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Bioengineering

के व्यवस्थित विश्लेषण Published: October 16, 2013 doi: 10.3791/50866
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 6, 1,2,3,4,5
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Summary

यह अध्ययन काफी physiologically प्रासंगिक कतरनी प्रवाह के तहत सेल रोलिंग पढ़ाई के throughput बढ़ाने, एक बहु - अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली का इस्तेमाल किया. झरना और रोगियों में कोशिकाओं की एक्सोजेनस आबादी की प्रणालीगत प्रसव के बाद सेल घर वापस आना के महत्व को घर वापस आना बहु कदम सेल में सेल रोलिंग के महत्व को देखते हुए इस प्रणाली सेल आधारित चिकित्सा में सुधार के लिए एक स्क्रीनिंग मंच के रूप में क्षमता प्रदान करता है.

Abstract

सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक बड़ी चुनौती प्रणालीबद्ध नसों या intraarterial अर्क निम्न ब्याज के ऊतकों को उच्च क्षमता के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा को लक्षित करने की अक्षमता है. नतीजतन, सेल घर वापस आना बढ़ती वर्तमान में सेल थेरेपी में सुधार करने के लिए एक रणनीति के रूप में अध्ययन किया है. संवहनी endothelium पर रोलिंग सेल सेल घर वापस आना की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है और एक समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर (PPFC) का उपयोग इन विट्रो जांच की जा सकती. बहरहाल, यह खराब नियंत्रित प्रवाह की स्थिति के साथ एक बहुत ही कठिन है, कम throughput परख है. इसके बजाय, हम ठीक नियंत्रित, physiologically प्रासंगिक कतरनी प्रवाह 1,2 के तहत एक उच्च throughput में सेलुलर रोलिंग गुणों के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है कि एक बहु - अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली का इस्तेमाल किया. इस पत्र में, हम पी और ई selectin में लिपटे सतहों पर और साथ ही सेल monolayer में लिपटे सतहों पर एच. एल -60 (मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया) कोशिकाओं के रोलिंग गुण readil कैसे हो सकता है दिखानेY जांच की. बेहतर भड़काऊ शर्तों अनुकरण, microfluidic चैनल सतह तो काफी गतिशील परिस्थितियों में एच. एल -60 कोशिकाओं के साथ बातचीत में वृद्धि, ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α) के साथ सक्रिय थे जो endothelial कोशिकाओं (ईसीएस), के साथ लेपित किया गया था. बढ़ाया throughput और ऐसे वेग रोलिंग और पथ रोलिंग के रूप में मानकों का तेजी से विश्लेषण परमिट कि एकीकृत मल्टी पैरामीटर सॉफ्टवेयर विश्लेषण मंच, इन विट्रो सेल रोलिंग गुणों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं. सेल रोलिंग और घर वापस आना प्रभावित करने के लिए बनाया गया इंजीनियरिंग दृष्टिकोण का तेजी से और सटीक विश्लेषण की अनुमति, इस मंच अग्रिम एक्सोजेनस सेल आधारित चिकित्सा मदद मिल सकती है.

Introduction

सेल आधारित चिकित्सा के सफल नैदानिक ​​अनुवाद में प्रमुख चुनौतियों में से एक अकुशल वितरण या वांछित साइटों 3,4 को प्रणालीबद्ध संचार कोशिकाओं का लक्ष्य है. नतीजतन, सेल घर वापस आना सुधार करने के तरीकों के लिए एक निरंतर खोज है, और विशेष रूप से सेल थेरेपी में सुधार करने के लिए एक रणनीति के रूप में, रोलिंग सेल. रक्त वाहिकाओं पर रोलिंग सेल प्रतिष्ठित रोग साइटों 5 के लिए भर्ती कर रहे हैं कि leukocytes के लिए परिभाषित सेल घर वापस आना झरना, में एक महत्वपूर्ण कदम है. यह कदम endothelial selectins के बीच विशेष बातचीत के द्वारा नियंत्रित होता है, यानी पी और ई selectin (पी और ई एसईएल), और leukocytes 5,6 की सतह पर उनके काउंटर ligands. बेहतर समझ और सेल घर वापस आना की कार्यकुशलता में सुधार, और विशेष रूप से रोलिंग कदम, सेल आधारित चिकित्सा में सुधार के लिए नए प्लेटफॉर्म के लिए खोज में बहुत महत्व के हैं. तिथि करने के लिए इस दो फ्लैट बेनी शामिल समानांतर थाली प्रवाह कक्षों (PPFCs) का उपयोग करके हासिल किया गया हैएक सेल निलंबन एक सिरिंज 7,8, 9 पंप का उपयोग करके perfused है जिसके माध्यम से ऊपरी प्लेट पर स्थित एक प्रवाह और बहिर्वाह बंदरगाह, साथ उन दोनों के बीच एक गैसकेट, साथ तों. नीचे की थाली की सतह एक प्रासंगिक सेल monolayer / substrates के साथ लेपित किया जा सकता है और कतरनी प्रवाह के तहत perfused कोशिकाओं और सतह के बीच बातचीत फिर 7 का पता लगाया है. हालांकि, PPFC बुलबुला गठन, रिसाव, और प्रमुख कमियां पेश खराब नियंत्रित प्रवाह के साथ एक कम throughput, अभिकर्मक लेने, और काफी थकाऊ विधि है.

पारंपरिक PPFC के लिए एक वैकल्पिक तकनीक कम अभिकर्मक खपत 1,10 के साथ, सही, कंप्यूटर नियंत्रित कतरनी प्रवाह के तहत सेलुलर assays के उच्च throughput प्रदर्शन (PPFCs से करने के लिए 10 गुना अधिक) की अनुमति, एक बहु - अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली है. सेल रोलिंग प्रयोगों USI सेल monolayers या इंजीनियर substrates के साथ लेपित और imaged किया जा सकता है, जो microfluidic चैनलों के अंदर प्रदर्शन कर रहे हैंएनजी रोलिंग गुणों के साथ एक माइक्रोस्कोप, आसानी से एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग का विश्लेषण किया. इस अध्ययन में, हम मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया विभिन्न सतहों पर (एच. एल -60) कोशिकाओं के रोलिंग गुणों का अध्ययन करके इस बहु - अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली की क्षमताओं का प्रदर्शन. एच. एल -60 पी और ई एसईएल, साथ ही विभिन्न रोलिंग रिसेप्टर्स व्यक्त सेल monolayers पर, विश्लेषण किया गया था तरह substrates पर रोलिंग. इसके अलावा, एंटीबॉडी (अब) उन सतहों पर एच. एल -60 के रोलिंग आंदोलन मध्यस्थता में विशिष्ट selectins की प्रत्यक्ष भागीदारी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अवरुद्ध. रोलिंग प्रयोगों ऐसे रोलिंग वेग, रोलिंग कोशिकाओं की संख्या, और रोलिंग पथ गुण के रूप में महत्वपूर्ण रोलिंग मापदंडों के कुशल विश्लेषण की अनुमति, कम से कम अभिकर्मक / सेल की खपत के साथ, स्थिर कतरनी प्रवाह के तहत, बढ़ा throughput के साथ प्रदर्शन किया गया.

