Summary
Questo studio ha utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, aumentando notevolmente la velocità di rotolamento studi cella in flusso di taglio fisiologicamente rilevanti. Data l'importanza della laminazione di cellule nella cella multi-step homing a cascata e l'importanza di homing delle cellule dopo la consegna sistematica delle popolazioni esogeni di cellule nei pazienti, questo sistema offre un potenziale come piattaforma di screening per migliorare la terapia cellulare.
Abstract
Una sfida importante per terapia cellulare è l'incapacità di indirizzare sistemicamente una grande quantità di cellule vitali con alta efficienza per tessuti di interesse dopo infusione endovenosa o intraarteriosa. Di conseguenza, l'aumento homing delle cellule è attualmente studiata come una strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella rotolamento sull'endotelio vascolare è un passo importante nel processo di homing delle cellule e può essere sondato in vitro utilizzando una camera di flusso a piatti paralleli (PPFC). Tuttavia, questo è estremamente noioso, basso dosaggio produttività, con condizioni di flusso scarsamente controllato. Invece, abbiamo utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto che consente lo studio delle proprietà di rotolamento cellulare in un throughput più elevato sotto controllato con precisione, fisiologicamente rilevante flusso di taglio 1,2. In questo articolo, vi mostriamo come le proprietà di rotolamento di HL-60 (leucemia promielocitica umana), le cellule su superfici E-selectina-rivestite-P e così come su superfici monostrato rivestite cellulari possono essere readily esaminato. Per meglio simulare condizioni infiammatorie, la superficie canale microfluidico è stata rivestita con le cellule endoteliali (EC), che sono stati poi attivati con Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), aumentando notevolmente le interazioni con cellule HL-60 in condizioni dinamiche. La velocità aumentata e piattaforma integrata di analisi software multi-parametro, che permette una rapida analisi di parametri quali la velocità di rotolamento e il percorso di rotolamento, sono vantaggi importanti per la valutazione delle cellule laminazione di proprietà in-vitro. Consentire l'analisi rapida e accurata di approcci di ingegneria progettato per avere un impatto rotolamento delle cellule e homing, questa piattaforma può aiutare terapia anticipo cell-based esogeno.
Introduction
Una delle sfide principali nella traduzione clinica di successo della terapia a base di cellule è la consegna inefficiente o il targeting di cellule sistemica infuse ai siti desiderati 3,4. Di conseguenza, vi è una costante ricerca di metodi per migliorare homing delle cellule, e specificamente cellula rotolamento, come strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella a rotazione sui vasi sanguigni è un passo fondamentale nella cascata di homing delle cellule, definito classicamente per i leucociti che vengono reclutati per siti di malattia 5. Questa fase è regolata da interazioni specifiche tra selectine endoteliali, cioè-P ed E-selectina (-P e E-sel), e loro ligandi contatore sulla superficie dei leucociti 5,6. Una migliore comprensione e una migliore efficienza di homing delle cellule, e in particolare la fase di laminazione, sono di grande importanza nella ricerca di nuove piattaforme per migliorare la terapia cellulare. Fino ad oggi questo è stato ottenuto utilizzando camere di flusso piastra parallele (PPFCs), comprendente due plat piattoes con una guarnizione tra loro, con una apertura di afflusso e deflusso trova alla piastra superiore, attraverso la quale una sospensione cellulare è perfuso utilizzando una siringa pompa 7,8, 9. La superficie della piastra inferiore può essere rivestito con un monostrato di cellule competenti / substrati e l'interazione tra cellule perfusi e la superficie sotto flusso di taglio è poi esplorato 7. Tuttavia, PPFC è un volume basso, reattivo-consumo, e metodo abbastanza noioso, con formazione di bolle, perdite, e il flusso scarsamente controllato presenta gravi inconvenienti.
Una tecnica alternativa alla PPFC tradizionale è un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, permettendo prestazioni più elevate velocità di analisi cellulari (fino a 10 volte superiore rispetto PPFCs) sotto flusso preciso e taglio controllato da computer, con basso consumo di reagente 1,10. Esperimenti di laminazione delle cellule vengono eseguiti all'interno dei canali microfluidica, che può essere rivestito con monostrati cellulari o substrati ingegnerizzati e USI ripresong un microscopio, con proprietà di rotolamento prontamente analizzati utilizzando un software adatto. In questo studio, abbiamo dimostrato le capacità di questo multi-well sistema di microfluidica piastra di studiare le proprietà di rotolamento di leucemia promielocitica umana (HL-60) le cellule su superfici diverse. HL-60 rotola su supporti come-P ed E-sel, nonché su monostrati di cellule che esprimono diversi recettori di rotolamento, è stato analizzato. Inoltre, l'anticorpo (Ab) di blocco è stato utilizzato per dimostrare coinvolgimento diretto di selectine specifici nel mediare il movimento di rotolamento di HL-60 su tali superfici. Esperimenti di rotolamento sono stati effettuati con maggiore velocità, sotto flusso di taglio stabile, con il minimo consumo di reagente / cellulare, che permette l'analisi efficiente dei parametri di laminazione chiave come velocità di rotazione, il numero di cellule di rotolamento, e rotolamento proprietà del percorso.
