Summary
Denne undersøgelse bruges en multi-brønds plade microfluidic system markant stigende gennemløb celle rullende studier under fysiologisk relevant shear flow. I betragtning af betydningen af celle rullende i multi-step celle målsøgende kaskade og betydningen af celle målsøgende efter systemisk levering af udefra kommende populationer af celler i patienter, giver dette system potentiale som en screening platform til at forbedre celle-baseret behandling.
Abstract
En stor udfordring for celle-baseret behandling er den manglende evne til systemisk målrette en stor mængde af levedygtige celler med høj effektivitet til væv af interesse efter intravenøs eller intraarteriel infusion. Derfor øger celle målsøgende øjeblikket undersøgt som en strategi til forbedring celleterapi. Cell rullende på det vaskulære endotel er et vigtigt skridt i processen med celle målsøgende og kan probes in vitro ved hjælp af en parallel plade flow kammer (PPFC). Men dette er en ekstremt trættende, lav throughput assay med dårligt kontrollerede strømningsbetingelser. I stedet brugte vi en multi-brønds plade mikrofluid system, der muliggør undersøgelse af cellulær rullende ejendomme i et højere gennemløb under præcist styret, fysiologisk relevant forskydningsstrømningen 1,2. I dette papir viser vi, hvordan det rullende egenskaber HL-60 (human promyelocytisk leukæmi) celler på P-og E-selectin overflader samt på cellemonolag overflader kan være readily undersøgt. For bedre at simulere betændelsestilstande blev mikrofluid kanal overflade overtrukket med endothelceller (ECS), som derefter blev aktiveret med tumornekrosefaktor-α (TNF-α) stiger betydeligt interaktion med HL-60-celler under dynamiske forhold. Den forbedrede gennemløb og integreret multi-parameter softwareanalyse platform, der tillader hurtig analyse af parametre såsom rullende hastigheder og rullende vej, er vigtige fordele for vurdering celle rullende egenskaber in vitro. Muliggør en hurtig og præcis analyse af tekniske tiltag har til formål at påvirke celle rullende og målsøgende, kan denne platform hjælpe forhånd eksogene celle-baseret behandling.
Introduction
En af de store udfordringer i den vellykkede kliniske oversættelse af celle-baseret behandling er ineffektiv levering eller målretning af systemisk tilført celler til ønskede steder 3,4. Der er derfor en konstant søgen efter metoder til at forbedre celle målsøgende, og specifikt celle valsning, som en strategi til at forbedre celleterapi. Cell rullende på blodkarrene er et vigtigt skridt i cellen homing kaskade, klassisk defineret for leukocytter, der er rekrutteret til sygdomssteder 5. Dette trin er underlagt specifikke interaktioner mellem endotel selectiner, dvs P-og E-selectin (P-og E-sel), og deres modparter ligander på overfladen af leukocytter 5,6. Bedre forståelse og forbedret effektivitet i celle målsøgende, og specifikt rullende trin, er af stor betydning i jagten på nye platforme for at forbedre celle-baseret behandling. Hidtil er dette opnået ved hjælp af parallelle plade strømningskamre (PPFCs), omfatter to flade plates med en pakning mellem dem, med en tilgang og afgang port placeret på den øverste plade, hvorigennem en celle suspension perfuseres ved hjælp af en sprøjte pumpe 7,8 9. Overfladen af bundpladen kan overtrækkes med en relevant cellemonolaget / substrater og samspillet mellem perfunderede celler og overfladen under forskydningsstrømningen derefter udforsket 7. Men PPFC er en lille produktion, reagens-forbrugende og temmelig kedelig metode, med dannelse af bobler, lækage og dårligt kontrolleret flow præsentere store ulemper.
