Summary
Denna studie använde en platta med flera brunnar mikrofluidsystem, avsevärt öka genomströmningen av cellvalsstudier enligt fysiologiskt relevant skjuvflöde. Med tanke på betydelsen av cellvalsning i flera steg cellmålsökande kaskad och vikten av cellmålsökande efter systemisk tillförsel av exogena populationer av celler i patienter, erbjuder detta system potential som en screening plattform för att förbättra cellbaserad terapi.
Abstract
En stor utmaning för cell-baserad terapi är oförmågan att system rikta en stor mängd levande celler med hög effektivitet till vävnaderna av intresse efter intravenös eller intraarteriell infusion. Följaktligen ökar cellmålsökande närvarande studeras som en strategi för att förbättra cellterapi. Cell rullar på det vaskulära endotelet är ett viktigt steg i processen för cellmålsökande och kan undersökas in vitro med hjälp av en parallell plattflödeskammare (PPFC). Detta är dock en extremt omständlig, låg genomströmning analys med dåligt kontrollerade strömningsförhållanden. Istället använde vi en platta med flera brunnar mikroflödessystem som möjliggör studier av cellulära rullande egenskaper i en högre genomströmning i exakt kontrollerad, fysiologiskt relevant skjuvflöde 1,2. I denna skrift visas hur de rullande egenskaperna hos HL-60 (human promyelocytisk leukemi) celler till P-och E-selektin belagda ytor samt på cellmonoskiktbelagda ytor kan vara readily undersökas. För att bättre simulera inflammatoriska tillstånd, var mikrofluidikkanal yta belagd med endotelceller (ECS), som sedan aktiveras med tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), betydligt ökat utbyte med HL-60-celler under dynamiska förhållanden. Den förbättrade genomströmningen och integrerat flera parametrar mjukvaruanalys plattform, som möjliggör snabb analys av parametrar som rullhastigheter och rullbana, är viktiga fördelar för att bedöma cell rullande egenskaper in vitro. Att tillåta en snabb och korrekt analys av tekniska metoder som syftar till att påverka cell rullande och målsökande, kan denna plattform hjälpa för exogena cellbaserad terapi.
Introduction
En av de stora utmaningarna i den framgångsrika kliniska översättningen av cellbaserad terapi är ineffektiv leverans eller inriktning på system infunderas celler till önskade platser 3,4. Följaktligen finns det ett ständigt sökande efter strategier för att förbättra cellmålsökande, och specifikt cell rullning, som en strategi för att förbättra cellterapi. Cell rullar på blodkärlen är ett viktigt steg i cellmålsökande kaskad, klassiskt definierad för leukocyter som rekryteras till sjukdomsplatser 5. Detta steg styrs av specifika interaktioner mellan endotel selektinerna, dvs P-och E-selektin (P-och E-sel), och deras disk ligander på ytan av leukocyter 5,6. Bättre förståelse och förbättrad effektivitet i cellmålsökande, och specifikt valssteget, är av stor betydelse i jakten på nya plattformar för att förbättra cellbaserad terapi. Till dags dato har detta uppnåtts genom användning av parallella platta flödeskamrarna (PPFCs), innefattande två plana plates med en packning mellan dem, med ett inflöde och utflöde porten på den övre plattan, genom vilken en cellsuspension perfusion genom att använda en sprutpump 7,8, 9. Ytan på bottenplattan kan beläggas med en relevant cellmonoskiktet / substraten och samspelet mellan perfuserade celler och ytan under skjuvning flödet är sedan undersökas 7. Dock är PPFC liten produktion, reagenskrävande, och ganska tråkiga metod, med bubbelbildning, läckage, och dåligt kontrollerat flöde presentera stora nackdelarna.