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Protocol
1. Cell Culture
- Leucemia promielocitica umana (HL-60) le cellule
- Culture cellule HL-60 nel 75 cm 2 palloni con 15 ml di Iscove Modified Medium (IMDM) di Dulbecco, supplementato con 20% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), 1% (v / v) L-glutammina e 1 % (v / v) Penicillina-Streptomicina.
- Cambiare supporto ogni 3 giorni aspirando metà del volume di sospensione cellulare e sostituendolo con mezzi IMDM completo.
- Per carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE) colorazione, centrifuga HL-60 sospensione cellulare (400 xg, 5 min), risospendere in una soluzione 1 mM CFSE (preparato in PBS preriscaldata) e incubare per 15 min a 37 ° C. Poi centrifugare le cellule, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo fresco preriscaldato per 30 min. Lavare le cellule in PBS e poi utilizzare per esperimenti di laminazione (vedere Figura 1B per un'immagine rappresentativa della CFSE colorati con cellule HL-60 su P-sel-superficie rivestita).
- Cellule endoteliali microvascolari polmonari (LMVECs)
- Coat 100 millimetri piastre di Petri con soluzione di gelatina 0,1% (v / v in PBS) e incubare a 37 ° C per almeno 30 min.
- LMVECs Cultura in gelatina rivestite 100 millimetri piastre di Petri in mezzo completo di crescita endoteliale (endothelial basale medio-2 (EBM-2)), integrato con uno specifico kit di supplemento di crescita, vedi REAGENTI). Cambiare i media ogni altro giorno e cellule sub-cultura al raggiungimento di 80-90% di confluenza.
- Per sub-coltura, lavare le cellule con PBS e poi staccare cellule con 4 ml di 1x Tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C e neutralizzare in un volume uguale di completi EBM-2 media. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifuge (400 xg, 5 min). Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di mezzi completi endoteliali e contare le cellule con un emocitometro. Non oltre-passare le cellule, in quanto questo incide sulla loro morfologia e funzione utilizzare solo cellule sotto il passaggio 7 per tutti gli esperimenti.
- Ovaio di criceto cinese-P-selectina (CHO-P) Cells
- Cellule CHO-P, che sono cellule CHO trasfettate stabilmente per esprimere umana P-sel, sono stati forniti dai collaboratori (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12.
- Cellule Cultura CHO-P nel T175 cm 2 boccette in 25 ml di F-12 media.
- Per passaging, lavare le cellule con 10 ml di PBS per 4-5 secondi e poi trypsinize in 10 ml di 1x Tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C, seguito da neutralizzazione in mezzi completi.
- Centrifugare la sospensione cellulare (400 xg, 5 min), aspirare accuratamente il surnatante, risospendere il pellet di cellule in 1 ml di mezzi completi e contare le cellule conun emocitometro.
2. Il funzionamento del Integrated Multi-pozzetti sistema Microfluidic
- Assicurarsi che tutta l'attrezzatura sia collegato correttamente e accendere i diversi moduli: il calcolatore, controllore, microscopio invertito, e fotocamera CCD.
- Aprire il software di imaging, assicurarsi che il modulo piastra multi-bene e il modulo di imaging siano correttamente presentate sullo schermo.
- Collegare i tubi alla trappola del vapore (collegato al controller), e anche li collegano all'interfaccia pressione.
- Posizionare la piastra multi-pozzetto nella piastra di riscaldamento / adattatore. Aggiungere nei pozzetti (descritti sotto) e attaccare un interfaccia sulla parte superiore della piastra. Posizionare la piastra per l'imaging sul palco automatizzato.
- L'interfaccia attribuisce alla parte superiore della piastra e applica una pressione pneumatica dal controller all'inizio dei pozzi, guidando il fluido attraverso i canali microfluidica alla portata definita, facilmente controllato utilizzando la piastra multi-pozzettoschermo di modulo in modalità manuale.