En alternativ teknik til den traditionelle PPFC er en multi-brønds plade mikrofluid system tillader højere gennemløb ydeevne cellulære assays (op til 10 gange højere end PPFCs) under nøjagtig computerstyrede forskydningsstrømningen med lavt reagensforbrug 1,10. Cell rullende eksperimenter udføres inde i mikrofluidkanaler, som kan overtrækkes med cellemonolag eller kunstigt underlag og afbildes USIng af et mikroskop med rullende egenskaber let analyseres under anvendelse af en egnet software. I denne undersøgelse, vi demonstrere mulighederne for denne multi-brønds plade mikrofluid system, ved at studere de rullende egenskaber af menneskelig promyelocytic leukæmi (HL-60) celler på forskellige overflader. HL-60 ruller på substrater som P-og E-sel, samt på cellemonolag, der udtrykker forskellige rullende receptorer, blev analyseret. Desuden blokering antistof (Ab) blev anvendt til at påvise direkte inddragelse af specifikke selectiner i mediering af rullende bevægelse af HL-60 på disse overflader. Rolling eksperimenter blev udført med øget gennemløb, under stabil shear flow, med minimal reagensforbrug / celle, så en effektiv analyse af de vigtigste rullende parametre såsom rullende hastighed, antal rullende celler, og rullende sti egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Celledyrkning
- Menneskelige promyelocytic leukæmi (HL-60) celler
- Kultur HL-60-celler i 75 cm2 kolber med 15 ml Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) suppleret med 20% (v / v) kalvefosterserum (FBS), 1% (v / v) L-glutamin og 1 % (v / v) penicillin-streptomycin.
- Skift medier hver 3 dage ved at aspirere halvdelen af cellesuspension volumen og erstatte det med komplet IMDM medier.
- For carboxyfluorescein-diacetat, succinimidyl ester (CFSE) farvning centrifuge HL-60 cellesuspension (400 xg 5 min), resuspender i en 1 uM CFSE opløsning (fremstillet i forvarmet PBS) og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C. Centrifugeres celler, aspireres supernatanten og resuspender cellerne i frisk forvarmet medium i 30 min. Vask cellerne i PBS og derefter bruge for rullende eksperimenter (se figur 1B for repræsentativt billede af CFSE-farvede HL-60 celler på P-sel-coatede overflade).
- Lung mikrovaskulære endotelceller (LMVECs)
- Coat 100 mm petriskåle med 0,1% gelatine-opløsning (v / v i PBS) og inkuberes ved 37 ° C i mindst 30 minutter.
- Kultur LMVECs på gelatineovertrukne 100 mm petriskåle i fuldstændig endotel vækstmedium (endotel basalt medium-2 (EBM-2)), suppleret med en specifik væksthastighed supplement kit, se REAGENSER). Skift medier hver anden dag og sub-kultur celler efter at have nået 80-90% konfluens.
- For sub-kultur vaskes cellerne med PBS og derefter løsne cellerne med 4 ml 1x trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C og neutraliseres i et lige volumen af komplet EBM-2-medier. Overfør cellesuspension til et 15 ml rør og centrifuge (400 xg 5 min). Efter centrifugering pellet resuspenderes i 1 ml komplet endotel medier og tælle celler med et hæmocytometer. Må ikke over-passage cellerne, da dette påvirker deres morfologi og funktion brug kun celler under passage 7 for alle eksperimenter.
- Kinesisk hamsterovarie-P-selectin (CHO-P) Celler
- CHO-P-celler, som er CHO celler stabilt transficeret til at udtrykke menneskelige P-sel, blev leveret af samarbejdspartnere (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12.
- Kultur CHO-P-celler i T175 cm 2 kolber i 25 ml F-12 medier.
- For passaging vaskes cellerne med 10 ml PBS i 4-5 sek og derefter Trypsinisér i 10 ml 1x trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af neutralisering i fuld medier.
- Centrifugeres cellesuspensionen (400 xg 5 min), forsigtigt aspireres supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml komplette medier og tæl cellerne medet hæmocytometer.
2. Betjening af den integrerede multi-brønds plade Mikrofluid System
- Sørg for alt udstyr er korrekt tilsluttet og tænde de forskellige moduler: computer, controller, omvendt mikroskop, og CCD-kamera.
- Åbn imaging software, og sørg for multi-brønds plade modul og billedbehandling modulet er korrekt præsenteret på skærmen.
- Forbind rørene til dampfaelden (tilsluttet til controller), og også forbinde dem til Pressure Interface.
- Placer multi-brønds plade i pladevarmeelementet / adapter. Tilføj reagenser brønde (beskrevet nedenfor) og vedhæfte interface på toppen af pladen. Placer plade til billeddannelse på automatiseret scene.
- Interfacet tillægger toppen af pladen og anvender en pneumatisk tryk fra regulatoren til toppen af brøndene, kørsel væsken gennem mikrofluidkanaler på defineret strømningshastighed, let styres ved hjælp af multi-brønds plademodul skærmen under manuel tilstand.
