiere i muskelfibre i værtsvævene og vise delvis funktionelle forbedringer på disse sygdomme. Derfor er udviklingen af ​​effektive oprensningsmetoder af hvilende satellit celler fra skelet muscle, samt etablering af satellit celleafledte myoblast kulturer og transplantationscentre metoder til myoblaster, er afgørende for at forstå de molekylære mekanismer bag satellit celle selvfornyelse, aktivering og differentiering. Derudover udviklingen af ​​cellebaserede behandlingsformer til muskelsvind og andre regenerative sygdomme er også afhængig af disse faktorer.

De nuværende potentielle oprensningsmetoder af hvilende satellit celler kræver anvendelse af dyre fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) maskiner. Her præsenterer vi en ny metode til hurtig, økonomisk og pålidelig rensning af hvilende satellit celler fra voksne mus skeletmuskulatur ved enzymatisk dissociation efterfulgt af magnetisk cellesortering (MACS). Efter isolering af rene hvilende satellit-celler, kan disse celler dyrkes for at opnå store mængder af myoblaster efter flere passager. Disse frisk isolerethvilende satellit celler eller ex vivo ekspanderede myoblaster kan transplanteres ind i cardiotoxin (CTX)-induceret regenererende mus skeletmuskulatur at undersøge bidraget fra donor-afledte celler til at regenerere muskelfibre samt satellit celle rum til undersøgelse af selv-fornyelse aktiviteter.

Introduction

Muskel satellit-celler er en lille population af myogene stamceller placeret under den basale lamina af skelet muskelfibre. De er kendetegnet ved ekspressionen af Pax7, PAX3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3 og calcitonin 1-3. Satellit celler har vist sig at være ansvarlig for muskelregenerationen som muskel stamceller. Hos voksne muskel, satellit-celler normalt mitotisk hvilende 4-8. Efter skaden er satellit celler aktiveres, indlede udtryk for MyoD, og indtast cellecyklus at udvide deres afkom, betegnes myogene præcursorceller eller myoblaster 3. Efter adskillige runder af celledeling, myoblaster forlade cellecyklen og sikring til hinanden med henblik på at undergå differentiering til multi-kerneholdige myorør, efterfulgt af modne muskelfibre. Myoblaster isoleret fra voksne muskel kan let udvides ex vivo. Kapacitet til myoblaster blive muskelfibre i regenererende muskler ogdanner ektopiske muskelfibre i nonmuscle væv udnyttes af myoblast transplantation, en potentiel terapeutisk tilgang til Duchennes muskeldystrofi (DMD) 4, urologisk dysfunktion 9, og hjertesvigt 10. Faktisk har myoblaster blevet transplanteret i musklen af både mdx (DMD model) mus og DMD patienter 11-14. De injicerede normale myoblaster fusionerer med værten muskelfibre at forbedre histologi og funktion af syge muskler. Tidligere arbejde viste, at subpopulationer af myoblaster er mere stamcelle-lignende og forbliver i en udifferentieret tilstand længere muskel under muskelregenerationen 5. Nyligt arbejde har vist, at frisk isolerede satellit celler fra voksne muskel indeholde en stamcelle-lignende befolkning, der udstiller mere effektiv transplantation og selv-fornyelse aktivitet i regenererende muskler 5-8. Derfor oprensning af en ren population af hvilende satellit celler fra voksne skelet muscle er væsentlige for forståelsen af ​​biologi, myoblaster og muskelregenerationen og til udviklingen af ​​cellebaserede behandlingsformer.

De nuværende potentielle oprensningsmetoder af hvilende satellit celler kræver anvendelse af et dyrt fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) maskine 1,2,6-8. Desuden FACS laserstråling tendens til at inducere celledød under adskillelse, hvilket medfører lavere udbytte af hvilende satellit celler 15. Her præsenterer vi en ny metode til hurtig, økonomisk og pålidelig rensning af hvilende satellit celler fra voksne mus skeletmuskulatur. Denne metode udnytter enzymatisk dissociation efterfulgt af magnetisk cellesortering (MACS). Efter isolering af rene hvilende satellit-celler, kan disse celler dyrkes for at opnå store mængder af myoblaster efter flere passager. Vi viser også, at intramuskulær injektion af disse frisk isolerede hvilende satellit celler eller ex vivo udvidet myoblaster kan transplanteres ind i cardiotoxin (CTX)-induceret regenererende mus skeletmuskulatur at undersøge bidraget fra donor-afledte celler til at regenerere muskelfibre, samt satellit celle rum til undersøgelse af selvfornyelse aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrene blev opstaldet i en SPF miljø og blev overvåget af Research Animal Resources (RAR) fra University of Minnesota. . Dyrene blev aflivet ved passende midler (CO 2 inhalation eller KCl indsprøjtning efter at være blevet bedøvet med IP injektion af Avertin (250 mg / kg) Alle protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC kodenummer: 1304-30.492 ) fra University of Minnesota.