- Reagenti nel flusso canale attraverso un'area di osservazione, situato tra i pozzetti. Dimensioni del canale microfluidica sono 350 micron di larghezza x 70 micron di altezza. La lunghezza del canale lineare è 1 mm e il fondo dei canali comprende un coprioggetti da 180 micron, che è compatibile con campo chiaro, fase, fluorescenza e microscopia confocale.
- Acquisire video utilizzando una camera CCD (acquisizione flusso, 11 fotogrammi / sec) e analizzare tramite software compatibile.
3. Rivestimento di canali microfluidica con un substrato di proteine o di un monostrato di cellule
- Rivestimento canale microfluidica con fibronectina o P-/E-selectin
- Preparare 1 ml di 20 mg / ml soluzione fibronectina in PBS. Modificare il volume in base al numero di canali da verniciare (utilizzare 25-50 ml di fibronectina per canale).
- Aggiungere 25-50 ml di soluzione di fibronectina ad ogni ingresso bene. Applicare forza di taglio di 2 dine / cm 2per 5 min a perfusione canale. Si prega di notare il tallone di liquido che compare nella presa bene. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente
- Aspirare la soluzione da pozzi (non aspirare direttamente dal cerchio centrale che alimenta il canale) 1,13. Aggiungere 200-500 ml di PBS in presa e lavare canale con PBS applicando flusso di taglio di 2 dyn / cm 2 per 5 min. Il canale è ora correttamente rivestito con fibronectina e pronto per essere utilizzato.
- Per ricoprire con P-o E-SEL, preparare una soluzione 5 mg / ml di proteina ricombinante umana desiderata in PBS, e rivestire i canali come descritto sopra, con 1 ora di incubazione a 37 ° C per un rivestimento superficiale.
- Creazione di CHO-P o LMVEC monostrato all'interno del canale microfluidica
- Trypsinize delicatamente le cellule dai piatti di coltura per 3 minuti, spegnere utilizzando un volume di 2 volte di supporti pieni e centrifugare (5 min a 400 xg). Risospendere le cellule con 10 ml di supporti pieni e centrifugare (5 min a 400 xg) again.
- Contare le cellule per determinare la concentrazione delle cellule in sospensione. Per garantire la formazione di un monostrato confluente LMVEC all'interno del canale, portare la concentrazione cellulare a 15-20 milioni di cellule / ml. Per un confluente CHO-P monostrato cellulare, utilizzare 50-60 milioni di cellule / ml. Utilizzare 25-50 ml di sospensione cellulare per ogni canale - determinare il numero di cellule iniziale usato per l'esperimento di conseguenza.
- Aggiungere 25-50 ml di sospensione cellulare in concentrazione adeguata al bocchettone. Posizionare la piastra sul palco microscopio e introdurre cellule nel canale (2 dyn / cm 2) finché le cellule si osservano sullo schermo riempiendo tutto canali, e quindi arrestare il flusso.
- Riempire sia uscita e ingresso con 200 ml di LMVEC sia pieno o CHO media. Lasciate che le cellule si depositano ed aderiscono per 3 ore in incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
- Seguendo la incubazione 3 hr, lavare il canale con piena supporti (2 dyn / cm 2, 10-15 min) per rimuovere distaccaticellule. Le cellule dovrebbero ora appaiono completamente confluenti e il canale è ora pronto per l'uso. A seconda iniziale densità di semina cellulare, ulteriori 2-3 ore di tempo di assestamento può essere necessaria per assicurare una copertura completa della superficie con le cellule.
4. LMVEC attivazione pro-infiammatoria e anticorpo Blocco di P-/E-selectin
- Preparare una soluzione di TNF-α (10 ng / ml) in LMVEC mezzi basale.
- Per indurre l'attivazione infiammatoria LMVEC nei canali, aggiungere 100 microlitri della soluzione di TNF-α al bocchettone e introdurre la soluzione nel canale applicando flusso di taglio di 2 dyn / cm 2 per 5 min. Per i canali di controllo (non attivato EC), aggiungere 100 ml di LMVEC supporti basale a bocchettone e introdurre nel canale (2 dyn / cm 2 per 5 min). Canale è ora pronto per un saggio di rotolamento.
- Per bloccare P-sel e E-sel su LMVECs e cellule CHO-P, introdurre neutralizzando P-sel (clone AK4, 5 mg / ml in basal media) o E-sel (P2H3 clone, 5 ug / ml in mezzi basale) anticorpi nel canale e incubare per 1 ora a 37 ° C. Successivamente, lavare canali con i media basale (2 dyn / cm 2 per 5 min). I canali sono ora pronti per un saggio di rotolamento.