- Reagenser i kanalen flowet over en observation område, beliggende mellem brøndene. Mikrofluid kanal dimensioner er 350 mM bred x 70 mM høj. Længden af den lineære kanal er 1 mm, og i bunden af kanalerne omfatter et 180 um dækglas glas, som er foreneligt med lysfelt, fase, fluorescens og konfokal mikroskopi.
- Anskaf videoer via en CCD-kamera (stream erhvervelse, 11 billeder / sek) og analysere via kompatibel software.
3. Overfladebehandling af mikrofluidkanaler med proteinsubstrat eller cellemonolag
- Coating mikrofluid kanal med fibronectin eller P-/E-selectin
- Forbered 1 ml 20 ug / ml fibronectin i PBS. Alter volumen baseret på antallet af kanaler, der skal overtrækkes (brug 25-50 ul fibronectins pr. kanal).
- Læg 25-50 ul af fibronectin opløsning til hver indløb godt. Anvend forskydningskraft 2 dyn / cm 2i 5 minutter for at perfundere kanal. Bemærk perlen af væske vises i stikkontakten godt. Inkuber i 30-45 minutter ved stuetemperatur
- Aspirer løsningen fra brønde (ikke aspireres direkte fra midten cirkel, der fodrer kanal) 1,13. Tilføj 200-500 pi PBS i stikkontakten godt og vaske kanal med PBS ved anvendelse forskydningsstrømningen 2 dyn / cm 2 i 5 min. Kanalen er nu korrekt overtrukket med fibronectin og klar til at blive brugt.
- At belægge med P-eller E-sel, forberede en opløsning af det ønskede humant rekombinant protein i PBS 5 ug / ml og overtrække kanaler som beskrevet ovenfor, med 1 times inkubation ved 37 ° C for at tillade overfladebelægning.
- Oprettelse af CHO-P eller LMVEC monolag inde mikrofluid kanal
- Forsigtigt Trypsinisér cellerne fra dyrkningsskåle i 3 minutter, quench anvendelse af en 2-folds volumen af fuldstændige medier og centrifugeres (5 minutter ved 400 xg). Resuspender cellerne med 10 ml fuld medier og centrifugeres (5 min ved 400 xg) again.
- Tæl cellerne for at bestemme cellekoncentration i suspensionen. For at sikre dannelsen af en sammenflydende LMVEC monolag inde i kanalen, bringe cellekoncentrationen til 15-20 million celler / ml. For en sammenflydende CHO-P cellemonolag bruge 50-60.000.000 celler / ml. Brug 25-50 ul cellesuspension for hver kanal - bestemme indledende celle nummer, der bruges til eksperimentet i overensstemmelse hermed.
- Læg 25-50 pi cellesuspension i den passende koncentration til indløbet godt. Pladen anbringes på mikroskopet scenen og introducere celler i kanalen (2 dyn / cm 2), indtil cellerne er observeret på skærmen fylder hele kanaler, og derefter standse strømmen.
- Fyld både stikkontakt og indløb med 200 pi enten fuld LMVEC eller CHO medier. Lad cellerne sætte sig og holde sig i 3 timer i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2).
- Efter 3 timer inkubation vaskes kanalen med fuld medier (2 dyn / cm 2, 10-15 min) for at fjerne løstliggendeceller. Cellerne bør nu blive vist helt sammenflydende og kanalen er nu klar til brug. Afhængig indledende celle podningstæthed kan yderligere 2-3 hr for at afregne tid være forpligtet til at sikre fuldstændig dækning af overfladen med cellerne.
4.. LMVEC Pro-inflammatorisk Aktivering og antistof, der blokerer for P-/E-selectin
- Forbered en TNF-α-opløsning (10 ng / ml) i LMVEC basale medier.
- For at inducere inflammatorisk aktivering af LMVEC i kanalerne, tilsættes 100 ul af TNF-α løsning til indløbet godt og indføre opløsningen ind i kanalen ved anvendelse forskydningsstrømningen 2 dyn / cm 2 i 5 min. For styrekanalerne (ikke-aktiverede EC'er), tilsættes 100 ul LMVEC basale medier til fjorden godt og indføre i kanalen (2 dyn / cm 2 for 5 min). Kanal er nu klar til en rullende assay.