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया (एच एल -60) कोशिकाओं
    1. 75 सेमी में संस्कृति एच. एल -60 कोशिकाओं 20% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% (v / v) एल Glutamine और 1 के साथ पूरक Iscove संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM), की 15 मिलीलीटर के साथ 2 बोतल % (v / v) पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन.
    2. सेल निलंबन मात्रा का आधा aspirating और पूरा IMDM मीडिया के साथ जगह से हर 3 दिनों मीडिया बदलें.
    3. Carboxyfluorescein Diacetate के लिए, succinimidyl एस्टर (CFSE) धुंधला, अपकेंद्रित्र एच. एल -60 सेल निलंबन (400 XG, 5 मिनट), एक 1 माइक्रोन CFSE समाधान में Resuspend (prewarmed पीबीएस में तैयार) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते फिर 30 मिनट के लिए ताजा prewarmed मध्यम में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं. पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें और फिर (पी एसईएल लेपित सतह पर CFSE से सना हुआ एच. एल -60 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवि के लिए चित्रा 1B देखें) रोलिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते हैं.

  1. फेफड़े microvascular endothelial कोशिकाओं (LMVECs)
    1. कोट 100 मिमी पेट्री 0.1% जिलेटिन समाधान (पीबीएस में वी / वी) के साथ बर्तन और कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    2. पूरा endothelial वृद्धि माध्यम में जिलेटिन लेपित 100 मिमी पेट्री डिश पर संस्कृति LMVECs (endothelial बेसल मध्यम -2 (EBM-2)), एक विशिष्ट वृद्धि पूरक किट के साथ पूरक,) अभिकर्मकों देखें. मीडिया में 80-90% संगम पर पहुंचने पर हर दूसरे दिन और उप संस्कृति कोशिकाओं को बदलें.
    3. उप संस्कृति के लिए, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर अलग कर कोशिकाओं 1x ट्रिप्सिन-EDTA के 4 एमएल के साथ 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर और पूरा EBM-2 मीडिया के एक बराबर मात्रा में बेअसर. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और centrifug सेल निलंबन स्थानांतरणई (400 XG, 5 मिनट). Centrifugation के बाद, पूरा endothelial मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend और एक hemocytometer साथ कोशिकाओं गिनती. इस सब के प्रयोगों के लिए पारित होने 7 के तहत केवल कोशिकाओं उनकी आकारिकी और समारोह उपयोग को प्रभावित करता है, के रूप में नहीं अधिक बीतने कोशिकाओं करते हैं.
  1. चीनी हैम्स्टर अंडाशय-पी selectin (चो पी) कक्ष
    1. Stably मानव पी एसईएल व्यक्त करने ट्रांसफ़ेक्ट चो कोशिकाएं हैं जो चो पी कोशिकाओं, सहयोगियों (Beth इसराइल Deaconess मेडिकल सेंटर, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) 11,12 द्वारा प्रदान किया गया.
    2. एफ 12 मीडिया की 25 एमएल में T175 सेमी में संस्कृति चो पी कोशिकाओं 2 बोतल.
    3. Passaging के लिए, 4-5 सेकंड के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर पूरा मीडिया में निराकरण द्वारा पीछा 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1x ट्रिप्सिन-EDTA के 10 मिलीलीटर में trypsinize.
    4. सेल निलंबन अपकेंद्रित्र (400 XG, 5 मिनट), ध्यान से, सतह पर तैरनेवाला aspirate पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और साथ कोशिकाओं गिनतीएक hemocytometer.

2. एकीकृत बहु अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली के ऑपरेशन

  1. सभी उपकरण ठीक से जुड़ा हुआ है सुनिश्चित करें और विभिन्न मॉड्यूल पर बारी: कंप्यूटर, नियंत्रक, औंधा माइक्रोस्कोप, और सीसीडी कैमरा.
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें, बहु - अच्छी तरह से थाली मॉड्यूल और इमेजिंग मॉड्यूल ठीक से स्क्रीन पर प्रस्तुत कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  3. (नियंत्रक से जुड़ा) वाष्प फंसाने के लिए ट्यूब कनेक्ट और उन्हें भी दबाव इंटरफ़ेस से कनेक्ट.
  4. थाली हीटर / अनुकूलक में बहु - अच्छी तरह से थाली रखें. वेल्स (नीचे वर्णित) को अभिकर्मकों जोड़ें और थाली के शीर्ष पर इंटरफेस देते हैं. स्वचालित मंच पर इमेजिंग के लिए प्लेट रखें.
  5. इंटरफ़ेस प्लेट के ऊपर करने के लिए देता है और बहु ​​- अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर आसानी से नियंत्रित परिभाषित प्रवाह दर पर microfluidic चैनलों के माध्यम से तरल पदार्थ, ड्राइविंग, कुओं के शीर्ष पर नियंत्रक से एक साँस का दबाव लागू होता हैमैनुअल मोड के तहत मॉड्यूल स्क्रीन.
  6. कुओं के बीच स्थित एक अवलोकन क्षेत्र भर में चैनल के प्रवाह में अभिकर्मकों. Microfluidic चैनल आयाम 70 माइक्रोन लंबा 350 मीटर चौड़ा x हैं. रेखीय चैनल की लंबाई 1 मिमी है और चैनलों के नीचे brightfield, चरण, प्रतिदीप्ति और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है जो एक 180 माइक्रोन coverslip कांच, शामिल हैं.
  7. एक सीसीडी कैमरा (धारा अधिग्रहण, 11 फ्रेम / सेक) का उपयोग वीडियो मोल और संगत सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण.