5. HL-60 di Rolling saggio sul substrato / Cellulari monostrato-Coated canali microfluidica
- Esaminare attentamente i canali al microscopio per confermare che i canali siano rivestite (nel caso del rivestimento con cellule, un monostrato di cellule confluenti completamente deve osservare).
- Per preparare HL-60 sospensione cellulare per gli esperimenti di rotolamento, centrifuga HL-60 sospensione cellulare (5 min a 400 xg) e lavare una volta con terreni di base. Contare le cellule e risospendere in IMDM (supporti basali, contenenti Ca 2 + e Mg 2 +) per creare una sospensione di cellule HL-60 con 5 milioni di cellule / ml. Utilizzare 25-50 ml di sospensione cellulare per ogni canale per eseguire il test di rotolamento.
- Aggiungere 25-50 ml di Sosp cellularension alla presa bene, piastra posto all'interno del portatarga a temperatura controllata (37 ° C) e posto sul palco microscopio. Quindi, introdurre cellule nel canale applicando forza di taglio di 2 dine / cm 2 (celle devono essere osservate entro 10-15 secondi che scorre dalla presa di ingresso).
- Per esaminare la risposta rotolamento in funzione della sollecitazione di taglio, ridurre taglio a 0,25 dyn / cm 2 e acquisire video 20-30 sec (tramite la funzione "acquisizione stream") in ogni taglio desiderata (shear aumentare gradualmente da 0,25 fino a 5 dyn / cm 2. E 'anche possibile utilizzare cesoie superiori).
- Acquisire video utilizzando una camera CCD (acquisizione flusso, 11 fotogrammi / sec) e analizzare i percorsi di laminazione e di laminazione velocità via software compatibile.
6. Citometria a flusso per rilevare l'espressione di molecole di superficie
- Dopo tripsinizzazione, preparare una sospensione cellulare (con 1-2 x 10 5 cellule / campione) di tipo cellulare desiderato (HL-60, CHO-P o LMVECs) in PBS (- / -), supplementato con 2% FBS. Lavare le cellule due volte e portare il volume del campione a 50 microlitri (usando lo stesso tampone).
- Incubare ogni campione con il fluoroforo coniugato desiderato Ab (vedi tabella allegata per informazioni dettagliate) a 4 ° C per 20 min (coprire con un foglio di alluminio).
- Lavare le cellule due volte (stesso tampone) e portare il volume finale della sospensione cellulare tinto a 200 microlitri. Analizzare campioni usando un citometro a flusso per rilevare l'espressione di molecole di superficie.
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Representative Results
Cellule HL-60 rotolano sulle superfici-P ed E-selectina, ma non su fibronectina
Cellule HL-60 sono considerati "rulli" gold standard quanto esprimono una varietà di ligandi homing, compresi i leganti rotolamento P-sel-1 glicoproteina ligando (PSGL-1) e Sialyl-Lewis X (sLex) 5,14 (Figura 1A ). La proteina di superficie PSGL-1 agisce come impalcatura per il SLeX tetra-saccaridi, che mediano l'interazione specifica con P ed E-sel, che sono up-regolati sull'endotelio durante l'infiammazione 5,6,15. Per testare le capacità del sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, numerosi canali microfluidici sono stati rivestiti contemporaneamente con diversi substrati e interazioni rotolamento di cellule HL-60 con tali superfici sono stati analizzati. Cellule HL-60 mostravano un comportamento rotolamento robusta sul P-sel-superficie rivestita, con cellule prima catturate dal flusso, seguito da un movimento di rotolamento distinto. Come mostrato nella Figura 1C, e consistonoento con la letteratura, cellule HL-60 esporre un comportamento simile rotolamento su superfici E-SEL, ma non su substrati fibronectina rivestite 14,16-19. Velocità cellula, analizzato mediante software compatibile, è stata rilevata in shear stress, mostrando una risposta laminazione robusta di celle-P ed E-sel con una velocità media tra 1-12 micron / sec.