- Hvis du vil blokere P-sel og E-sel på LMVECs og CHO-P-celler, indfører neutraliserende P-sel (klon AK4, 5 mg / ml i basal medier) eller E-sel (klon P2H3, 5 ug / ml i basale medier) antistoffer ind i kanalen, og der inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Dernæst vaskes kanaler med basal medier (2 dyn / cm 2 for 5 min). Kanaler er nu klar til en rullende assay.
5.. HL-60 Rolling analysen på Underlag / cellemonolag-Coated mikrofluidkanaler
- Nøje undersøge de kanaler under mikroskop for at bekræfte, at kanalerne er korrekt belagt (i tilfælde af belægningen med celler, skal overholdes fuldt sammenflydende cellemonolag).
- At forberede HL-60 celle suspension til de rullende eksperimenter, centrifuge HL-60 celle suspension (5 min ved 400 xg) og vaskes en gang med basale medier. Tæl celler og resuspender i IMDM (basale medier, der indeholder Ca2 + og Mg2 +) for at skabe et HL-60 cellesuspension med 5 millioner celler / ml. Brug 25-50 pi cellesuspension for hver kanal til at udføre det rullende assay.
- Læg 25-50 ul af cellen suspension til udløb godt, sted plade inde temperatur-kontrollerede plade holderen (37 ° C) og sted på mikroskop scenen. Dernæst introducere celler i kanalen ved at anvende forskydningskraft på 2 dyn / cm 2 (celler skal overholdes inden for 10-15 sek flyder fra stikkontakten til indløbet).
- For at undersøge rullende reaktion som en funktion af shear stress, reducere forskydning til 0,25 dyn / cm 2 og erhverve 20-30 sek videoer (ved hjælp af "stream erhvervelse"-funktion) i hver ønsket forskydning (øge shear gradvist fra 0,25 op til 5 dyn / cm2. Det er også muligt at anvende højere saks).
- Anskaf videoer via en CCD-kamera (stream erhvervelse, 11 billeder / sek) og analysere rullende stier og rullende hastigheder via kompatibel software.
6.. Flowcytometri Detect udtryk for overflademolekyler
- Efter trypsinisering, forberede en celle suspension (ved hjælp af 1-2 x 10 5 celler / prøve) af den ønskede celletype (HL-60, CHO-P eller LMVECs) i PBS (- / -), suppleret med 2% FBS. Vask cellerne to gange og bringe prøvevolumen til 50 ul (med samme buffer).
- Inkuberes hver prøve med den ønskede fluoroforen-konjugerede Ab (se vedlagte skema for detaljeret information) ved 4 ° C i 20 min (dække med alufolie).
- Vask cellerne to gange (samme buffer) og bringe endelige rumfang af farvede celle suspension til 200 ul. Analysere prøver ved hjælp af et flowcytometer til påvisning af ekspression af overflademolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HL-60-celler rulle på P-og E-selectin overflader, men ikke på fibronektin
HL-60-celler anses gold standard "ruller", som de udtrykker en bred vifte af målsøgende ligander, herunder de rullende ligander P-sel glycoproteinligand-1 (PSGL-1) og sialyl-Lewis X (SLeX) 5,14 (figur 1A ). Overfladeproteinet PSGL-1 virker som et stillads for tetra-saccharid SLeX, mæglende specifik interaktion med P-og E-sel, der er opreguleret på endotel under inflammation 5,6,15. For at teste mulighederne i den multi-brønds plade microfluidic systemet blev adskillige mikrofluidkanaler belagt samtidig med forskellige substrater og rullende interaktioner af HL-60-celler med de overflader blev analyseret. HL-60-celler udviste en robust rullende adfærd på P-sel-overflade, med celler først indfanget fra strømning, efterfulgt af et særskilt rullende bevægelse. Som vist i figur 1C, og bestårent med litteratur, HL-60-celler udviser en lignende rullende adfærd på E-sel overflader, endnu ikke på fibronectincoatede substrater 14,16-19. Cell hastighed, analyseres via kompatibel software blev plottet mod shear stress, viser en robust rullende respons af celler på P-og E-sel med en gennemsnitlig hastighed mellem 1-12 mM / sek.