En alternativ teknik till den traditionella PPFC är en platta med flera brunnar mikrofluidsystem, vilket medger högre genomströmning prestanda cellulära analyser (upp till 10 gånger högre än PPFCs) under noggrann, datorstyrd skjuvflöde med låg reagensförbrukning 1,10. Cell rullande experiment utförs inuti mikroflödeskanaler, som kan beläggas med cellmonoskikt eller manipulerade substrat och avbildas USIng ett mikroskop, med rullande egenskaper lätt analyseras med hjälp av en lämplig programvara. I denna studie visar vi kapaciteten hos denna platta med flera brunnar mikrofluidsystem genom att studera de rullande egenskaperna hos human promyelocytisk leukemi (HL-60)-celler på olika ytor. HL-60 som rullar på substrat som P-och E-sel, såväl som på cellmonoskikt som uttrycker olika rullande receptorer analyserades. Dessutom blockerande antikropp (Ab) användes för att demonstrera direkt inblandning av specifika selektinerna i att medla den rullande rörelse av HL-60 på dessa ytor. Rullande experiment utfördes med ökad genomströmning under stabil skjuvflöde, med minimal reagens / cell konsumtion, vilket möjliggör effektiv analys av viktiga valsparametrar såsom valshastighet, antalet rullande celler, och rullande path egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling
- Human promyelocytisk leukemi (HL-60) celler
- Kultur HL-60-celler i 75 cm 2 kolvar med 15 ml av Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM), kompletterat med 20% (vol / vol) fetalt bovint serum (FBS), 1% (volym / volym) L-glutamin och 1 % (vol / vol) penicillin-streptomycin.
- Ändra media var 3 dagar genom att aspirera hälften av cellsuspensionen volym och ersätta den med fullständig IMDM media.
- För karboxifluorescein-diacetat, succinimidylester (CFSE) färgning, centrifugera HL-60 cellsuspension (400 xg, 5 min), återsuspendera i en 1 fiM CFSE-lösning (framställd i förvärmd PBS) och inkubera under 15 min vid 37 ° C. Därefter centrifug celler, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i färskt förvärmt medium under 30 min. Tvätta cellerna i PBS och sedan använda för rullande experiment (se figur 1B för representativ bild av CFSE-färgade HL-60 celler på P-sel-belagd yta).
- Lung mikrovaskulära endotelceller (LMVECs)
- Coat 100 mm Petri-skålar med 0,1% gelatinlösning (volym / volym i PBS) och inkubera vid 37 ° C under minst 30 min.
- Kultur LMVECs på gelatinbelagda 100 mm petriskålar i fullständig endothelial tillväxtmedium (endothelial basalt medium-2 (EBM-2)), kompletterat med en viss tillväxt komplettera kit, se REAGENS). Ändra media varannan dag och underkulturceller på att nå 80-90% sammanflödet.
- För sub-kultur, tvätta cellerna med PBS och sedan bort celler med 4 ml 1x trypsin-EDTA i 3 min vid 37 ° C och neutralisera i en lika stor volym av kompletta EBM-2 media. Överför cellsuspensionen i ett 15 ml rör och centrifugee (400 xg, 5 min). Efter centrifugering, suspendera pelleten i 1 ml av kompletta endothelial media och räkna celler med en hemocytometer. Inte över-passagen cellerna, eftersom det påverkar deras morfologi och funktion-användning endast celler under passagen 7 för alla experiment.
- Chinese Hamster Ovary-P-selektin (CHO-P) Celler
- CHO-P-celler, som är CHO-celler stabilt transfekterade för att uttrycka mänskliga P-sel, lämnades av kollaboratörer (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12.
- Kultur CHO-P celler i T175 cm 2 flaskor i 25 ml F-12 media.
- For passaging, tvätta cellerna med 10 ml PBS under 4-5 sekunder och sedan trypsinize i 10 ml 1 x Trypsin-EDTA under 3 min vid 37 ° C, följt av neutralisering i fullständiga media.
- Centrifugera cellsuspensionen (400 xg, 5 min), försiktigt aspirera supernatanten, resuspendera cellpelleten i 1 ml fullständig media och räkna cellerna meden hemocytometer.
2. Driften av den integrerade platta med flera brunnar mikrofluidsystem
- Se till att all utrustning är korrekt ansluten och slå på de olika modulerna: dator, controller, inverterat mikroskop, och CCD-kamera.
- Öppna bildprogram, se till att flera brunnar modulen och imaging modulen är korrekt presenteras på skärmen.
- Anslut rören till ångfällan (ansluten till styrenheten) och även ansluta dem till Pressure Interface.
- Placera flera brunnar i plattan värmare / adapter. Lägg reagens till brunnar (beskrivna nedan) och fäst gränssnitt på toppen av plattan. Placera plattan för avbildning på automatiserad skede.
- Gränssnittet fäster vid toppen av plattan och tillämpar ett pneumatiskt tryck från regulatorn till toppen av brunnarna, som driver vätska genom mikroflödeskanaler med den definierade flödeshastighet kontrolleras lätt med flerbrunnsplattamodul skärm i manuellt läge.