3. एक प्रोटीन सब्सट्रेट या एक सेल monolayer साथ microfluidic चैनलों की कोटिंग

  1. फ़ाइब्रोनेक्टिन या P-/E-selectin साथ microfluidic चैनल कोटिंग
    1. पीबीएस में 20 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान के 1 मिलीलीटर तैयार करें. लेपित हो चैनलों की संख्या (प्रति चैनल fibronectin की 25-50 μl का उपयोग) पर आधारित मात्रा में परिवर्तन.
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक प्रवेश के लिए fibronectin समाधान के 25-50 μl जोड़ें. 2 dyn के / 2 सेमी की कतरनी बल लागू5 मिनट चैनल छिड़कना करने के लिए. तरल अच्छी तरह से आउटलेट में प्रदर्शित होने के मनका कृपया ध्यान दें. आरटी पर 30-45 मिनट के लिए सेते
    3. कुओं से समाधान (चैनल खिलाती है कि मध्य चक्र से सीधे महाप्राण नहीं है) 1,13 aspirate. आउटलेट कुएं में पीबीएस के 200-500 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 2 dyn के / 2 सेमी की कतरनी प्रवाह को लागू करने से पीबीएस के साथ चैनल धो लो. चैनल अब ठीक से फ़ाइब्रोनेक्टिन और इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार के साथ लेपित है.
    4. सतह कोटिंग अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे ऊष्मायन के साथ, ऊपर वर्णित के रूप में पी या ई एसईएल, पीबीएस में वांछित मानव पुनः संयोजक प्रोटीन की 5 ग्राम / एमएल समाधान तैयार है, और कोट चैनलों के साथ कोट करने के लिए.
  2. Microfluidic चैनल के अंदर चो पी या LMVEC monolayer के निर्माण
    1. धीरे पूरा मीडिया और अपकेंद्रित्र की एक 2 गुना मात्रा (400 XG पर 5 मिनट) का उपयोग बुझाना, 3 मिनट के लिए संस्कृति व्यंजन से कोशिकाओं trypsinize. पूरा मीडिया और अपकेंद्रित्र के 10 एमएल (400 XG पर 5 मिनट) के साथ Resuspend कोशिकाओं agaiएन.
    2. निलंबन में सेल एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए कक्षों की गणना. , चैनल के अंदर मिला हुआ LMVEC monolayer के गठन सुनिश्चित 15-20000000 कोशिकाओं / एमएल सेल एकाग्रता लाने के लिए. मिला हुआ चो पी सेल monolayer के लिए, 50-60 मिलियन कोशिकाओं / एमएल का उपयोग करें. प्रत्येक चैनल के लिए सेल निलंबन के 25-50 μl का प्रयोग करें - तदनुसार प्रयोग के लिए इस्तेमाल का निर्धारण प्रारंभिक सेल नंबर.
    3. अच्छी तरह से प्रवेश करने के लिए उपयुक्त एकाग्रता में सेल निलंबन के 25-50 μl जोड़ें. खुर्दबीन मंच पर थाली प्लेस और कोशिकाओं पूरे चैनलों को भरने के लिए स्क्रीन पर मनाया, और उसके प्रवाह को रोकने रहे हैं जब तक चैनल (2 dyn के / 2 सेमी) में कोशिकाओं का परिचय.
    4. पूर्ण LMVEC या चो मीडिया या तो 200 μl के साथ आउटलेट और इनलेट दोनों भरें. कोशिकाओं व्यवस्थित करते हैं और इनक्यूबेटर में 3 घंटे के लिए पालन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2).
    5. 3 घंटा ऊष्मायन के बाद, स्वाधीन दूर करने के लिए पूरा मीडिया (2 dyn के / 2 सेमी, 10-15 मिनट) के साथ चैनल धोनेकोशिकाओं. कोशिकाओं को अब पूरी तरह से मिला हुआ दिखाई देना चाहिए और चैनल अब इस्तेमाल के लिए तैयार है. प्रारंभिक सेल बोने घनत्व पर निर्भर करता है, समय निपटाने के अतिरिक्त 2-3 घंटा कोशिकाओं के साथ सतह की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

4. LMVEC समर्थक भड़काऊ सक्रियण और P-/E-selectin के एंटीबॉडी अवरुद्ध

  1. LMVEC बेसल मीडिया में एक TNF-α समाधान (10 एनजी / एमएल) तैयार करें.
  2. , चैनलों में LMVEC की भड़काऊ सक्रियण प्रेरित अच्छी तरह से प्रवेश करने के लिए TNF-α समाधान के 100 μl जोड़ने और 5 मिनट के लिए 2 dyn के / 2 सेमी की कतरनी प्रवाह को लागू करने से चैनल में समाधान को लागू है. नियंत्रण चैनलों के लिए (nonactivated ईसीएस), प्रवेश के लिए LMVEC बेसल मीडिया के 100 μl अच्छी तरह से जोड़ सकते हैं और चैनल (5 मिनट के लिए 2 dyn के / 2 सेमी) में परिचय. चैनल अब एक रोलिंग परख के लिए तैयार है.
  3. पी एसईएल और LMVECs और चो पी कोशिकाओं पर ई एसईएल ब्लॉक करने के लिए, पी एसईएल (क्लोन AK4, बीए में 5 ग्राम / एमएल निष्क्रिय परिचयसाल मीडिया) या ई एसईएल (क्लोन P2H3, बेसल मीडिया में 5 ग्राम / एमएल) चैनल में एंटीबॉडी और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते अगला, (5 मिनट के लिए 2 dyn के / 2 सेमी) बेसल मीडिया के साथ चैनल धो लो. चैनल अब एक रोलिंग परख के लिए तैयार हैं.

5. सब्सट्रेट / सेल monolayer में लिपटे microfluidic चैनलों पर एच. एल -60 रोलिंग परख

  1. ध्यान से चैनल ठीक से (कोशिकाओं के साथ कोटिंग के मामले में, एक पूरी तरह से मिला हुआ सेल monolayer मनाया जाना चाहिए) लेपित हैं कि पुष्टि करने के लिए खुर्दबीन के नीचे चैनलों की जांच.
  2. रोलिंग प्रयोगों, अपकेंद्रित्र एच. एल -60 सेल निलंबन (400 XG पर 5 मिनट) के लिए एच. एल -60 सेल निलंबन को तैयार करने और बेसल मीडिया के साथ एक बार धोने के लिए. 5 लाख कोशिकाओं / एमएल के साथ एक एच एल -60 सेल निलंबन बनाने के लिए (सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + युक्त बेसल मीडिया,) IMDM में कोशिकाओं और resuspend गणना. रोलिंग परख प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए सेल निलंबन के 25-50 μl का प्रयोग करें.
  3. सेल suspe के 25-50 μl जोड़ेंnsion खुर्दबीन मंच पर तापमान नियंत्रित थाली धारक (37 डिग्री सेल्सियस) और जगह के अंदर, अच्छी तरह से जगह थाली आउटलेट के लिए. अगला, (कोशिकाओं इनलेट को दुकान से बह 10-15 सेकंड के भीतर मनाया जाना चाहिए) 2 dyn के / 2 सेमी की कतरनी बल लगाने से चैनल में कोशिकाओं परिचय.
  4. कतरनी तनाव का एक समारोह के रूप में रोलिंग प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, (5 dyn के लिए ऊपर 0.25 से धीरे - धीरे कतरनी वृद्धि dyn के / 2 सेमी 0.25 कतरनी कम करने और प्रत्येक वांछित कतरनी में ("धारा अधिग्रहण" समारोह का उपयोग) 20-30 सेकंड वीडियो के अधिग्रहण / 2 सेमी. यह) उच्च कैंची का उपयोग करने के लिए भी संभव है.
  5. एक सीसीडी कैमरा (धारा अधिग्रहण, 11 फ्रेम / सेक) का उपयोग वीडियो मोल और संगत सॉफ्टवेयर के माध्यम से पथ रोलिंग और रोलिंग वेग का विश्लेषण.