HL-60-celler rulle på CHO-P enkeltlags belægning mikrofluid kanal
Dernæst vi havde til formål at vurdere muligheden for at bruge denne mikrofluid systemet effektivt at teste samspillet mellem celler af interesse og et cellemonolag belægning overfladen. At undersøge interaktionen af HL-60-celler med cellemonolag, der udtrykker rullende markører brugte vi CHO-P-celler, der er transficeret til stabilt at udtrykke P-, men ikke E-, SEL (figur 2A. Se også figur 2B for repræsentativ billede af HL-60-celler på CHO-P monolag belægning mikrofluid kanal) 11,12. HL-60-celler viste en stærk rullende respons på CHO-P-celler (figur 2C). For at teste, om denne rullende bevægelse faktisk medieres af P-sel blev CHO-P monolag præinkuberes med blokerende antistoffer til enten P-eller E-sel, før perfusion af HL-60-celler ind i kanalen. Som vist i figur 2C, blokerer CHO-P monolag med en P-sel Ab resulterede i et signifikant fald i antallet af rullende HL-60-celler på overfladen, hvilket viser, at P-sel faktisk medierer HL-60-valsning som tidligere beskrevet 14,18. Udførelse af analysen i en mikrofluid kanal tillader hurtig screening af forskellige forhold og effektiv blokering af receptorerne ved hjælp af kun små mængder, så lidt som 25 ul. Isotypekontrol eller Ab blokerende E-sel (som ikke udtrykkes på CHO-P-celler) ikke påvirke antallet af rullende celler på CHO-P-celler, hvilket viser styrken af denne analyse i præcist pin-peger direkte inddragelse af specifik overflade markører i cellulære rullende interaktioner.
Valsning af HL-60-celler på TNF-a-aktiverede LMVECs medieres af E-selectin
Endothelceller er kendt for at opregulere vedhæftningsoverflade markører, såsom P-og E-sel under inflammation, bistå i rekruttering af leukocytter til steder med inflammation 5,6. Men mens murint EC'er udtrykker både P-og E-sel som reaktion på inflammatoriske stimuli, såsom interleukin-1 (IL-1) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), kun et menneske EC'er udtrykke E-sel som reaktion på disse cytokiner 20,21. Dette blev bekræftet i vores flowcytometri assay viser ekspression af E-sel, men ikke P-sel på lunge mikrovaskulære endotelceller (LMVEC) som respons på TNF-α stimulering (figur 3A). Den multi-godt mikrofluid plade består af mange separate mikrofluidkanaler, så højere gennemløb afprøvning af flere forskellige forhold. Vi brugte dette fordelagtig designtil plade LMVECs inde i mikrofluidkanaler (figur 3B) til hurtigt analysere interaktioner af HL-60-celler med EC'er under flere betingelser. For at simulere inflammatoriske indstillinger blev LMVECs forbehandlet med det pro-inflammatoriske cytokin TNF-α. Interessant, har HL-60-celler interagerer ikke med un-aktiverede LMVECs, og cellerne blev ikke observeret at rulle på denne flade. Tværtimod, HL-60-celler viste en stærk rullende adfærd på TNF-α-aktiverede LMVECs med en gennemsnitlig hastighed på 5-15 mM / sek (figur 3C).
Vi derefter havde til formål at udforske inddragelse af P-sel eller E-sel i den rullende samspil mellem HL-60 celler og aktiverede LMVECs. Til dette blev TNF-α-aktiverede EC'er præinkuberet med P-sel eller E-sel blokerende antistoffer og rulning af HL-60-celler blev analyseret. Som vist i figur 4A, blokering E-sel, som var opreguleret på TNF-α-aktiverede LMVECs resulterede i et væsentligtant fald i antallet af rullende celler på den aktiverede endotelmonolaget. I modsætning hertil har ved hjælp af en isotypekontrol eller Ab mod P-sel, som ikke blev udtrykt på aktiverede ECS ikke har en signifikant effekt på HL-60 rullende på det aktiverede endotel lag. Disse data viser den direkte inddragelse af E-sel i HL-60 rullende på TNF-α-aktiverede ECS i overensstemmelse med tidligere rapporter 20,21. Fra de erhvervede videoer analyse software tillader én at spore stier af individuelle celler interagerer med substratet. Vi brugte denne evne til specifikt at spore stien af de enkelte celler, der kommunikerede med TNF-α-aktiverede EC'er w / wo E-sel blokering. Som vist i figur 4B, antallet af rullende celler på ublokerede aktiverede LMVECs var væsentligt højere end på E-sel-blokerede aktiveret EC'er. Endvidere viste det sig, at den rullende bevægelse af HL-60 på ublokerede LMVECs er kontinuerlig og robust, mens de rullende stier cellerpå E-sel-blokerede EC'er blev fragmenteret (hver farve repræsenterer en anden celle, se for eksempel celler AF vs gl i figur 4B). I tråd med dette fund, den rullende hastighed af HL-60 celler på blokeringen TNF-α-aktiverede ECs var betydeligt lavere end deres rullende hastighed på E-sel-blokeret EC'er (figur 4C).