- Reagens i kanalflödet över ett observationsområde, som ligger mellan brunnarna. Mikroflödessystem kanal dimensioner är 350 ìm bred x 70 nm lång. Längden av den linjära kanalen är en mm och botten av kanalerna innefattar en 180 um täckglas av glas, som är kompatibel med ljusfält, fas, fluorescens och konfokalmikroskopi.
- Förvärva video med hjälp av en CCD-kamera (stream förvärv, 11 bilder / sek) och analysera via kompatibel programvara.
3. Beläggning av mikroflödessystem kanaler med en proteinsubstrat eller en cell monolager
- Beläggning av mikroflödeskanal med fibronektin eller P-/E-selectin
- Bered en ml av 20 ug / ml fibronektin lösning i PBS. Ändra volym baserat på antalet kanaler som skall beläggas (använd 25-50 pl av fibronektin per kanal).
- Lägg till 25-50 l av fibronektin lösning till varje inlopp väl. Applicera skjuvkraft av 2 dyn / cm 2under 5 min för att perfundera kanalen. Observera pärlan av vätska som förekommer i utloppet väl. Inkubera under 30-45 min vid RT
- Aspirera lösningen från brunnar (inte aspirera direkt från mittcirkeln som matar kanalen) 1,13. Lägg till från 200 till 500 | il av PBS i utlopps väl och tvätta kanal med PBS genom att anbringa skjuv-flöde av 2 dyn / cm 2 till 5 min. Kanalen är nu ordentligt belagd med fibronektin och redo att användas.
- För att belägga med P-eller E-sel, förbereda en 5 ^ g / ml lösning av den önskade humana rekombinant protein i PBS, och täck de kanaler som beskrivs ovan, med 1 h inkubation vid 37 ° C för att medge ytbeläggning.
- Skapande av CHO-P eller LMVEC monolager inne i mikroflödessystem kanal
- Trypsinize försiktigt cellerna från odlingsskålar under 3 min, avbröt med användning av en 2-faldig volym av fullständiga medier och centrifugera (5 min vid 400 xg). Resuspendera cellerna med 10 ml av kompletta medium och centrifugera (5 min vid 400 xg) again.
- Räkna cellerna för att bestämma cellkoncentrationen i suspensionen. För att säkerställa bildningen av en konfluent LMVEC monoskikt inuti kanalen, bringa cellkoncentrationen till 15 till 20.000.000 celler / ml. För en konfluent CHO-P-cellmonoskiktet, använd 50 till 60.000.000 celler / ml. Använd 25-50 l cellsuspension för varje kanal - bestämma initial cell nummer som används för experimentet i enlighet därmed.
- Lägg till 25-50 l cellsuspension i lämplig koncentration till inloppet väl. Placera plattan på mikroskop scenen och införa celler i kanalen (2 dyn / cm 2) tills celler observeras på skärmen fyller hela kanaler, och sedan stoppa flödet.
- Fyll både utlopp och inlopp med 200 l av antingen full LMVEC eller CHO media. Låt cellerna sedimentera och vidhäfta under 3 h i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2).
- Efter 3 timmars inkubation, tvätta kanalen med full medier (2 dyn / cm 2, 10-15 min) för att avlägsna lösceller. Celler ska nu visas helt sammanflytande och kanalen är nu klar att användas. Beroende på initial cellsåddtäthet kan ytterligare 2-3 h av inställningstid krävas för att säkerställa fullständig täckning av ytan med cellerna.
4. LMVEC proinflammatoriska Aktivering och Antikroppblockering av P-/E-selectin
- Förbered ett TNF-α-lösning (10 ng / ml) i LMVEC basalmedia.
- För att inducera inflammatoriska aktiveringen av LMVEC i kanalerna, tillsätt 100 pl av den TNF-α-lösning till inloppet väl och införa lösningen in i kanalen genom att anbringa skjuv-flöde av 2 dyn / cm 2 till 5 min. För styrkanaler (icke-aktiverade EC), tillsätt 100 l av LMVEC basala media till inloppet väl och spruta in i kanalen (2 dyn / cm 2 i 5 min). Kanal är nu redo för en rullande assay.