Cellule HL-60 rotolano sul CHO-P monostrato rivestimento del canale microfluidico
Successivamente, abbiamo voluto valutare la possibilità di utilizzare questo sistema di microfluidica per testare in modo efficiente le interazioni tra le cellule di interesse e un monostrato di cellule che riveste la superficie. Per esplorare l'interazione di cellule HL-60 con un monostrato di cellule che esprime marcatori rotolamento, abbiamo utilizzato cellule CHO-P, che sono trasfettate esprimere stabilmente P-, ma non e-, sel (Figura 2A. Anche vedere la Figura 2B per rappresentante immagine di cellule HL-60 sul monostrato CHO-P rivestimento canale microfluidica) 11,12. HL-60 cellule mostravano una forte risposta di rotolamento su cellule CHO-P (Figura 2C). Per verificare se questo movimento di rotolamento è infatti mediato dalla P-sel, CHO-P monostrato stata preincubata con anticorpi bloccanti sia per P-o E-sel, prima perfusione di cellule HL-60 nel canale. Come mostrato nella Figura 2C, bloccando il monostrato CHO-P con P-sel Ab determinato una significativa riduzione del numero di laminazione di cellule HL-60 sulla superficie, dimostrando che la P-sel anzi mediatore HL-60 laminazione come precedentemente descritto 14,18. Esecuzione del test in un canale microfluidico consente screening rapido di diverse condizioni e blocco efficace dei recettori utilizzando solo piccoli volumi, appena 25 microlitri. Controllo isotipico o Ab bloccando E-sel (che non è espresso sulle cellule CHO-P) non hanno inciso il numero di cellule che rotolano sulle cellule CHO-P, dimostrando la forza di questo saggio in modo accurato pin-punta il coinvolgimento diretto dei surfac specificoe marcatori nelle interazioni rotolamento cellulari.
Laminazione di cellule HL-60 su LMVECs TNF-a-attivato è mediata da E-selectina
Le cellule endoteliali sono noti per up-regolare marcatori di superficie di adesione, come-P ed E-sel, durante l'infiammazione, l'assistenza nel reclutamento dei leucociti ai siti di infiammazione 5,6. Tuttavia, mentre murine endoteliali esprimono sia-P ed E-sel in risposta a stimoli infiammatori come l'interleuchina-1 (IL-1) e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), cellule endoteliali umane esprimono solo E-sel in risposta a questi citochine 20,21. Questo è stato convalidato in citofluorimetria saggio, che mostra l'espressione di E-sel, ma non P-sel, sulle cellule endoteliali microvascolari del polmone (LMVEC) in risposta alla stimolazione TNF-α (Figura 3A). La piastra microfluidica multi-pozzetto è costituito da numerosi canali microfluidica separate, consentendo maggiore test completi dei più condizioni diverse. Abbiamo utilizzato questo motivo vantaggiosaal piatto LMVECs all'interno dei canali microfluidica (Figura 3B) per analizzare rapidamente le interazioni di cellule HL-60 con EC sotto molteplici condizioni. Per simulare impostazioni infiammatorie, LMVECs sono stati pretrattati con la citochina pro-infiammatoria, TNF-α. È interessante notare, cellule HL-60 non hanno interagito con LMVECs non-attivato, e le cellule non sono state osservate a rotolare su questa superficie. Al contrario, cellule HL-60 mostrato un forte comportamento di rotolamento su TNF-α-attivato LMVECs, con velocità media di 5-15 micron / sec (Figura 3C).
Abbiamo poi l'obiettivo di esplorare il coinvolgimento di P-sel o E-sel nell'interazione rotolamento tra le cellule HL-60 e le LMVECs attivati. Per questo, TNF-α-attivato EC sono state preincubate con P-sel o E-sel anticorpi bloccanti, e la laminazione di cellule HL-60 è stata analizzata. Come mostrato nella Figura 4A, il blocco E-sel, che era up-regolata sul TNF-α-attivato LMVECs, ha comportato una significativadeclino formica del numero di cellule rotolando sul monostrato endoteliale attivato. Al contrario, utilizzando un isotipo di controllo o un Ab contro P-sel, che non è stato espresso sulla endoteliali attivate, non ha avuto un effetto significativo sulla HL-60 rotolare sullo strato endoteliale attivato. Questi dati dimostrano il coinvolgimento diretto di E-sel in HL-60 che rotola su TNF-α attivato EC, in linea con le precedenti relazioni 20,21. Dai video acquisiti, il software di analisi permette all'altro di individuare i percorsi delle singole cellule che interagiscono con il substrato. Abbiamo usato questa capacità di tracciare in particolare il percorso di singole cellule che hanno interagito con il TNF-α-attivato EC w / wo E-sel blocco. Come mostrato in Figura 4B, il numero di cellule che rotola su LMVECs attivati sbloccati era significativamente superiore su E-sel-bloccato attivato EC. Inoltre, è emerso che il movimento di rotolamento di HL-60 su LMVECs sbloccato è continua e robusta, mentre i percorsi di rotolamento delle cellulesu E-sel-bloccato EC è stato frammentato (ogni colore rappresenta una cella diversa, vedi per esempio le cellule af contro gl in Figura 4B). In coerenza con questa scoperta, la velocità di rotazione delle cellule HL-60 su sbloccati TNF-α-attivato EC era significativamente inferiore al loro velocità di rotazione su E-sel-bloccato EC (Figura 4C).