1.. Isolering af mononukleære celler fra mus Skeletmuskel

  1. Korrekt ofre 1 eller 2 unge voksne mus (3-8 uger).
    1. Klem og udskærer maveskindet med en skarp saks. Peel off hud helt vise triceps og bagbenet muskel (trække huden i modsatte retninger).
    2. Fjern alle ben skeletmuskulatur (tibialis anterior, gastrocnemius og quadriceps) og triceps langs knogler med en saks. Derefter overføre muskler til iskold steril PBS i en 10 cm plade.
  2. Vask blod fra musklerne i PBS og overføre muskler til en ny steril 6 cm plade: 1 plade til 1-2 mus.
  3. Fjern bindevæv, blodkar, nerve bundter, og adipogenisk væv under en dissektion mikroskop.
  4. Med en saks for oftalmologi, klippe og hakke vævet til en glat masse (figur 1A og 1B). Prøv ikke at efterlade store stykker, da de ikke vil blive opdelt let af enzymet løsning.
  5. Overfør hakket muskler i en Falcon 50 ml rør, og der tilsættes 5 ml collagenase opløsning (0,2% collagenase type 2 i 10% FBS i DMEM). Inkuberes ved 37 ° C i 60 min.
  6. Tritureres (op og ned med en 18 G nål) at homogenisere blandingen (figur 1C). Derefter yderligere inkuberes blandingen ved 37 ° C i 15 min.
  7. Triturer igen for at homogenisere blandingen til at dissociere i enkelt celle suspension. Tilsæt 2% FBS i DMEM op til 50 ml i en enkelt cellesuspension og blandgodt.
  8. Placer en celle si (70 um) på en Falcon 50 ml rør (figur 1D). Overfør supernatanten indeholdende de dissocierede celler på et cellefilter og pipetteres cellesuspensionen op og ned på filteret, indtil det passerer igennem.
  9. Tæl celle nummer ved hemocytometer. Centrifuger rørene ved 2000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter; aspirere og supernatanten.
  10. Resuspender med 10 ml 2% FBS i DMEM. Centrifuger rørene ved 2000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter; aspirere og supernatanten.
  11. Resuspender med 200 pi 2% FBS i DMEM og overføre cellesuspension i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Normalt bør omkring 2 x 10 6 celler høstes fra musklerne i 1 mus. Cellerne vil blive fortyndet til en koncentration på 1 x 10 6 celler i 100 pi 2% FBS i DMEM.

2.. Antistoffarvning og separation med MACS

I den følgende procedures opretholde sterile betingelser ved anvendelse af sterile puffere. Hver mængde antistoffer tilsat, og cellesuspensionen medium beregnet for celler fra hele muskler 1 mus. Hvis celler høstes fra 2 eller flere mus, bør mængden af ​​reagenser skal optimeres.