- För att blockera P-sel-och E-sel på LMVECs och CHO-P-celler, införa neutraliserande P-sel (klon AK4, 5 ng / ml i basal media) eller E-sel (klon P2H3, 5 pg / ml i basalmedia) antikroppar in i kanalen och inkubera under 1 timme vid 37 ° C. Därefter tvättar kanaler med basalmedium (2 dyn / cm 2 till 5 min). Kanaler är nu redo för en valsningsanalys.
5. HL-60 Rolling analys på Substrat / encellsskiktet-Coated mikroflödessystem kanaler
- Noggrant undersöka kanalerna under mikroskop för att bekräfta att kanalerna är ordentligt belagt (i fallet med beläggning med celler, bör observeras ett helt sammanflytande cellmonolager).
- För att förbereda HL-60 cellsuspension för de rullande experiment, centrifug HL-60 cellsuspension (5 min vid 400 xg) och tvätta en gång med basala medier. Räkna celler och återsuspendera i IMDM (basal media, innehållande Ca2 + och Mg2 +) för att skapa en HL-60-cell-suspension med 5 miljoner celler / ml. Använd 25-50 l cellsuspension för varje kanal för att utföra valsanalysen.
- Lägg till från 25 till 50 | il av cellDrivlina & hjulupphnsion till utlopp väl, plats platta inne i temperaturreglerade hållare (37 ° C) och plats på mikroskop scenen. Därefter införa celler i kanalen genom att tillämpa tvärkraft av 2 dyn / cm 2 (celler bör observeras inom 10-15 sek flödar från utloppet till inloppet).
- För att undersöka den rullande respons som funktion av skjuvspänning, minska skjuvning till 0,25 dyn / cm 2 och skaffa 20-30 sek video (med "stream förvärv"-funktion) i varje önskad skjuvning (öka skjuvning gradvis från 0,25 upp till 5 dyn / cm 2. Det är även möjligt att använda högre saxar).
- Förvärva video med hjälp av en CCD-kamera (stream förvärv, 11 bilder / sek) och analysera rullande banor och rullande hastigheter via kompatibel programvara.
6. Flödescytometri för att detektera uttryck av ytmolekyler
- Efter trypsinisering, förbereda en cellsuspension (med 1-2 x 10 5 celler / prov) av önskad celltyp (HL-60, CHO-P eller LMVECs) i PBS (- / -), kompletterat med 2% FBS. Tvätta cellerna två gånger och föra provvolymen till 50 | il (med användning av samma buffert).
- Inkubera varje prov med önskad fluoroforen-konjugerade Ab (se bifogad tabell för detaljerad information) vid 4 ° C i 20 minuter (täck med aluminiumfolie).
- Tvätta cellerna två gånger (samma buffert) och bringa den slutliga volymen färgades cellsuspension till 200 | il. Analysera prover med hjälp av en flödescytometer för att upptäcka uttryck för ytmolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HL-60 celler rulla på P-och E-selektin ytor, men inte på fibronektin
HL-60 celler anses gold standard "valsar" som de uttrycker en mängd olika målsökande ligander, inklusive rullligander P-sel glykoproteinhormoner ligand-1 (PSGL-1) och Sialyl-Lewis X (sLex) 5,14 (Figur 1A ). Den yta protein PSGL-1 fungerar som en byggnadsställning för tetrasackariden Slex, som förmedlar specifik interaktion med P-och E-sel, som uppregleras på endotel vid inflammation 5,6,15. För att testa kapaciteten hos multi-brunnar mikroflödessystem, har ett stort antal mikroflödessystem kanaler belagda samtidigt med olika substrat och rull växelverkan av HL-60-celler med dessa ytor analyserades. HL-60 celler uppvisade en robust rullande beteende på P-sel-belagda ytan, med celler som först fångade från flöde, följt av en distinkt rullande rörelse. Såsom visas i figur 1C, och bestårent med litteraturen, HL-60 celler uppvisar en liknande rullande beteende på E-sel ytor, men inte på fibronektinbelagda substrat 14,16-19. Cellhastighet, analyseras via kompatibel programvara, avsattes mot skjuvspänning, visar en robust rullande svar av celler på P-och E-sel med en genomsnittlig hastighet mellan 1-12 nm / sek.