Figur 1. HL-60-celler rulle på P-og E-selectin overflader. (A) HL-60 celler udtrykker de rullende ligander PSGL-1 og SLeX (Iso ctr - isotypekontrol, ingen Ab - intet antistof). (B) Repræsentant snap-shot image CFSE-farvede HL-60 celler på P-sel -coatede overflade under flow. (C) HL-60-celler robust rulle på P-og E-sel overflader, men ikke på fibronectin-coatede overflade. Rolling hastighed er plottet mod forskydningsspænding (n = 10-15 celler pr datapunkt blev hastigheder analyseret af kompatibel software). Klik her for at se større figur .
Figur 2. HL-60 ruller på CHO-P cellemonolaget direkte medieret af P-sel. (A) CHO-P-celler udtrykker P-sel, men ikke E-sel. (B) repræsentant billede af HL-60-celler på CHO-P monolag overtrække overfladen af mikrofluid kanal (10X forstørrelse). (C) HL -60 celle rullende på CHO-P monolag direkte medieret af P-sel som påvist ved Ab blokeringsassay (blokeringen - CHO-P monolaget ikke inkuberet med et antistof, isotype ctr-CHO-P monolag inkuberet med isotypekontrol * p <0,05, envejs-ANOVA blev anvendt med Tukeys HSD post hoc test, repræsenterer fejlsøjlerSEM, n = 3.
Figur 3. HL-60-celler rulle på TNF-α-aktiverede LMVECs. (A) TNF-α aktivering af LMVECs fremkalde overflade udtryk for E-sel, men ikke P-sel. (B) Repræsentant billede af sammenflydende LMVEC monolag i to mikrofluidkanaler (4x forstørrelse). (C) HL-60-cellerne udviser en robust rullende respons på TNF-α-aktiverede LMVECs, men ikke på un-aktiverede LMVECs. Iso ctr - isotypekontrol, unact ECs - ikke-aktiverede endothelceller, TNF-α-act ECs -. TNF-α-aktiverede endotelceller Klik her for at se større figur .
< br /> Figur 4.. HL-60 rullende på TNF-α-aktiverede LMVECs medieres af E-selectin. (A) HL-60-rullende på TNF-α-aktiverede LMVECs medieres via E-sel, snarere end P-sel, som påvist af Ab blokering assay (isotype ctr-EF-monolag inkuberet med en isotype kontrol * p <0,05, envejs-ANOVA blev anvendt med Tukeys HSD post hoc test, repræsenterer fejlsøjler SEM, n = 3) (B) Cell sti Analysen afslører kontinuerlig. og robust rulning af HL-60-celler på ublokerede aktiverede EC'er forhold til fragmenteret, svag rullende observeret på E-sel-blokerede aktiveret EC'er (hver farve repræsenterer en anden celle. Analyse blev udført via passende software). (C) HL-60-rullende hastighed på TNF-α-aktiverede ECS langsommere på ublokerede aktiverede ECs i forhold til E-sel-blokeret aktiveret EC'er (Shear stress anvendes:. 2 dyn / cm 2 * p <0,05, uparrede tosidige t-test, fejlsøjler repræsenterer SEM, n = 17 til 36 celler pr gruppe).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En af de store udfordringer i en vellykket oversættelse af eksogen celle-baseret behandling er den manglende evne til effektivt at levere celler til steder med skader og betændelse med høj transplantation effektivitet 3.. Cell rullende repræsenterer et afgørende skridt i processen med celle homing lette deceleration af celler på væggene i blodkarrene, i sidste ende fører til deres faste adhæsion og transmigration gennem endotelet ind i vævet 5.. Bedre forståelse af den rullende proces til kandidat celletyper kan føre til udvikling af teknikker til at øge celle målsøgende og bidrage væsentligt til at forbedre celle-baseret behandling.