  1. Tilsæt 1 pi hver af CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, og integrin α7 antistof i 200 pi af cellesuspensionen. Inkuberes på is i 30 min.
  2. Vask cellerne: Efter inkubation tilsættes 1 ml 2% FBS i DMEM til cellesuspensionen i 1,5 ml rør og centrifugeres ved 2.000 rpm ved 4 ° C i 3 minutter. Gentag dette trin to gange.
  3. Aspirer og kassér supernatanten.
  4. Resuspender celler med 200 pi 2% FBS i DMEM, og der tilsættes 10 ul Anti-PE Magnetiske perler. Inkuberes på is i 30 min.
  5. Vask cellerne: Efter inkubation tilsættes 1 ml MACS buffer til cellesuspensionen i 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 2.000 rpm ved 4 ° C i 3 minutter. Gentag dette trin twis. Bemærk, at celler skal vaskes af MACS buffer inden er adskilt af magnetisk kolonne.
  6. Aspirer og kassér supernatanten. Opblande cellerne med 1,0 ml MACS buffer.
  7. Opsæt LD kolonne på en magnetisk bord, og skyl søjlen med 2,0 ml MACS buffer (Figur 1E).
  8. Overfør cellesuspensionen på LD kolonne og indsamle fraktion gennemstrømning i et 1,5 ml rør. Denne fraktion indeholder PE-negative celler.
  9. Der centrifugeres ved 2.000 rpm ved 4 ° C i 3 min, aspireres og kassere supernatanten.
  10. Resuspender celler med 200 pi 2% FBS i DMEM, og der tilsættes 10 pi anti-mus IgG Magnetiske perler. Inkuberes på is i 30 min.
  11. Vask cellerne: Efter inkubation tilsættes 1 ml MACS buffer i cellesuspension i 1,5 ml rør og centrifugeres ved 2.000 rpm ved 4 ° C i 3 minutter. Aspirer og kassér supernatanten. Gentag dette trin to gange. Resuspender celler med 500 pi MACS buffer.
  12. Opsæt MS kolonne på en magnetisk bord, og skyl søjlen med 500 ul MACS buffer (figur 1F).
  13. Overførsel suspenderet celle opløsningen på MS kolonne og kassér gennemstrømning fraktion (Integrin α7-negative celler).
  14. Skyl med 1 ml MACS buffer, og gentag dette trin to gange.
  15. Efter skylning fjerne søjlen fra magnetfelt separator. Anvend 1,0 ml MACS buffer på søjlen og elueres magnetisk mærkede celler (Integrin α7-positive celler) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved at trykke sprøjtestemplet fra toppen af ​​søjlen. Opsaml gennemstrømning i et 1,5 ml rør. Gentag eluering med 1,5 ml MACS buffer og indsamle gennemstrømning.
  16. Der centrifugeres ved 2.000 rpm ved 4 ° C i 3 min, aspireres og kassere supernatanten.
  17. Resuspender oprensede celler med 1 ml myoblast medium (20% FBS indeholdt Hams F-10 med bFGF) og plade celler på Matrigelcoatede 10 cmplade med 8 ml myoblast Medium (5 ml i 6 cm plade) (Figur 1G). Bemærk, at 1-2 x 10 5 celler potentielt kan isoleres fra 1 intakt mus muskel.

3. Vedligeholdelse

  1. Foder celler hver anden dag med myoblast medium. Udseendet af voksende myoblaster er et lille og rund form udtrykker MyoD (figur 2) og Pax7 (data ikke vist) i deres kerne.
  2. Myoblaster skal passeres, før 50% konfluens, eller når du starter celle fusion. Efter skylning en gang med PBS, inkuberes cellerne med 0,25% trypsin-opløsning ved 37 ° C i 3 minutter i en CO2-inkubator og indsamle dissocierede celler med myoblast medium. Efter centrifuge celler (1.000 rpm i 5 min), suspendere med myoblast medium og replate celler på nye Matrigelcoatede plader. Collagen-coatede plader kan bruges efter passage 3. Ene plade kan normalt opdeles i 3-5 plader.

4.. Differentiation

  1. Refeed med Differentiering Mellem hver anden dag.
  2. Ved dag 1 i Differentiering Medium, myoblaster forlade cellecyklus og gennemgå differentiering i myosin tung kæde (MHC)-positiv myocytes. Disse myoctyes begynde celle fusion med hinanden for at generere flerkernede myorør. Typisk fleste myoblaster bliver MHC-positive differentierende mononukleære myocytes eller myorør (figur 2) ved dag 3-5 i Differentiering Mellem.