HL-60-celler rulla på CHO-P monoskikt belägga mikroflödeskanalen
Därefter riktar vi att bedöma möjligheten att använda denna mikroflödessystem för att effektivt testa interaktioner mellan celler av intresse och en cell monolager beläggning på ytan. För att undersöka interaktionen av HL-60-celler med en cellmonoskikt som uttrycker rullande markörer använde vi CHO-P-celler, som är transfekterade för att stabilt uttrycka P-, men inte E-, SEL (fig. 2A. Se även figur 2B för representativ bild av HL-60 celler på CHO-P monolager beläggning mikroflödessystem kanal) 11,12. HL-60-celler visade en stark rullande svar på CHO-P-celler (figur 2C). För att testa huruvida denna löpande rörelse verkligen medieras av P-sel ades CHO-P-monoskikt förinkuberades med blockerande antikroppar för antingen P-eller E-sel, före perfusion av HL-60-celler in i kanalen. Såsom visas i figur 2C, blockering CHO-P monoskikt med en P-sel Ab resulterade i en signifikant minskning av antalet rullande HL-60 celler på ytan, vilket visar att P-sel verkligen medierar HL-60 valsning, såsom beskrivits tidigare 14,18. Analysen utförs i en mikroflödeskanal tillåter snabb screening av olika förhållanden och effektiv blockering av receptorerna genom att använda endast små volymer, så lite som 25 | il. Isotypkontroll eller Ab blockerar E-sel (som inte uttrycks på CHO-P-celler) påverkade inte antalet rullande celler på CHO-P-celler, vilket visar styrkan i denna analys i exakt pin-pekar direkt deltagande av specifik surface markörer i cellulära rullande interaktioner.
Valsning av HL-60-celler på TNF-a-aktiverad LMVECs förmedlas av E-selektin
Endotelceller är kända för att uppreglera vidhäftnings ytmarkörer, såsom P-och E-sel, under inflammation, hjälpa till vid rekrytering av leukocyter till inflammationsställen 5,6. Men medan murina EC uttrycker både P-och E-sel som svar på inflammatoriska stimuli såsom interleukin-1 (IL-1) och tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), bara människor EC express E-sel som svar på dessa cytokiner 20,21. Detta har validerats i vårt flödescytometri-analys som visar uttryck av E-sel, men inte P-sel, på lung mikrovaskulära endotelceller (LMVEC) som svar på TNF-α-stimulering (figur 3A). Den fler väl mikroflödesplatta består av många separata mikroflödessystem kanaler, vilket gör att högre genomströmning testning av flera olika förhållanden. Vi använde detta fördelaktig konstruktionatt plätera LMVECs inuti mikroflödeskanaler (Figur 3B) för att snabbt analysera interaktioner av HL-60-celler med ECS enligt flera villkor. För att simulera inflammatoriska inställningar gjordes LMVECs förbehandlades med den pro-inflammatoriska cytokinen TNF-α. Intressant nog HL-60-celler som inte interagerar med un-aktiverad LMVECs och celler observerades inte att rulla på denna yta. Tvärtom, HL-60-celler uppvisade en stark rullande beteende på TNF-α-aktiverad LMVECs, med en genomsnittlig hastighet av 5-15 ^ m / sek (fig 3C).
Vi strävade sedan att utforska medverkan av P-sel eller E-sel i det rullande samverkan mellan HL-60-celler och de aktiverade LMVECs. För detta var TNF-α-aktiverade EC förinkuberades med P-sel eller E-sel blockerande antikroppar, och rullning av HL-60-celler analyserades. Såsom visas i figur 4A, som blockerar e-sel, som var uppreglerad på TNF-α-aktiverad LMVECs, resulterade i signifikantamyra nedgång i antalet rullande celler på aktiverade endothelial monolager. Däremot använder en isotypkontroll eller Ab mot P-sel, som inte uttrycktes på aktiverade EC, hade inte någon signifikant effekt på HL-60 rullar på aktiverade endothelial lagret. Dessa data visar direkt medverkan av E-sel i HL-60 rullar på TNF-α-aktiverad EC, i linje med tidigare rapporter 20,21. Från de förvärvade videor medger analysprogram en för att spåra banorna av enskilda celler som interagerar med substratet. Vi använde denna förmåga att specifikt följa den väg av enskilda celler som hade kontakter med TNF-α-aktiverad EC w / wo E-sel blockering. Såsom visas i figur 4B, antalet rullande celler på oblockerade aktiverade LMVECs var signifikant högre än på E-sel-blockerat aktiverat ECS. Dessutom visade det sig att den rullande rörelse av HL-60 på oblockerade LMVECs är kontinuerlig och stabil, medan de rullande banor av cellerpå E-sel-blockerad EC var splittrad (varje färg representerar en annan cell, se exempelvis celler af vs gl i figur 4B). I konsistens med detta konstaterande, det rullande hastigheten för HL-60 celler på oblockerade TNF-α-aktiverade EC var betydligt lägre än deras rullhastigheten på E-sel-blockerad EC (Figur 4C).