Figura 1. Cellule HL-60 rotolano sulle superfici E-selectina-rivestite-P e. (A) cellule HL-60 esprimono i ligandi rotolamento PSGL-1 e SLeX (Iso ctr - controllo isotipico, non Ab - nessun anticorpo). (B) Rappresentante immagine snap-shot di CFSE colorati con cellule HL-60 a P-sel rivestite in superficie sotto flusso. (C) cellule HL-60 robustamente rotolano su superfici E-sel-rivestite-P e, ma non sulla superficie fibronectina rivestite. Velocità di rotazione viene tracciata contro lo stress di taglio (n = 10-15 cellule per punto dati, le velocità sono stati analizzati da un software compatibile). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. HL-60 che rotola su CHO-P monostrato cellulare è direttamente mediata da P-sel. (A) cellule CHO-P esprimono P-sel, ma non e-sel. (B) immagine rappresentativa di cellule HL-60 sul CHO-P monostrato rivestimento della superficie del canale microfluidica (ingrandimento 10X). (C) HL -60 cellule che rotola su CHO-P monostrato è direttamente mediato dalla P-sel, come dimostrato da Ab bloccando assay (sbloccato - CHO-P monostrato non è stato incubato con un anticorpo, isotipo ctr-CHO-P monostrato incubate con un controllo isotipo; * p <0.05, ANOVA è stato utilizzato con HSD test post-hoc di Tukey, barre di errore rappresentanoSEM, n = 3.
Figura 3. Cellule HL-60 rotolano sul TNF-α-attivato LMVECs. (A) l'attivazione TNF-α di LMVECs inducono l'espressione di superficie di E-sel, ma non P-sel. (B) immagine rappresentativa del monostrato confluente LMVEC in due canali microfluidica (ingrandimento 4x). (C) cellule HL-60 esporre un robusta risposta a rotazione sul TNF-α-attivato LMVECs, ma non su LMVECs non-attivato. Iso ctr - controllo isotipico, unact EC - le cellule endoteliali non attivati, TNF-α-act EC -.-Α-TNF attivato cellule endoteliali Clicca qui per ingrandire la figura .
< br /> Figura 4. HL-60 rotola su TNF-α-attivato LMVECs è mediato da E-selectina. (A) HL-60 rotola su TNF-α-attivata LMVECs è mediata da E-sel, anziché P-sel, come dimostrato da Ab blocco assay (monostrato isotipo ctr-CE incubate con un controllo isotipo; * p <0.05, ANOVA è stato utilizzato con HSD test post-hoc di Tukey, barre di errore rappresentano SEM, n = 3) (B) percorso di analisi cellulare rivela continuo. e robusto laminazione di cellule HL-60 su cellule endoteliali attivate sbloccati rispetto al frammentata, laminazione debole osservata su E-sel-bloccato attivato EC (ogni colore rappresenta una cella diversa. analisi è stata effettuata tramite apposito software). (C) HL-60 laminazione velocity on TNF-α attivato EC è più lenta in cellule endoteliali attivate sbloccati rispetto alla E-sel-bloccato attivato EC (stress Shear utilizzato:. 2 dine / cm 2 * p <0.05, t-test, le barre di errore non appaiati a due code rappresentano SEM, n = 17-36 cellule per gruppo).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
Una delle sfide principali nella traduzione di successo della terapia a base di cellule esogena è l'incapacità di fornire in modo efficiente le celle a siti di lesioni e infiammazioni con alta efficienza attecchimento 3. Laminazione cella rappresenta un passo fondamentale nel processo di homing delle cellule, facilitando la decelerazione di cellule sulle pareti dei vasi sanguigni, portando infine alla loro ferma adesione e trasmigrazione attraverso l'endotelio nel tessuto 5. Una migliore comprensione del processo di laminazione per tipi di cellule candidato può portare allo sviluppo di tecniche per migliorare homing delle cellule e contribuire in modo significativo al miglioramento della terapia cellulare.