PPFC er et udbredt redskab til at udforske celle valsning, såvel som andre cellulære adfærd under forskydning flow. Anvendelsen af PPFC for behandlingen neutrofiladhæsion på endotel blev først undersøgt af Lawrence et al. I 1987, og siden da kommercielt tilgængelige produktionts er blevet udviklet 8,9. PPFCs består af to flade plader adskilt af en pakning, der styrer dimensionerne af kammeret 7. Den øvre plade indeholder en tilgang og afgang port, som ved hjælp af en sprøjtepumpe muliggør perfusion af cellesuspensionen gennem kammeret 7,8. Der er også en ekstra port, der anvender undertryk (vakuum) for at holde pladerne presses sammen 7. Selv parallelle plade strømningskamre realiteten er blevet udnyttet til at undersøge cellulære responser, herunder celle rullende under shear strømningsforhold, der er mange begrænsninger, som mindsker dens effektivitet. En væsentlig begrænsning af strømningskamre er det høje antal af celler og store mængder af reagenser, der er nødvendige på grund af den store døde volumen i flowsystemet 7. Et andet kritisk punkt er tilstedeværelsen af luftbobler, som nemt kan opstå under flow kammerkonstruktionen potentielt hæmmer cellemonolaget og substratbelægning på bundpladen 22. Imidlertid har yderligere ændringer er foretaget traditionelle PPCFs at indarbejde en ekstra port på den øverste plade til at fungere som en boble fælde at lette fjernelse af luftbobler 23. Opsætning af PPFC eksperimentet er også kedeligt, og strømmen celle er modtagelige for lækage, hvis pakningen er beskadiget eller ikke samles omhyggeligt. Endelig er der en forskel mellem den ønskede og eksperimentelt anvendte forskydningshastigheder, hvilket resulterer i et snævert interval af ensartede strømningshastigheder. Ved teoretisk sammenligne fire PPFCs med varierende og afgangssiden positioner, blev det konstateret, at to af de konfigurationer modelleret forskydningshastigheder, der afveg fra de beregnede shear satser med op til 75% 24. For at genbruge den samme kammer kræver tidskrævende vaske trin, og kombineret med de ovenfor beskrevne udfordringer, det gør PPFCs temmelig kedelig og lave gennemløb.
I vores undersøgelse har vi brugt en fuldt integreret multi-godt psent microfluidic systemet, bygger på nøjagtigt styret forskydningsstrømningen 1,2,13. Dette 48 godt mikrofluid plade indeholder 24 mikrofluidkanaler, med hvert par af tilstødende brønde er forbundet med en mikrofluid kanal 1,25. 10-12 rullende analyser kan udføres i 1 time, som muliggør en hurtig screening af flere dusin forhold i en enkelt dag. De mikrofluidkanaler kan let belagt med et protein substrat eller cellemonolagene, og samspillet mellem celler af interesse og overfladen kan filmede hjælp af et mikroskop, erhvervet af en CCD-kamera og analyseret af kompatibel software. Vigtige parametre såsom celle kvantificering, beregning af rullende hastighed og bestemt spor sti analyse kan nemt fås til effektivt at analysere rullende adfærd på flere substrater 13. I denne undersøgelse vurderede vi effektiviteten af dette system i at studere celle rullende ved hjælp af HL-60 promyelocytisk leukæmi cellelinje, veletablerede "ruller", der udtrykker nøglerullende ligander, såsom PSGL-1 og SLeX, der sammen fungerer som counterpart ligander for P-og E-sel 15,26. I sammenhæng med de tidligere rapporter, ja HL60-celler udviste en robust rullende adfærd på P-og E-sel-belagt mikrofluidkanaler, med langsomme rullende hastigheder på 1-12 mM / sek 14,17-19. HL-60-celler ikke roll på fibronektin overflade, i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at udifferentierede HL-60-celler ikke udviser klæbende interaktioner med fibronektin 16. Udformningen af multi-brønds plade mikrofluid system tillader op til 10-12 assays / time i forhold til kun 1-2 assays / time, som kan afprøves ved hjælp af PPFCs, øger kapaciteten med mindst 5 gange. Desuden skal samles og vaskes, før hver genbrug, yderligere bremse ydeevne sats PPFCs. Desuden let styret strømning muliggør hurtig udførelse af forskydnings-afhængige eksperimenter, som derefter kan let analyseres via passende software.