6. भूतल अणुओं की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रवाह cytometry

  1. Trypsinization के बाद वांछित कोशिका प्रकार (एच एल -60, चो की (1-2 x 10 5 कोशिकाओं / नमूना का उपयोग करके) एक सेल निलंबन तैयारपीबीएस में पी या LMVECs) (- / -), 2% FBS के साथ पूरक. दो बार कोशिकाओं को धो लें और 50 μl (उसी बफर का उपयोग करके) के लिए नमूना मात्रा लाने.
  2. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर वांछित fluorophore संयुग्मित एबी (विस्तृत जानकारी के लिए संलग्न तालिका देखें) (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर) के साथ प्रत्येक नमूने सेते हैं.
  3. दो बार (एक ही बफर) कोशिकाओं को धो लें और 200 μl के दाग सेल निलंबन के अंतिम मात्रा लाने. सतह अणुओं की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रवाह cytometer उपयोग नमूनों का विश्लेषण करें.

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Representative Results

एच. एल -60 कोशिकाओं fibronectin पर पी और ई selectin सतहों पर रोल, लेकिन नहीं

वे रोलिंग ligands पी एसईएल ग्लाइकोप्रोटीन ligand-1 (PSGL -1) और Sialyl लुईस एक्स (Slex) सहित घर वापस आना ligands की एक किस्म 5,14 (चित्रा 1 ए व्यक्त रूप में एच. एल -60 कोशिकाओं सोने के मानक 'रोलर्स "माना जाता है ). साथ विशेष बातचीत में मध्यस्थता टेट्रा-सैक्राइड Slex के लिए एक पाड़ के रूप में सतह प्रोटीन PSGL -1 कार्य करता है, पी और ई एसईएल, सूजन 5,6,15 दौरान अन्तःचूचुक पर विनियमित ऊपर से जो कर रहे हैं. बहु अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली की क्षमताओं का परीक्षण करने के लिए, कई microfluidic चैनलों उन सतहों विश्लेषण किया गया साथ विभिन्न substrates और एच. एल -60 कोशिकाओं के रोलिंग बातचीत के साथ एक साथ लेपित किया गया. एच. एल -60 कोशिकाओं एक विशिष्ट रोलिंग आंदोलन द्वारा पीछा पहली प्रवाह से कब्जा कर लिया कोशिकाओं के साथ, पी एसईएल लेपित सतह पर एक मजबूत रोलिंग व्यवहार का प्रदर्शन किया. चित्रा 1C में दिखाया गया है, और मिलकर रूपसाहित्य के साथ ईएनटी, एच. एल -60 कोशिकाओं ई एसईएल सतहों पर एक समान रोलिंग व्यवहार प्रदर्शन, अभी तक नहीं fibronectin लेपित substrates 14,16-19 पर. संगत सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण प्रकोष्ठ वेग, पर कोशिकाओं की एक मजबूत रोलिंग प्रतिक्रिया दिखा, कतरनी तनाव के खिलाफ साजिश रची गई थी पी और 1-12 सुक्ष्ममापी / सेकंड के बीच एक औसत वेग के साथ ई एसईएल.

एच. एल -60 कोशिकाओं microfluidic चैनल कोटिंग चो पी monolayer पर रोल

अगला, हम कुशलतापूर्वक ब्याज की कोशिकाओं और सतह कोटिंग एक सेल monolayer के बीच बातचीत का परीक्षण करने के लिए इस microfluidic प्रणाली का उपयोग करने की व्यवहार्यता का आकलन करने के उद्देश्य से. रोलिंग मार्करों व्यक्त करता है कि एक सेल monolayer साथ एच. एल -60 कोशिकाओं की बातचीत का पता लगाने के लिए, हम stably व्यक्त करने ट्रांसफ़ेक्ट हैं जो चो पी कोशिकाओं का उपयोग किया था पी, लेकिन नहीं ई, एसईएल (चित्रा 2A. इसके अलावा प्रतिनिधि के लिए चित्रा 2B देखना microfluidic चैनल) 11,12 कोटिंग चो पी monolayer पर एच. एल -60 कोशिकाओं की छवि. एचएल -60 कोशिकाओं चो पी कोशिकाओं पर एक मजबूत रोलिंग प्रतिक्रिया (चित्रा -2) का प्रदर्शन किया. इस रोलिंग आंदोलन वास्तव में पी एसईएल द्वारा मध्यस्थता है कि क्या परीक्षण करने के लिए, चो पी monolayer के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध साथ preincubated गया था पी या पूर्व चैनल में एच. एल -60 कोशिकाओं का छिड़काव करने के लिए ई एसईएल, या तो. अब कि पी एसईएल प्रदर्शन, सतह पर एच. एल -60 कोशिकाओं रोलिंग की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप एक पी एसईएल साथ चो पी monolayer अवरुद्ध, चित्रा -2 में दिखाया गया है वास्तव में एच. एल -60 के रूप में पहले वर्णित रोलिंग mediates 14,18. एक microfluidic चैनल में परख प्रदर्शन 25 μl के रूप में छोटे केवल छोटे संस्करणों का उपयोग करके विभिन्न स्थितियों और रिसेप्टर्स के कुशल अवरुद्ध की तेजी से जांच के लिए परमिट. निर्धारण नियंत्रण या अटल बिहारी (चो पी कोशिकाओं पर व्यक्त नहीं किया है) के ई एसईएल अवरुद्ध सही विशिष्ट surfac की प्रत्यक्ष भागीदारी पराकाष्ठा में इस परख की ताकत का प्रदर्शन, चो पी कोशिकाओं पर रोलिंग कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित नहीं कियासेलुलर रोलिंग बातचीत में ई मार्करों.