PPFC è uno strumento ampiamente utilizzato per esplorare rotolamento delle cellule, così come altri comportamenti cellulari sotto flusso di taglio. L'applicazione di PPFC per l'esame di neutrofili sull'endotelio è stato studiato da Lawrence et al. Nel 1987, e da allora produzione disponibile in commerciots sono stati sviluppati 8,9. PPFCs costituiti da due piastre piane separate da una guarnizione che controlla le dimensioni della camera 7. La piastra superiore contiene un afflusso e di efflusso, che attraverso l'uso di una pompa a siringa consente la perfusione della sospensione cellulare attraverso la camera di 7,8. C'è anche una porta aggiuntiva che applica una pressione negativa (depressione) per mantenere le piastre premuti insieme 7. Sebbene camere di flusso piastra paralleli sono stati effettivamente utilizzati per studiare risposte cellulari, comprese le cellule di rotolamento, in condizioni di flusso di taglio, ci sono numerose limitazioni che riducono l'efficacia. Una limitazione importante di camere di flusso è l'elevato numero di cellule e grandi volumi di reagenti necessari a causa del grande volume morto all'interno del sistema di flusso 7. Un altro punto critico è la presenza di bolle d'aria, che può facilmente verificarsi durante il montaggio camera di flusso, potenzialmente ostacolare il monostrato di cellule e substratorivestimento sulla piastra inferiore 22. Tuttavia, ulteriori modifiche sono state apportate PPCFs tradizionali a includere un'ulteriore porta sulla piastra superiore di agire come un gorgogliatore per facilitare la rimozione di bolle d'aria 23. Di iniziare l'esperimento PPFC è anche noioso, e la cella di flusso è suscettibile di perdita se la guarnizione è danneggiata o non assemblati con attenzione. Infine, vi è una differenza tra le velocità di taglio desiderate e applicate sperimentalmente, che si traduce in una ristretta gamma di portate uniformi. Con teoricamente a confronto quattro PPFCs con diverse posizioni di entrata e di uscita, è stato accertato che due delle configurazioni modellati tassi di taglio che hanno deviato dai tassi di taglio calcolati fino al 75% 24. Per riutilizzare la stessa camera richiede fasi di lavaggio in termini di tempo, e combinato con le sfide sopra descritte, questo rende i PPFCs piuttosto noioso e bassa velocità.
Nel nostro studio, abbiamo utilizzato un multi-well p completamente integratosistema di microfluidica in ritardo, basandosi su 1,2,13 flusso di taglio controllato accuratamente. Questo 48 pozzetti microfluidica comprende 24 canali microfluidica, con ogni coppia di pozzetti adiacenti collegate con un 1,25 canale microfluidica. 10-12 saggi di laminazione possono essere eseguite in 1 ora, consentendo un rapido screening delle diverse condizioni dozzina in un singolo giorno. I canali microfluidici possono essere facilmente rivestiti con un substrato proteico o monostrati di cellule, e l'interazione tra cellule di interesse e la superficie possono essere esposte utilizzando un microscopio, acquisita da una telecamera CCD e analizzati mediante software compatibile. Parametri chiave quali quantificazione cella, calcolo della velocità di rotolamento e specifiche analisi percorso traccia possono essere facilmente ottenuti per analizzare efficientemente comportamento di rotolamento su substrati multipli 13. In questo studio, abbiamo valutato l'efficacia di questo sistema nello studio di laminazione cella utilizzando HL-60 promielocitica linea cellulare di leucemia, ben consolidate "rulli" che esprimono chiaveligandi di rotolamento, come PSGL-1 e SLeX, che insieme agiscono come ligandi di contropartita per P e E-sel 15,26. In correlazione con precedenti relazioni, le cellule HL60 infatti esibito un comportamento rotolamento robusta sui canali microfluidica-P e E-sel-rivestito, con lenti velocità di rotolamento di 1-12 micron / sec 14,17-19. HL-60 cellule non rotolare sulla superficie fibronectina, in linea con le precedenti relazioni dimostrano che indifferenziati cellule HL-60 non presentano interazioni adesive con fibronectina 16. La progettazione del sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, consentendo fino a 10-12 saggi / hr rispetto a solo 1-2 saggi / hr che può essere testato utilizzando PPFCs, aumenta notevolmente la capacità di almeno 5 volte. Inoltre, PPFCs devono essere riassemblati e lavato prima di ogni riutilizzo, rallentando ulteriormente la velocità delle prestazioni. Inoltre, il flusso facilmente regolabile consente una rapida esecuzione degli esperimenti shear-dipendenti, che possono poi essere facilmente analizzati tramite software idoneo.