5.. Myoblast transplantation i mus til Skeletmuskel Regeneration

  1. Bedøve musen med Avertin (250 mg / kg) ved intraperitoneal (IP) injektion.
  2. Barbere huden hår rundt på tibialis anterior (TA) muskel. Fireogtyve timer før myoblast transplantation er 10 uM CTX (50 ul) intramuskulært injiceret i NOD / Scid mus TA muskel til at inducere muskelregenerationen via en 31 G insulinsprøjte gennem barberet hud (figur60, 3).
  3. Prolifererende myoblaster dissocieres med 0,25% trypsin-opløsning og centrifugeret ved 1.000 rpm i 5 min. Aspirer og kassér supernatanten. Resuspender 1 x 10 6 celler med 50 pi 2% FBS i DMEM. Overfør suspenderede celler i en 31 G insulinsprøjte.
  4. Recipientmus vil blive bedøvet med Avertin (250 mg / kg) ved IP-injektion, og 1 x 10 6 myoblaster (figur 2) er intramuskulært injiceret i regenererende TA muskel.
  5. Harvest TA muskel ved 1-4 uger efter celleinjektion til histologisk analyse (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Frisk isolerede hvilende satellit celler vise en lille, rund form (figur 1G) og hurtig Pax7 som en endelig markør for hvilende satellit celler. Mere end 90% af frisk isolerede celler udtrykker Pax7 (figur 1H og 1I). Mest forurenede celler fra blodlegemer, som ikke effektivt vokse in vitro efter myoblast dyrkningsbetingelser. Således satellit celleafledte myoblaster dominerer i kulturen. Eventuelt kan vi gentage trinnene for MS søjleoprensning (trin 2,11-2,14) for at forøge renheden af ​​isolerede satellit celler. Disse hvilende satellit celler træder cellecyklussen inden for 24 timer efter isolering underkastes myogene præcursorceller eller myoblaster. Disse celler kan passeres ved trypsinisering hver 4 dage indtil celleproliferationshastigheden reduceres. Typisk kan disse celler opretholdes, indtil passagen 10. Disse prolifererende myoblaster udtrykker MyoD ( (figur 2). Disse ex vivo ekspanderede myoblaster kan udnyttes til intramuskulære celle injektion eksperimenter til undersøgelse af myoblast bidrag til regenerere muskelfibre og selvfornyende satellit celler. Fireogtyve timer før celle injektion CTX injiceret i TA muskler af 2 måneder gamle NOD / Scid immunsvækkede mus. Dissocierede myoblaster injiceres i CTX-induceret regenererende muskel (figur 3). Den injicerede muskel kan høstes et par dage til flere måneder efter injektion. Donorceller er typisk genetisk mærket med grønt fluorescerende protein (GFP)-gen 6, β-galactosidase-genet 16 alkalisk phosphatase-gen 18 ved plasmid transfektion virusvektor infektion eller præparat fra transgene mus, der bærer et transgen. Satellit celler fra heterozygote Myf5 + / nLacZ mus 19, hvor myogene celler kan påvises efter X-gal-farvning, blev isoleret. De Myf5 + / nLacZ mus bærer nukleare β -. Galactosidasegenet indsat i Myf5 genlocuset, hvor β-galactosidase-genekspression rekapitulerer ekspressionen af endogene Myf5 i både satellit-celler og myogene præcursorceller eller myoblaster 20 3 viser hele TA Figur muskel-farvning til påvisning af nukleare β-galactosidase-positive donor-afledte celler, som omfatter prolifererende myoblaster, selvfornyende satellit-celler, og nydannede muskelfibre. Hvis det er nødvendigt, kan disse farvede TA muskler bruges til histologiske seKTIONER for yderligere immunodetektions metoder.

Figur 1
Fig. 1. Fremstilling af muskel satellit celler fra mus skeletmuskulatur. A:. Hakning dissekerede triceps og bagbenet muskel ved saks B:. Forstørret visning af panel A C: malende kollagenasebehandlede hakket muskel stykker med 18 G nål D:. Filtrerende dissocieret muskel forberedelse af cellefilter E:. MACS adskillelse af dissocierede muskelceller af LD kolonne F:. MACS separation af dissocierede muskelceller ved MS kolonne G:.. Frisk isoleret satellit celler H:. Pax7-positive frisk isolerede satellit celler I: DAPI farvning for panelet G.


Figur 2. Kultur af isolerede satellit celler. A, B, C: Anti-MyoD antistof-positive myoblaster afledt fra frisk isolerede satellit celler D, E, F:. Anti-myosin tung kæde (MHC)-positiv differentierende multi-kerneholdige myorør.