TNF-एक सक्रिय LMVECs पर एच. एल -60 कोशिकाओं की रोलिंग ई selectin द्वारा मध्यस्थता है

Endothelial कोशिकाओं में सूजन 5,6 की साइटों के लिए leukocytes की भर्ती में सहायता, सूजन के दौरान, ऐसे पी और ई एसईएल के रूप में विनियमित आसंजन सतह मार्करों, के लिए जाना जाता है. Murine ईसीएस इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) और ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α) जैसे भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में पी और ई एसईएल दोनों व्यक्त हालांकि, जबकि, मानव ईसीएस केवल इन के जवाब में ई एसईएल व्यक्त 20,21 साइटोकिन्स. इस ई एसईएल की अभिव्यक्ति दिखा, cytometry परख हमारे प्रवाह में मान्य था, लेकिन नहीं पी एसईएल, TNF-α उत्तेजना (चित्रा 3) के जवाब में फेफड़ों microvascular endothelial कोशिकाओं (LMVEC) पर. बहु ठीक microfluidic थाली कई अलग अलग परिस्थितियों के उच्च throughput परीक्षण की अनुमति, कई अलग microfluidic चैनलों के होते हैं. हम इस लाभप्रद डिजाइन का इस्तेमाल कियातेजी से कई परिस्थितियों में ईसीएस के साथ एच एल -60 कोशिकाओं की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए microfluidic चैनलों (3B चित्रा) के अंदर LMVECs थाली करने के लिए. भड़काऊ सेटिंग अनुकरण, LMVECs समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन TNF-α साथ pretreated थे. दिलचस्प है, एच एल -60 कोशिकाओं संयुक्त राष्ट्र के सक्रिय LMVECs के साथ संपर्क नहीं किया है, और कोशिकाओं को इस सतह पर रोल करने के लिए नहीं मनाया गया. इसके विपरीत, एच. एल -60 कोशिकाओं 5-15 मीटर / सेकंड की औसत वेग (चित्रा -3 सी) के साथ, TNF-α सक्रिय LMVECs पर एक मजबूत रोलिंग व्यवहार प्रदर्शित होता है.

हम तो एच. एल -60 कोशिकाओं और सक्रिय LMVECs के बीच रोलिंग बातचीत में पी एसईएल या ई एसईएल की संलिप्तता का पता लगाने के उद्देश्य से. इस के लिए, TNF-α सक्रिय ईसीएस पी एसईएल या एंटीबॉडी अवरुद्ध ई एसईएल साथ preincubated थे, और एच. एल -60 कोशिकाओं के रोलिंग विश्लेषण किया गया था. TNF-α सक्रिय LMVECs पर विनियमित ऊपर था जो ई एसईएल, अवरुद्ध, चित्रा -4 ए में दिखाया गया है, एक signific में हुईसक्रिय endothelial monolayer पर कोशिकाओं रोलिंग की संख्या में चींटी गिरावट. इसके विपरीत, सक्रिय ईसीएस पर व्यक्त नहीं किया गया था जो पी एसईएल,, के खिलाफ एक निर्धारण नियंत्रण या एक अटल बिहारी का उपयोग एच. एल -60 सक्रिय endothelial परत पर रोलिंग पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था. इस डेटा पिछली रिपोर्टों 20,21 के साथ संगत, TNF-α सक्रिय ईसीएस पर रोलिंग एच. एल -60 में ई एसईएल की प्रत्यक्ष भागीदारी को दर्शाता है. का अधिग्रहण वीडियो से, विश्लेषण सॉफ्टवेयर सब्सट्रेट के साथ बातचीत के दौरान व्यक्ति की कोशिकाओं के रास्तों पर नज़र रखने के लिए एक परमिट. हम विशेष रूप से ई एसईएल अवरुद्ध wo w / TNF-α सक्रिय ईसीएस के साथ बातचीत की है कि व्यक्ति की कोशिकाओं के मार्ग पर नज़र रखने के लिए इस क्षमता का इस्तेमाल किया. चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, unblocked सक्रिय LMVECs पर कोशिकाओं रोलिंग की संख्या सक्रिय ईसीएस ई एसईएल अवरुद्ध पर की तुलना में काफी अधिक था. इसके अलावा, यह unblocked LMVECs पर एच. एल -60 के रोलिंग आंदोलन निरंतर और मजबूत है कि दिखाई दिया जबकि कोशिकाओं के रोलिंग पथई एसईएल अवरुद्ध ईसीएस पर (हर रंग एक अलग सेल का प्रतिनिधित्व करता है, 4B चित्रा में जीएल बनाम वायुसेना उदाहरण कोशिकाओं के लिए देखें) खंडित किया गया था. इस खोज के साथ सामंजस्य में, unblocked TNF-α सक्रिय ईसीएस पर एच. एल -60 कोशिकाओं के रोलिंग वेग ई एसईएल अवरुद्ध ईसीएस (चित्रा 4C) पर अपने रोलिंग वेग की तुलना में काफी कम थी.

चित्रा 1
चित्रा 1. एच. एल -60 कोशिकाओं पी और ई selectin में लिपटे सतहों पर रोल. (ए) एच. एल -60 कोशिकाओं व्यक्त रोलिंग ligands PSGL -1 और Slex (आईएसओ सीटीआर - निर्धारण नियंत्रण, कोई AB - कोई एंटीबॉडी). (बी) पी एसईएल पर CFSE से सना हुआ एच. एल -60 कोशिकाओं के प्रतिनिधि स्नैप शॉट छवि प्रवाह के तहत सतह लेपित. (सी) एच. एल -60 कोशिकाओं मजबूती के साथ पी और ई एसईएल में लिपटे सतहों पर रोल, लेकिन नहीं fibronectin लेपित सतह पर. रोलिंग वेग कतरनी तनाव के खिलाफ साजिश रची (एन = 10-1 हैडेटा बिंदु प्रति 5 कोशिकाओं, वेग) संगत सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एच. एल -60 चो पी सेल monolayer पर रोलिंग सीधे पी एसईएल द्वारा मध्यस्थता है. (ए) चो पी कोशिकाओं पी एसईएल व्यक्त नहीं, बल्कि ई एसईएल. (बी) microfluidic चैनल (10x बढ़ाई) की सतह कोटिंग चो पी monolayer पर एच. एल -60 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवि. (सी) एच. एल *; चो पी monolayer एक निर्धारण नियंत्रण के साथ incubated एक एंटीबॉडी, निर्धारण सीटीआर-चो पी monolayer साथ incubated नहीं था - अब अनब्लॉ (परख अवरुद्ध द्वारा प्रदर्शन के रूप में चो पी monolayer पर रोलिंग -60 सेल सीधे पी एसईएल द्वारा मध्यस्थता है पी <0.05, एनोवा Tukey के एचएसडी के बाद अस्थायी परीक्षण के साथ इस्तेमाल किया गया था एक तरह से, त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्वSEM, N = 3.