Abbiamo poi testato questo sistema piastra multi-pozzetto analizzando le interazioni tra cellule HL-60 e EC rivestimento del canale microfluidica. EC sono noti per esprimere P ed E-sel durante il processo infiammatorio 5. Per fornire EC con uno stimolo infiammatorio, li abbiamo pretrattati con TNF-α. Mentre E-sel era regolata up-, P-sel non era, coerente con la letteratura mostra che i CE umano esprimono E-sel, ma non P-sel, in risposta all'attivazione TNF-α poiché il primate promotore P-sel manca TNF -α elementi di risposta, resulting in induzione trascrizionale di solo E-sel 20,21. Condizioni infiammatorie sono stati poi simulati all'interno del canale incubando il monostrato CE con TNF-α, seguita da perfusione di cellule HL-60 per esplorare le sue interazioni con la superficie CE. Mentre HL-60 non hanno interagito con unactivated EC, hanno fatto visualizzare una risposta rotolamento robusta sul TNF-α-attivato EC (Figura 3C), correlata con la loro risposta riportati in letteratura 22. Ab bloccando esperimenti (Figura 4A) poi mostrato che E-sel, ma non P-sel, il blocco ha determinato una significativa riduzione HL-60 rotola su attivato EC. Questi dati dimostrano il coinvolgimento diretto di E-sel, e non P-sel, nel mediare arrotolare HL-60 on TNF-α-attivato umana EC 20,21. L'Ab blocco esperimenti, al contrario mostrando rolling E-sel-mediata su attivato EC vs P-sel-mediata che rotola su CHO-P, convalida ulteriormente la fattibilità e la pertinenza di Ab blocchizzazioneesperimenti ng rapidamente eseguita da questo sistema microfluidica. È interessante notare, questa inibizione di rotolamento non era completa (riduzione di circa il 70%), suggerendo che altri recettori superficiali come VCAM-1, inoltre partecipano HL-60 rotola su attivato EC 27. Percorso di analisi Traccia rivelato ulteriormente un altro fenomeno interessante - mentre arrotolare HL-60 on sbloccato attivato EC è stato continuo e robusto, il basso numero di cellule che ancora appoggia su E-sel bloccata attivato EC visualizzato un percorso di rotolamento frammentata sul EC bloccato ( Figura 4B). Questo fenomeno non è stato osservato in cellule endoteliali incubate con P-sel blocco o isotipo di controllo (dati non mostrati). Questo suggerisce fortemente che mentre una risposta di rotolamento è possibile tramite altri marcatori quando EC E-sel è bloccato, questa rotazione si basa su interazioni deboli HL-60-CE, parziali, sostenendo solo un sciolto, risposta parziale a rotazione con l'attivazione EC 5,22 ,27-29. Questo è supportato da dati mostrati nella Figura 4C 30-33, e migliorare il throughput della microfluidica tramite il sistema piastra multi-bene qui presentato, evidenzia ulteriormente il potenziale di questa tecnologia per l'analisi efficiente e precisa delle principali proprietà di rotolamento verso migliorate applicazioni terapeutiche .
Questo studio si è concentrato sull'esame di HL-60 cellule che rotola su substrati proteine e monostrati cellulari sotto fisiologicamente rilevanti e controllato accuratamente flusso di taglio utilizzandoun sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto. Analogamente, altri tipi cellulari e altri monostrati substrati / cellulari possono facilmente essere utilizzati per studiare le loro proprietà di rotolamento. Facilità d'uso e di analisi semplice permette una precisa analisi di importanti proprietà volventi e Ab blocco o attivazione con diversi fattori di crescita o inibitori possono essere usati per esplorare potenziale coinvolgimento di marcatori molecolari nella risposta rotolamento. Ciò può essere particolarmente utile per lo studio di rotolamento cellule staminali e homing, che può essere progettato per migliorare basata su cellule staminali terapia 34-36. È importante sottolineare che, più condizioni possono essere testati con una migliore produttività (5-10 volte superiore rispetto PPFCs), permettendo lo studio rapido ed efficace di immobili rotolamento grazie al design piatto. Altri saggi pertinenti per homing cellulare, come l'adesione cellulare, chemiotassi e trasmigrazione possono essere studiate usando questo sistema 1,10,13. Nel complesso, questo sistema microfluidica emerge come un potente tecnica per studiare rotolamento cellulare e should servire come strumento utile per aiutare nella traduzione clinico di terapia cellulare esogeno.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Acknowledgments
Cellule CHO-P sono stati un gentile dono del Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health di sovvenzione HL095722 a JMK Questo lavoro è stato supportato anche in parte da un Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award per JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
References
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