Vi næste testet denne multi-brønds plade ved at analysere interaktioner mellem HL-60-celler og EC'er belægning mikrofluid kanal. ECS kendt for at udtrykke P-og E-sel under den inflammatoriske proces 5.. At give EC'er med en inflammatorisk stimulus, vi forbehandlet dem med TNF-α. Mens E-sel var opreguleret P-sel ikke var i overensstemmelse med litteraturen viser, at humant EC'er udtrykker E-sel, men ikke P-sel, som reaktion på TNF-α aktivering siden primat P-sel promotoren mangler TNF -α-responselementer, resulting i transkriptionel induktion kun E-sel 20,21. Inflammatoriske tilstande blev derefter simuleret inde i kanalen ved at inkubere EF monolag med TNF-α, efterfulgt af perfusion af HL-60-celler til at undersøge dets interaktioner med EF overflade. Mens HL-60 ikke interagere med uaktiveret ECS gjorde de vise en robust rullende respons på TNF-α-aktiverede EC'er (figur 3C), korreleret med deres rapporteret svar i litteraturen 22. Ab blokerende eksperimenter (figur 4A) viste derefter, at E-sel, men ikke P-sel, blokering resulterede i en betydelig reduktion i HL-60 rullende på aktiveret ECS. Disse data viser den direkte inddragelse af E-sel, og ikke P-sel, i formidlingen rulning af HL-60 på TNF-α-aktiveret human ECs 20,21. Ab blokerende eksperimenter omvendt viser E-sel-medieret rullende på aktiveret EC'er vs P-sel-medieret rullende på CHO-P, validerer gennemførlighed og relevans af Ab Blocki yderligereng eksperimenter hurtigt udføres i denne mikrofluidisk system. Interessant nok inhibering af rullende ikke var fuldstændig (ca. 70% reduktion), tyder på, at andre overflade receptorer, såsom VCAM-1, også deltage i HL-60-rullende på aktiveret EC'er 27. Track sti analyse afslørede en anden interessant fænomen - mens rulning af HL-60 på blokeringen aktiveret ECs var kontinuerlig og robust, blokerede det lave antal celler, der stadig rullet på E-sel aktiveret ECs vises en fragmenteret rullende sti på den blokerede EC'er ( Figur 4B). Dette fænomen blev ikke observeret i ECs inkuberet med P-sel blokering eller isotypekontrol (data ikke vist). Dette tyder stærkt på, at mens en rullende reaktion er mulig via andre markører, når EF-E-sel er blokeret, dette rullende afhængig svage, partielle HL-60-EC interaktioner understøtter kun en løs, delvis rullende respons med den aktiverede ECs 5,22 ,27-29. Dette understøttes af data vist i figur 4C 30-33, og forbedre gennemløb microfluidics via multi-brønds plade system, der præsenteres her, understreger yderligere potentialet i denne teknologi til effektiv og præcis analyse af de vigtigste rullende egenskaber til forbedret terapeutiske anvendelser .
Denne undersøgelse fokuserede på undersøgelse af HL-60 celle rullende på proteinsubstrater og cellemonolag under fysiologisk relevant og nøjagtigt styret forskydningsstrømningen hjælpen multi-brønds plade mikrofluid system. Tilsvarende kan andre celletyper og andre substrater / cellemonolag let anvendes til at studere deres rullende egenskaber. Brugervenlighed og enkel analyse tillader en præcis analyse af vigtige rullende egenskaber og Ab blokering eller aktivering med forskellige vækstfaktorer eller-inhibitorer kan anvendes til at undersøge potentielle inddragelse af molekylære markører i den rullende respons. Dette kan være specielt nyttigt i retning af at studere stamceller rullende og målsøgende, som kan være manipuleret til at forbedre stamcelle-baseret behandling 34-36. Vigtigere er det, kan flere betingelser testes med forbedret gennemløb (5-10 gange højere vs PPFCs), der muliggør hurtig og effektiv undersøgelse af rullende egenskaber som følge af pladeudformning. Andre analyser er relevante for celle målsøgende, såsom celle adhæsion, chemotaxis og sjælevandring kan også undersøges ved hjælp af dette system, 1,10,13. Samlet tegner dette mikrofluid system som kraftfuld teknik til at studere celle rullende og should tjene som et nyttigt redskab til at støtte i den kliniske oversættelse af eksogen celle-baseret behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
CHO-P-celler var en slags gave fra Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health tilskud HL095722 til JMK Dette arbejde blev også delvist understøttet af en Movember-Prostata Cancer Foundation Challenge Award til JMK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A.
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W.
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A.
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al.
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