चित्रा 3
चित्रा 3. एच. एल -60 कोशिकाओं TNF-α सक्रिय LMVECs पर रोल. (ए) LMVECs की TNF-α सक्रियण ई एसईएल की सतह अभिव्यक्ति को प्रेरित है, लेकिन नहीं पी एसईएल. (बी) के दो microfluidic चैनलों (4X बढ़ाई) में मिला हुआ LMVEC monolayer के प्रतिनिधि छवि. (सी) एच. एल -60 कोशिकाओं को एक प्रदर्शन TNF-α सक्रिय LMVECs पर मजबूत रोलिंग प्रतिक्रिया नहीं, बल्कि संयुक्त राष्ट्र के सक्रिय LMVECs पर. आईएसओ सीटीआर - निर्धारण नियंत्रण, unact ईसीएस - unactivated endothelial कोशिकाओं, TNF-α-अधिनियम ईसीएस -. TNF-α सक्रिय endothelial कोशिकाओं बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4 < br /> चित्रा 4. एच. एल -60 TNF-α सक्रिय LMVECs पर रोलिंग ई selectin द्वारा मध्यस्थता है. (ए) एच. एल -60 पर रोलिंग TNF-α सक्रिय अब अवरुद्ध कर प्रदर्शन किया LMVECs, बल्कि पी एसईएल से, ई एसईएल द्वारा मध्यस्थता है परख (एक निर्धारण नियंत्रण के साथ incubated निर्धारण सीटीआर चुनाव आयोग monolayer, * पी ​​<0.05, एनोवा Tukey के एचएसडी के बाद अस्थायी परीक्षण के साथ इस्तेमाल किया गया था एक तरह से, त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं, n = 3) (बी) सेल पथ विश्लेषण निरंतर का पता चलता है. और unblocked सक्रिय ईसीएस पर एच. एल -60 कोशिकाओं की मजबूत रोलिंग ई एसईएल अवरुद्ध सक्रिय ईसीएस पर मनाया खंडित, कमजोर रोलिंग की तुलना में (हर रंग एक अलग सेल का प्रतिनिधित्व करता है. विश्लेषण उपयुक्त सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्रदर्शन किया गया था). (सी) एच. एल -60 रोलिंग TNF-α सक्रिय ईसीएस पर वेग ई एसईएल अवरुद्ध सक्रिय ईसीएस (इस्तेमाल किया कतरनी तनाव की तुलना में unblocked सक्रिय ईसीएस पर धीमी है. 2 dyn के / 2 सेमी * पी ​​<0.05, unpaired दो पूंछ टी परीक्षण, त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व SEM, n = समूह प्रति 17-36 कोशिकाओं).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

एक्सोजेनस सेल आधारित चिकित्सा के सफल अनुवाद में प्रमुख चुनौतियों में से एक कुशलता से उच्च engraftment दक्षता 3 के साथ चोट और सूजन की साइटों के लिए कोशिकाओं को वितरित करने के लिए अक्षमता है. सेल रोलिंग अंततः ऊतक 5 में अन्तःचूचुक के माध्यम से उनकी फर्म आसंजन और स्थानांतरगमन के लिए अग्रणी, रक्त वाहिकाओं की दीवारों पर कोशिकाओं की मंदी की सुविधा, सेल घर वापस आना की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है. उम्मीदवार प्रकार की कोशिकाओं के लिए रोलिंग प्रक्रिया की बेहतर समझ सेल घर वापस आना बढ़ाने और सेल आधारित चिकित्सा में सुधार लाने की दिशा में महत्वपूर्ण योगदान करने के लिए तकनीक का विकास हो सकता है.

PPFC कतरनी प्रवाह के तहत सेल रोलिंग, साथ ही अन्य सेलुलर व्यवहार का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल उपकरण है. अन्तःचूचुक पर न्युट्रोफिल आसंजन की जांच के लिए PPFC के आवेदन पहली बार 1987 में. लॉरेंस एट अल द्वारा अध्ययन किया, और तब से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादन किया गया थाटीएस 8,9 विकसित किया गया है. PPFCs चैम्बर 7 के आयामों को नियंत्रित करता है कि एक गैसकेट द्वारा अलग दो फ्लैट प्लेट से मिलकर. ऊपरी प्लेट एक सिरिंज पंप के उपयोग के माध्यम से चैम्बर 7,8 के माध्यम से सेल निलंबन के छिड़काव के लिए सक्षम बनाता है, जो एक प्रवाह और बहिर्वाह बंदरगाह, शामिल हैं. एक साथ 7 दबाया प्लेटें रखने के लिए नकारात्मक दबाव (निर्वात) लागू होता है कि एक अतिरिक्त बंदरगाह भी है. समानांतर थाली प्रवाह कक्षों को प्रभावी ढंग से कतरनी प्रवाह शर्तों के तहत सेल रोलिंग सहित सेलुलर प्रतिक्रियाओं, जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इसके प्रभाव को कम है कि कई सीमाएं हैं. प्रवाह कक्षों का एक प्रमुख सीमा कोशिकाओं और कारण प्रवाह प्रणाली 7 भीतर बड़े मृत मात्रा के लिए आवश्यक हैं कि अभिकर्मकों की बड़ी मात्रा की संख्या अधिक है. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा आसानी से संभावित सेल monolayer और सब्सट्रेट में बाधा, प्रवाह चैम्बर विधानसभा के दौरान पैदा कर सकते हैं जो हवा के बुलबुले की उपस्थिति हैनीचे की थाली 22 पर कोटिंग. हालांकि, आगे संशोधनों हवा को हटाने की सुविधा के लिए एक बुलबुला जाल के रूप में कार्य करने के लिए ऊपरी प्लेट पर एक अतिरिक्त बंदरगाह शामिल करने के लिए परंपरागत PPCFs करने के लिए बनाया गया है 23 बुलबुले. PPFC प्रयोग सेट करना भी कठिन है, और गैसकेट क्षतिग्रस्त या नहीं ध्यान से इकट्ठा किया है अगर प्रवाह सेल रिसाव की संभावना है. अंत में, एक समान प्रवाह दरों का एक सीमित दायरे में जो परिणाम वांछित और प्रयोगात्मक लागू दरों कतरनी, के बीच एक अंतर है. सैद्धांतिक रूप से इनलेट और आउटलेट पदों के साथ अलग चार PPFCs की तुलना करके, यह विन्यास के दो अप करने के लिए 75% 24 द्वारा गणना कतरनी दरों से भटक कि कतरनी दरों मॉडलिंग की है कि पाया गया था. एक ही कक्ष का पुन: उपयोग करने के लिए समय लेने वाली वाशिंग चरणों की आवश्यकता है, और ऊपर वर्णित चुनौतियों के साथ संयुक्त, इस PPFCs काफी थकाऊ और कम throughput बनाता है.

हमारे अध्ययन में, हम एक पूरी तरह से एकीकृत बहु - अच्छी तरह से पी इस्तेमाल कियासही नियंत्रित कतरनी प्रवाह 1,2,13 पर भरोसा देर microfluidic प्रणाली,. यह 48 अच्छी तरह microfluidic प्लेट एक microfluidic चैनल 1,25 साथ जुड़ा आसन्न कुओं में से प्रत्येक जोड़ी के साथ 24 microfluidic चैनलों, शामिल हैं. 10-12 रोलिंग assays के एक ही दिन में कई दर्जन शर्तों की तेजी से जांच की अनुमति, 1 घंटा में प्रदर्शन किया जा सकता है. microfluidic चैनलों आसानी से एक प्रोटीन सब्सट्रेट या सेल monolayers साथ लेपित किया जा सकता है, और ब्याज और सतह की कोशिकाओं के बीच बातचीत एक सीसीडी कैमरे से हासिल कर लिया और संगत सॉफ्टवेयर से विश्लेषण एक माइक्रोस्कोप, का उपयोग imaged किया जा सकता है. इस तरह के सेल मात्रा का ठहराव, रोलिंग वेग की गणना और विशिष्ट ट्रैक पथ विश्लेषण के रूप में मुख्य मापदंडों आसानी से कुशलतापूर्वक कई substrates 13 पर रोलिंग व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. इस अध्ययन में, हम कुंजी व्यक्त कि, अच्छी तरह से स्थापित "रोलर्स" एच. एल -60 प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया कोशिका पंक्ति का उपयोग करके सेल रोलिंग अध्ययन में इस प्रणाली की दक्षता का मूल्यांकनएक साथ पी और ई एसईएल 15,26 के लिए समकक्ष ligands के रूप में कार्य है, जो इस तरह के PSGL -1 और Slex के रूप में रोलिंग ligands,,. पिछली रिपोर्टों के साथ संबंध में, HL60 कोशिकाओं वास्तव में 1-12 मीटर / सेकंड 14,17-19 की धीमी रोलिंग वेग के साथ, पी और ई एसईएल लेपित microfluidic चैनलों पर एक मजबूत रोलिंग व्यवहार का प्रदर्शन किया. एच. एल -60 कोशिकाओं undifferentiated एच. एल -60 कोशिकाओं fibronectin 16 के साथ चिपकने वाला बातचीत का प्रदर्शन नहीं करते दिखा रहा है कि पिछली रिपोर्टों के साथ संगत, फ़ाइब्रोनेक्टिन सतह पर रोल नहीं था. अप करने के लिए 10-12 assays / घंटा की अनुमति बहु अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली के डिजाइन, PPFCs का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है कि केवल 1-2 assays / घंटा, काफी कम से कम 5 बार से बढ़ जाती है throughput की तुलना में. इसके अलावा, PPFCs आगे प्रदर्शन दर धीमा, प्रत्येक पुन: उपयोग से पहले फिर से जोड़ा और धोया जा करने की जरूरत है. इसके अलावा, आसानी से नियंत्रित प्रवाह तो तत्काल उपयुक्त सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है, जो कतरनी निर्भर प्रयोगों का तेजी से निष्पादन में सक्षम बनाता है.

(2A चित्रा) 11,12 overexpress को ट्रांसफ़ेक्ट हैं जो चो पी, चो कोशिकाओं का इस्तेमाल किया. एच. एल -60 कोशिकाओं कुशलतापूर्वक सेल monolayer की अखंडता को खतरे में डाल सकता है कि बुलबुले के गठन रोकता है एक डिजाइन दिया कतरनी प्रवाह के तहत सेल सेल बातचीत का पता लगाने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने की क्षमता का प्रदर्शन, चो पी कोशिकाओं पर एक महत्वपूर्ण रोलिंग प्रतिक्रिया का प्रदर्शन , जो PPFCs 22,23 का उपयोग करते समय अक्सर होता है. हम तो रोलिंग प्रक्रिया में उनके संभावित भागीदारी का पता लगाने के लिए पी या ई एसईएल एंटीबॉडी के साथ चो पी कोशिकाओं अवरुद्ध. पी एसईएल अवरुद्ध काफी पिछली रिपोर्टों 14,18,20 के साथ संगत एच. एल -60 रोलिंग, मध्यस्थता में पी एसईएल की प्रत्यक्ष भागीदारी का संकेत, चो पी monolayer पर कोशिकाओं रोलिंग की संख्या कम हो.ई एसईएल एबी और निर्धारण नियंत्रण अब अवरुद्ध कुशलतापूर्वक सेल सेल बातचीत में मध्यस्थता विशिष्ट मार्करों पता लगाने के लिए इस microfluidic प्रणाली में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन, चो पी पर एच. एल -60 पर रोलिंग पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. महत्वपूर्ण बात है, हर चैनल अभिकर्मक लेने वाली PPFC और अपने ठेठ बड़े मृत संस्करणों 7 के विपरीत इस परख के लिए महंगा पेट या सेल निलंबन के केवल न्यूनतम मात्रा के रूप में छोटे 25-50 के रूप में μl, की आवश्यकता है.

हम अगले एच. एल -60 कोशिकाओं और ईसी microfluidic चैनल कोटिंग के बीच बातचीत का विश्लेषण करके यह बहु - अच्छी तरह से थाली प्रणाली का परीक्षण किया. ईसीएस व्यक्त करने के लिए पी और ई एसईएल भड़काऊ प्रक्रिया 5 के दौरान जाना जाता है. एक भड़काऊ उत्तेजना के साथ ईसीएस प्रदान करने के लिए, हम TNF-α के साथ उन्हें pretreated. ई एसईएल विनियमित ऊपर था, वहीं पी एसईएल, साहित्य मानव ईसीएस ई एसईएल व्यक्त, लेकिन नहीं पी एसईएल, TNF-α सक्रियण के जवाब में रहनुमा पी एसईएल प्रमोटर TNF का अभाव है कि जब से दिखाने के साथ संगत नहीं था -α प्रतिक्रिया तत्वों, resuकेवल ई एसईएल 20,21 के transcriptional प्रेरण में lting. भड़काऊ शर्तों तो चुनाव आयोग की सतह के साथ अपनी बातचीत का पता लगाने के लिए एच. एल -60 कोशिकाओं का छिड़काव द्वारा पीछा किया, TNF-α के साथ चुनाव आयोग monolayer incubating द्वारा चैनल के अंदर नकली थे. एच. एल -60 unactivated ईसीएस के साथ संपर्क नहीं किया है, वे साहित्य 22 में उनकी रिपोर्ट की प्रतिक्रिया के साथ सहसंबद्ध TNF-α सक्रिय ईसीएस (चित्रा -3 सी) पर एक मजबूत रोलिंग प्रतिक्रिया को प्रदर्शित किया. अब प्रयोगों (चित्रा -4 ए) अवरुद्ध तो ई एसईएल, लेकिन नहीं पी एसईएल, सक्रिय ईसीएस पर रोलिंग एच. एल -60 में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप अवरुद्ध दिखाया. ये आंकड़े ई एसईएल की प्रत्यक्ष भागीदारी का प्रदर्शन, और TNF-α सक्रिय मानव ईसीएस 20,21 पर एच. एल -60 के रोलिंग मध्यस्थता में नहीं पी एसईएल,. अब इसके विपरीत पी एसईएल की मध्यस्थता चो पी पर रोलिंग बनाम सक्रिय ईसीएस पर ई एसईएल की मध्यस्थता रोलिंग दिखा, प्रयोगों अवरुद्ध, आगे अब BLOCKï की व्यवहार्यता और प्रासंगिकता पुष्टिएनजी प्रयोगों तेजी से इस microfluidic प्रणाली में प्रदर्शन किया. दिलचस्प है, रोलिंग की इस निषेध ऐसे Vcam -1 के रूप में अन्य भूतल रिसेप्टर्स, भी सक्रिय ईसीएस 27 पर रोलिंग एच. एल -60 में भाग लेने के सुझाव है कि (लगभग 70% की कमी) पूरा नहीं किया गया. ट्रैक पथ विश्लेषण आगे एक और दिलचस्प घटना का पता चला - unblocked सक्रिय ईसीएस पर एच. एल -60 के रोलिंग निरंतर और मजबूत था, जबकि अभी भी ई एसईएल पर लुढ़का है कि कोशिकाओं की कम संख्या ईसीएस (अवरुद्ध ईसीएस पर एक खंडित रोलिंग पथ प्रदर्शित सक्रिय अवरुद्ध चित्रा 4 बी). इस घटना पी एसईएल अवरुद्ध या निर्धारण नियंत्रण (नहीं दिखाया डेटा) के साथ incubated ईसीएस में नहीं मनाया गया. यह दृढ़ता से चुनाव आयोग ई एसईएल अवरुद्ध है जब एक रोलिंग प्रतिक्रिया अन्य मार्करों के माध्यम से संभव है, जबकि यह रोलिंग सक्रिय ईसीएस 5,22 साथ ही एक ढीला, आंशिक रोलिंग प्रतिक्रिया समर्थन, कमजोर, आंशिक एच. एल-60-चुनाव आयोग बातचीत पर निर्भर करता है कि पता चलता है ,27-29. इस चित्रा 4C में दिखाया गया डेटा द्वारा समर्थित है 30-33 का प्रदर्शन किया, और यहाँ प्रस्तुत बहु अच्छी तरह से थाली प्रणाली के माध्यम से microfluidics के throughput में सुधार किया गया था, आगे प्रकाश डाला गया है की दिशा में महत्वपूर्ण रोलिंग गुणों के कुशल और सटीक विश्लेषण के लिए इस प्रौद्योगिकी के संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों में सुधार .

इस अध्ययन एच. एल -60 सेल का उपयोग physiologically प्रासंगिक और सही नियंत्रित कतरनी प्रवाह के तहत प्रोटीन substrates और सेल monolayers पर रोलिंग की परीक्षा पर ध्यान केंद्रितएक बहु - अच्छी तरह से थाली microfluidic प्रणाली. इसी तरह, अन्य प्रकार की कोशिकाओं और अन्य substrates / सेल monolayers आसानी से अपने रोलिंग गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उपयोग और सरल विश्लेषण की आसानी महत्वपूर्ण रोलिंग गुण और विभिन्न विकास कारकों या inhibitors के साथ अब अवरुद्ध या सक्रियण रोलिंग जवाब में आणविक मार्कर की संभावित संलिप्तता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक सटीक विश्लेषण परमिट. यह स्टेम सेल आधारित चिकित्सा 34-36 में सुधार करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जो स्टेम सेल रोलिंग और घर वापस आना, पढ़ाई की ओर विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है. महत्वपूर्ण बात है, कई स्थितियों प्लेट डिजाइन के कारण रोलिंग संपत्तियों के तेजी से और कुशल अध्ययन की अनुमति, सुधार throughput (PPFCs बनाम 5-10 गुना अधिक) के साथ परीक्षण किया जा सकता है. इस तरह के सेल आसंजन, chemotaxis और स्थानांतरगमन के रूप में सेल घर वापस आना के लिए प्रासंगिक अन्य assays, भी इस प्रणाली 1,10,13 अध्ययन का उपयोग किया जा सकता है. कुल मिलाकर, इस microfluidic प्रणाली सेल रोलिंग और अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरhould एक्सोजेनस सेल आधारित चिकित्सा के नैदानिक ​​अनुवाद में सहायता करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा करते हैं.

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Disclosures

लेखक के हितों की कोई संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

चो पी कोशिकाओं डॉ. बारबरा Furie (Beth इसराइल Deaconess मेडिकल सेंटर, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) से एक तरह का उपहार थे. इस काम JMK तक यह काम भी JMK को एक Movember-प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन चैलेंज पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था स्वास्थ्य अनुदान HL095722 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells ATCC CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156
EBM-2 Media Lonza CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements Lonza CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots Lonza CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x Gibco 12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) Gibco 11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S) Gibco 15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM Gibco 25030
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals Sa550
Petri Dishes BD Falcon BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) MedSupply Partners TC1500
T75 Flasks BD Falcon 353136
Gelatin Solution (2%) Sigma G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) Sigma D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E R&D Systems BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA21
Anti-hP-Selectin R&D Systems BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control BD Bioscience 555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 Santa Cruz SC70545
FITC Conjugated Santa Cruz SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control Santa Cruz SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 BD Pharmingen 556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control BD Pharmingen 550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4) Santa Cruz SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 Millipore MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control Santa Cruz SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha PeproTech 300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry Invitrogen C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma Invitrogen 33016-015
Equipment
Bioflux 1000 Fluxion Biosciences Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Bioscience CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera Photometrics

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References

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Levy, O., Anandakumaran, P., Ngai,… More

Levy, O., Anandakumaran, P., Ngai, J., Karnik, R., Karp, J. M. Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System. J. Vis. Exp. (80), e50866, doi:10.3791/50866 (2013).

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