Figur 1. HL-60-celler rulla på P-och E-selektin-belagda ytor. (A) HL-60-celler uttrycker de rullande liganderna PSGL-1 och Slex (Iso CTR - isotypkontroll, ingen Ab - ingen antikropp). (B) Representant snap-shot bild av CFSE-färgade HL-60 celler på P-sel belagd yta under flöde. (C) HL-60-celler kraftigt rulla på P-och E-sel belagda ytor, men inte på fibronektin-belagda ytan. Rullande hastigheten plottas mot skjuvspänning (n = 10-15 celler per datapunkt var hastigheter analyseras av kompatibel programvara). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. HL-60 rullar på CHO-P-cell monolager är direkt förmedlad av P-sel. (A) CHO-P-celler som uttrycker P-sel, men inte E-sel. (B) Representativa bilden av HL-60 celler på CHO-P monoskikt belägga ytan på mikroflödeskanalen (10X förstoring). (C) HL -60 cell rullar på CHO-P monolager är direkt förmedlad av P-sel vilket framgår av Ab blockeringsanalys (ospärrade - CHO-P cellslager var inte inkuberas med en antikropp, isotyp ctr-CHO-P monolager inkuberas med en isotypkontroll; * p <0,05, envägs ANOVA användes med Tukey HSD post hoc-test, felstaplar representerarSEM, n = 3.
Figur 3. HL-60 celler rulla på TNF-α-aktiverade LMVECs. (A) TNF-α aktivering av LMVECs framkalla yta uttryck av E-sel, men inte P-sel. (B) Representant bild av sammanflytande LMVEC monolager i två mikroflödessystem kanaler (4x förstoring). (C) HL-60 celler uppvisar en robust rullande svar på TNF-α-aktiverade LMVECs, men inte på FN-aktiverade LMVECs. Iso ctr - isotypkontroll, unact EC - aktiverade endotelceller, TNF-α-act EC -. TNF-α-aktiverade endotelceller Klicka här för att visa en större bild .
< br /> Figur 4. HL-60 rullar på TNF-α-aktiverad LMVECs förmedlas av E-selektin. (A) HL-60 rullar på TNF-α-aktiverad LMVECs förmedlas av E-sel, istället för P-sel, vilket framgår av Ab blockering analys (isotyp ctr-EC monoskikt inkuberades med en isotyp kontroll, * p <0,05, envägs ANOVA användes med Tukey HSD post hoc-test, felstaplar utgör SEM, n = 3) (B) Cell bana analys visar kontinuerlig. och robust valsning av HL-60 celler på oblockerade aktiverade EC än fragmenterad, svagt rullande observeras på E-sel-blockerad aktiverad EC (varje färg representerar en annan cell. Analys utfördes via lämplig programvara). (C) HL-60 rullande hastighet på TNF-α-aktiverade EC är långsammare på oblockerade aktiverade EC jämfört med E-sel-blockerat aktiverat ECS (Skjuvspänning använts:. 2 dyn / cm 2 * p <0,05, oparade två-svansade t-test, felstaplar representerar SEM, n = 17 till 36 celler per grupp).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de stora utmaningarna i lyckad översättning av exogena cellbaserad terapi är oförmågan att effektivt leverera celler till platser av skada och inflammation med hög engraftment effektivitet 3. Cell rullande utgör ett avgörande steg i processen för cellmålsökande, lätta retardation cellerna på blodkärlens väggar, till slut leder till deras starka adhesion och migration genom endotelet i vävnaden 5. Bättre förståelse av valsningsprocessen för typer kandidat cell kan leda till utveckling av tekniker för att öka cellmålsökande och bidrar avsevärt till att förbättra cellbaserad terapi.
PPFC är ett vanligt förekommande verktyg för att utforska cellvalsning, samt andra cellulära beteenden under skjuvning flöde. Tillämpningen av PPFC för att pröva neutrofiladhesion på endotel först studerats av Lawrence et al. 1987, och sedan dess kommersiellt tillgängliga produkts har utvecklats 8,9. PPFCs består av två plana plattor som åtskiljs av en packning som styr dimensionerna hos kammaren 7. Den övre plattan innehåller en in-och utflöde port, som genom användning av en sprutpump möjliggör perfusion av cellsuspensionen genom kammaren 7,8. Det finns också en ytterligare port som applicerar negativt tryck (vakuum) för att hålla plattorna pressas samman 7. Även parallella plattflödeskammare har effektivt använts för att undersöka cellulära svar, bland annat cell rullande, under skjuvning flöde, finns det många begränsningar som minskar dess effektivitet. En allvarlig begränsning med flödeskammare är det stora antalet celler och stora volymer av reagens som krävs beror på den stora döda volymen i flödessystemet 7. En annan viktig fråga är närvaron av luftbubblor, som lätt kan uppstå under flödeskammarenhet, potentiellt hämmar cellmonoskiktet och substratetbeläggning på bottenplattan 22. Emellertid har ytterligare modifikationer gjorts till traditionella PPCFs att införliva en ytterligare port på den övre plattan för att verka som en bubbelfälla för att underlätta avlägsnandet av luftbubblor 23. Uppställning av PPFC experimentet är också omständlig och flödescellen är känslig för läckage om packningen är skadad eller inte noggrant monterad. Slutligen finns det en skillnad mellan de önskade och experimentellt tillämpade skjuvhastigheter, vilket resulterar i ett smalt område av enhetliga flödeshastigheter. Genom att teoretiskt jämföra fyra PPFCs med olika in-och utloppspositioner, visade det sig att två av de konfigurationer modelleras skjuvningsgrader som avvikit från de beräknade skjuvhastigheter med upp till 75% 24. För att återanvända samma kammare kräver tidskrävande tvättsteg, och i kombination med de ovan beskrivna utmaningarna, detta gör PPFCs ganska tråkiga och låg genomströmning.
I vår studie använde vi en helt integrerad med flera bra psen mikroflödessystem, att förlita sig på noggrant kontrollerade skjuvflöde 1,2,13. Detta 48 väl microfluidic Plattan innefattar 24 mikroflödeskanaler, varvid varje par av intilliggande brunnar förbundna med en mikroflödeskanalen 1,25. 10-12 rullande analyser kan utföras i 1 timme, vilket gör snabb screening av flera dussin förhållanden i en enda dag. De mikroflödeskanaler kan lätt beläggas med ett proteinsubstrat eller-cellmonoskikt, och samspelet mellan cellerna av intresse och ytan kan avbildas med ett mikroskop, som förvärvats av en CCD-kamera och analyseras av kompatibel mjukvara. Viktiga parametrar såsom cell kvantifiering, beräkning av rullhastigheten och specifikt spår stig analys kan lätt erhållas för att effektivt analysera rullande beteende på flera substrat 13. I denna studie, bedömde vi effektiviteten av detta system för att studera cell rullande med hjälp av HL-60 promyelocytisk leukemi cellinje, väl etablerade "rullar" som uttrycker nyckelböljande ligander, såsom PSGL-1 och sLex, vilka tillsammans fungerar som motpartsligander för P-och E-sel 15,26. I samband med tidigare rapporter, HL60 celler faktiskt uppvisade en robust rullande beteende på P-och E-sel-belagd mikroflödessystem kanaler, med långsamma rullande hastigheter på 1-12 nm / sek 14,17-19. HL-60-celler inte rulla på fibronektin yta, i linje med tidigare rapporter som visar att odifferentierade HL-60 celler inte uppvisar självhäftande interaktioner med fibronektin 16. Utformningen av den flerbrunnsplatta mikrofluidsystem, vilket tillåter upp till 10 till 12 analyser / timme jämfört med endast 1-2 analyser / timme, som kan testas med användning PPFCs, signifikant ökar genomströmningen genom att åtminstone 5 gånger. Dessutom PPFCs måste sättas ihop och tvättas före varje återanvändning, ytterligare bromsa prestanda takt. Dessutom möjliggör den lätt reglerat flöde snabb prestanda av de skjuv-beroende experiment, som sedan lätt kan analyseras via lämplig mjukvara.
Vi testade nästa denna multi-brunnar systemet genom att analysera samspelet mellan HL-60 celler och EC beläggning mikroflödeskanalen. EC är kända för att uttrycka P-och E-sel under den inflammatoriska processen 5. Att ge EC med en inflammatorisk stimulans, förbehandlades vi dem med TNF-α. Medan E-sel uppreglerades, P-sel var inte i överensstämmelse med litteraturen som visar att humant EC uttrycker E-sel, men inte P-sel, som svar på TNF-α-aktivering eftersom primat P-sel promotom saknar TNF -α-responselement, resulting i transkriptionell induktion av endast E-sel 20,21. Inflammatoriska tillstånd sedan simuleras inuti kanalen genom inkubation EG monolager med TNF-α, följt av perfusion av HL-60 celler för att undersöka dess växelverkan med EG-ytan. Även HL-60 inte interagera med icke aktiverade EC, gjorde de visar en robust rullande respons på TNF-α-aktiverad EC (figur 3C), korrelerade med deras redovisade svar i litteraturen 22. Ab blockerande experiment (figur 4A) sedan visade att E-sel, men inte P-sel, blockering resulterade i en signifikant minskning av HL-60 rullar på aktiverad EC. Dessa data visar direkt medverkan av E-sel, och inte P-sel, i att medla rullning av HL-60 på TNF-α-aktiverade humana EC 20,21. Den Ab blockerande experiment, omvänt visar E-sel-medierad rullning på aktiverad EC vs P-sel-medierad rullar på CHO-P, validerar genomförbarheten och relevansen av Ab Blocki vidareng experiment snabbt utförs i denna mikroflödessystem. Intressant nog var denna hämning av rullande inte fullständig (cirka 70% minskning) vilket tyder på att andra ytreceptorer, såsom VCAM-1, också delta i HL-60 rullar på aktiverad EC 27. Spår stig analys visade vidare en annan intressant fenomen - medan rullning av HL-60 på blockerad aktiverad EC var kontinuerlig och robust, blockerade det låga antalet celler som fortfarande rullade på E-sel aktiverad EC visade en splittrad rullbana på den blockerade EC ( Figur 4B). Detta fenomen observerades inte i EC inkuberas med P-sel blockering eller isotypkontroll (data visas ej). Detta visar tydligt att medan en rullande respons är möjlig via andra markörer när EG E-sel är blockerad, bygger denna rullande på svaga, delvis HL-60-EC interaktioner, stödjer bara en lös, partiell rullande svar med den aktiverade EC 5,22 ,27-29. Detta stöds av data som visas i figur 4C 30-33, och förbättra genomströmningen av mikrofluidik via flera brunnar systemet platta presenteras här, ytterligare belyser potentialen i denna teknik för effektiv och noggrann analys av viktiga rullande egenskaper mot förbättrade terapeutiska tillämpningar .
Denna studie fokuserar på granskning av HL-60 cell rullar på proteinsubstrat och cellmonolager i fysiologiskt relevanta och noggrant kontrollerad skjuvflöde använderen platta med flera brunnar mikroflödessystem. På liknande sätt kan andra celltyper och andra substrat /-cellmonoskikt med lätthet användas för att studera sina löpande egenskaper. Användarvänlighet och enkel analys möjliggör en exakt analys av viktiga rullande egenskaper och Ab blockering eller aktivering med olika tillväxtfaktorer eller hämmare kan användas för att undersöka eventuella inblandning av molekylära markörer i valssvar. Detta kan vara särskilt användbart mot att studera stamceller rullande och målsökande, som kan vara konstruerad för att förbättra stamcellsbaserad terapi 34-36. Viktigt kan flera villkor testas med förbättrad genomströmning (5-10 gånger högre jämfört PPFCs), behövs för en snabb och effektiv undersökning av rullande egenskaper på grund av plattans design. Andra analyser som är relevanta för cellmålsökande, såsom celladhesion, kemotaxi och transmigration kan också studeras med hjälp av detta system 1,10,13. Sammantaget framträder denna mikroflödessystem som en kraftfull teknik för att studera cell rullande och should fungera som ett användbart verktyg för att hjälpa till i den kliniska översättningen av exogena cellbaserad terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
CHO-P-celler var en slags gåva från Dr Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Detta arbete stöddes av National Institute of Health bidrag HL095722 till JMK Detta arbete stöddes också delvis av en Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award till JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A.
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W.
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A.
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al.
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