Figur 3
Figur 3.. Intramuskulær injektion af ekspanderede myoblaster i mus skeletmuskulatur. A: X-gal farvning af myoblaster isoleret fra Myf5 + / nLacZ mus B, C:. Intramuskulær injektion af Myf5 + / nLacZ myoblaster i TA muskel. Myf5 + / nLacZ mus i regenererende muskelfibre. X-gal farvning blev udført på TA muskel injiceret med myoblaster med 1 måned.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, kan hvilende satellit celler let oprenses fra voksen skeletmuskulatur af mus ved collagenasefordøjelse og overflade antistof-medieret MACS separation. Denne metode tager cirka 6 timer og behøver ikke noget dyrt udstyr, såsom en FACS-maskine. Desuden er denne metode relativt billig i forhold til overfladen antistofmedieret FACS adskillelse. Et højere udbytte af hvilende satellit celler forventes også i forhold til FACS for denne metode, da FACS laserstråling tendens til at inducere celledød under adskillelse 15. Andre isolation metoder såsom preplating eller enkelt muskelfiber dyrkningen kræve et par dage til kultur, og dermed disse metoder er gode til aktiverede satellit celler eller myoblast isolation. Dog kan hvilende satellit celler ikke oprenses ved disse metoder. Preplating metoder udelukker fibroblast forurening på grundlag af deres tilslutning forskellen mellem aktiverede satellit celler og myoblasts 21. Aktiveret satellit celle eller myoblast udvækst opstår under enkelt muskelfiber kultur 22. Vi bemærker også, at yngre mus (1-2 måneder gamle) viser et højere udbytte af hvilende satellit celler (1-5 x 10 5 / mus) renses ved denne MACS separation metode i forhold til ældre mus. Imidlertid er renheden af ​​hvilende satellit celler fra beskadigede muskel reduceret efter denne overflade antistof-medierede MACS oprensning da den beskadigede muskel indeholder mere infiltrerede blodlegemer. For MACS separation af hvilende satellit celler, udnyttede vi CD45, CD31 og Sca-1 som celleoverflademarkører for negativ selektion. CD45 er en maker for pan-hæmatopoietiske celler; CD31 er en markør for endotelceller; Sca-1 er en markør for både endotelceller og interstitielle celler 23. Til positiv selektion, vi udnyttet en anti-integrin α7 monoklonalt antistof, der farver hvilende satellit celler samt nogle nonmuscle celler i skeletmuskel. Flere grupperogså anvendes et anti-integrin α7 antistof til FACS-baserede hvilende satellit celle oprensning i kombination med andre positive og negative selektionsmarkører 7,24. Desuden kan andre grupper anvendes antistoffer mod CXCR4 25 CD34 7, Syndecan-3 26 eller Syndecan-4 27 som positive selektionsmarkører for FACS-baserede hvilende satellit celle oprensning. En SM/C-2.6 monoklonalt antistof blev også anvendt til den positive selektion, mens epitopen for dette monoklonale antistof ikke er identificeret endnu 1. Ingen af ​​disse positive selektionsmarkører er hvilende satellit cellespecifik. Derfor er afgørende for at opnå en høj renhed af hvilende satellit celler efter sortering fuldstændig afskaffelse af sådanne nonsatellite celler, der udtrykker disse positive selektionsmarkører. Det kan være mere hensigtsmæssigt at bruge satellit cellespecifikke celleoverflademarkører såsom M-cadherin som en positiv selektionsmarkør.

Freshly isolerede hvilende satellit celler kan bruges til gen-og protein udtryk profiler, kultur eksperimenter for at få myoblaster og celle transplantation for satellit-celle selvfornyelse eksperimenter og celleterapi. Tidligere arbejde viste, at genekspressionsprofiler er væsentligt forskellige fra aktiverede satellit-celler, som kan forklare nogle af de biologiske forskelle mellem disse to celletyper (såsom celler i hvilende fase vs. Aktiv celledeling) 1, 28. Nyligt arbejde har vist, at frisk isolerede hvilende satellit celler besidder signifikant højere transplantation og selv-fornyelse aktivitet sammenlignet med aktiverede satellit celler eller myoblaster når transplanteret ind regenererende muskel 6-7. For eksempel mindre end 100 hvilende satellit celler viser robust bidrag til regenerere muskelfibre samt selvfornyende satellit celler 5,7. Derfor kan hvilende satellit celler isoleres end testet for deres potentiale til effektivt at indpode i beskadiget muskler, deres bidrag til muskelfiber regeneration, og deres forbedring af muskel funktion i DMD patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt deklareret.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Shahragim Tajbakhsh for at levere Myf5 + / nLacZ mus. Vi takker også Alexander Hron og Michael Baumrucker for kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Muskelsvindfonden Association (MDA) og Gregory Marzolf Jr. MD center Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Tags

Cellebiologi skeletmuskulatur muskel stamceller satellit celle regenerering myoblast transplantation muskelsvind self-fornyelse differentiering myogenese
Isolation, Kultur og transplantation af Muskel satellit celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, … More

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter