Summary
N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов модели индуцированного рака мочевого пузыря был разработан в человеческих муцина 1 (MUC1) трансгенных мышей с целью тестирования MUC1-направленной иммунотерапии. После введения MUC1-целевой пептид вакцина, цитотоксических Т-лимфоцитов ответ на MUC1 была подтверждена путем измерения сывороточного уровня цитокинов и Т-клеток специфической активности.
Abstract
Доклинических моделей инвазивного рака мочевого пузыря был разработан в человеческих муцина 1 (MUC1) трансгенных (MUC1.Tg) мышам с целью оценки иммунотерапии и / или цитотоксической химиотерапии. Чтобы вызвать рак мочевого пузыря, мышей C57BL / 6 (MUC1.Tg и дикий тип) перорально вводили канцероген N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов (OH-BBN) при 3,0 мг / сут, 5 сут / неделю в течение 12 недель. Чтобы оценить влияние OH-BBN на цитокиновый профиль сыворотки во время развития опухоли, цельная кровь собирали подчелюстной кровоточит до начала лечения и каждые четыре недели. Кроме того, MUC1-целевых вакцины пептида и плацебо вводили группам мышей в неделю в течение восьми недель. Мультиплекс флуорометрическая immunoanalyses микрошарика сывороточных цитокинов во время развития опухоли и после вакцинации проводились. При прекращении, гамма-интерферона (IFN-γ) / интерлейкина-4 (IL-4) ELISpot анализ MUC1 специфичных Т-клеточный иммунный ответ и гистопатологические оценки типа опухолии класс были выполнены. Результаты показали, что: (1) рака мочевого пузыря в обоих MUC1.Tg и мышей дикого типа составил 67%, (2) переходно-клеточных карцином (TCC), разработанная в соотношении 2:1 по сравнению с плоскоклеточного рака (SCC) , (3) воспалительные цитокины возрастает со временем, во время развития опухоли, а также (4) введение пептида вакцина вызывает Th1-поляризованного профиль сыворотки цитокинов и MUC1 специфический Т-клеточный ответ. Все опухоли в MUC1.Tg мышей были положительными на MUC1 выражения, и половина всех опухолей у MUC1.Tg и мышей дикого типа были инвазивными. В заключение, используя командный подход на основе координации усилий фармакологов, иммунологов, патологоанатомов и молекулярных биологов, мы разработали иммунной нетронутыми трансгенных мышах рака мочевого пузыря, который выражает hMUC1.
Introduction
Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенной формой рака и восьмой ведущей причиной смерти от рака среди американских мужчин. В Соединенных Штатах, по оценкам, 72 500 новых случаев заболевания и 15 000 смертей от рака мочевого пузыря, как ожидается, среди мужчин и женщин в 2013 году в сочетании 1. Рака мочевого пузыря примерно в три раза выше у мужчин, чем у женщин. В Соединенных Штатах, переходно-клеточных карцином (TCC) приходится более 90% случаев, в то время как плоскоклеточный рак (SCC) имеют частоту менее 2% 2. Общий относительный 5-летняя выживаемость для папиллярного TCC является 91,5% по сравнению с 30,9% только для SCC 2. Хотя неинвазивный папиллярный страны, предоставляющие войска составляют приблизительно 75% случаев на момент постановки диагноза, даже при лечении более чем 50% пациентов наблюдается рецидив в течение 5 лет, при этом до 30% этих больных прогрессирующей мышечной инвазивных заболеваний 3,4 . Типичные схемы лечения немышечные инвasive болезни включают трансуретральной резекции (ТУР) с последующей внутрипузырной химиотерапии. У пациентов с полноценным Та или T1 опухолей, повторите TUR может быть выполнено до химиотерапии 3,4. Для тех пациентов с низкой степени Ta рецидивов или высококачественный Та или T1 поражений, ТУР последующей адъювантной химиотерапии или иммунотерапии в виде бацилла Кальметта-Герена (BCG), можно использовать 3,4. Внутрипузырной БЦЖ было показано, что превосходит внутрипузырного C митомицин по времени для повторения 5. Для T2 мышц инвазивных заболеваний, радикальной цистэктомии с или без неоадъювантной химиотерапии является рекомендуемым Курс лечения 3. У пациентов с SCC, радикальной цистэктомии, как представляется, наиболее эффективным методом лечения 6. Учитывая очень высокий уровень рецидива, несмотря на все процедуры доступны, существует явная необходимость в новых, более эффективных методов лечения рака мочевого пузыря.
Расширение новых иммунотерапии для bladdER железы является одним из возможных подходов, что может перспективны для расширения выживаемость без признаков заболевания. Исторически сложилось так, BCG была единственным эффективным для иммунотерапии рака мочевого пузыря. Механизм его действия как полагают, включает неспецифический индукции Т-хелперов 1 (Th1) тип иммунного ответа за счет увеличения уровней интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (IFN-γ) 4. Cellular, или Th1 иммунитет, имеет решающее значение в иммунотерапии рака, как гуморальный, или Th2, иммунитет никогда не была показана эффективность против солидных опухолей, за исключением антител, направленных против рецепторов факторов роста 7. В попытке улучшить преимущества монотерапии BCG, IFN-α 2B/BCG комбинации иммунотерапии оценивали в фазе II клинического испытания с неоднозначные результаты 8. Альтернативный подход к иммунотерапии рака мочевого пузыря может быть ориентация ассоциированные с опухолью антигены (ТАА), идентификация, которая сделала иммунотерапии рака более конкретными 7
Одним из таких является ТАА муцина 1 (MUC1), которая представляет собой гликопротеин клеточной поверхности избыточно экспрессируется во многих эпителиальные клетки рака, такие как пузыря, молочной железы, легких и рака поджелудочной железы 9,10. Выражение и модификации MUC1 также существенно изменены при канцерогенезе, так что underglycosylation предоставляет антигенных последовательностей аминокислот, известных как переменное число тандемных повторов (VNTR) в центральной пептидной. В то время как MUC1 является самостоятельной молекулы, эти регионы иммунодоминантные VNTR обычно не воздействует из-за обширных гликозилирования, и таким образом они видны со стороны иммунной системы, как иностранные 11,12. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), которые специфически распознают эпитопы MUC1 были выделены из опухолей лимфатических узлах больных раком молочной железы 13, а также в крови и костном мозге больных миеломой 14,15, что делает MUC1 потенциальной мишенью клеточный иммунный ответ. Иммунодоминантные VNTRs из underglycosylateD формы MUC1 признаны ЦТЛ, в результате разрушения опухолевых клеток 16-19. Родные клеточного и / или гуморального иммунного ответа к раковым MUC1, однако, не достаточно сильны, чтобы удалить опухоль. Для увеличения уже существующих слабый иммунный ответ на MUC1, синтетические иммунодоминантном пептиды могут быть введены путем вакцинации, чтобы генерировать ЦТЛ-ответ достаточно сильным, чтобы быть клинической пользы 18,20. MUC1 липосомальной вакцины уже было показано увеличение выживаемости у больных раком легкого 21,22, генерировать ЦТЛ способны убить MUC1-позитивные клетки опухоли, и производят Th1-цитокинов поляризованные ответ 23,24. При высоком уровне MUC1 выражение 9,11,25, рак мочевого пузыря является логическим кандидатом для тестирования MUC1-направленной иммунотерапии 26,27. Кроме того, MUC1 имеет потенциал в качестве прогностического фактора при раке мочевого пузыря 28, MUC1 TCC выражение в значительной степени связано с стадии и степени, и метастатических TCCБыло показано, что по-прежнему выражают MUC1 29.
Для того чтобы оценить потенциальную полезность MUC1-направленной иммунотерапии при раке мочевого пузыря, мы разработали нетронутыми человеческой иммунной MUC1 (hMUC1) экспрессирующих трансгенных (MUC1.Tg) мышиной модели рака мочевого пузыря конгенные на C57BL / 6 фоне 30. MUC1 человека выражается в виде собственного белка под контролем своего собственного промотора, в результате чего образец ткани выражение согласуется с наблюдаемым у людей 30,31. Мыши были индуцированы с известным канцерогеном мочевой пузырь N-бутил-N-(4-гидроксибутил) нитрозаминов (OH-BBN) 32, а затем полученный опухолей оценивали по hMUC1 экспрессии и типа опухоли и класс. Для оценки влияния канцерогенов на Th1/Th2 уровни цитокинов в процессе развития опухоли, сыворотку собирали образцы периодически для мультиплексного анализа. Мышей обрабатывали MUC1-целевой пептид вакцины и сыворотки цитокинов и иммунных реакций были оценТед по мультиплекса флуорометрическая иммунологического микрошарика и ELISpot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных и эксперименты проводились в рамках протокола принятой в Университете Калифорнии в Дэвисе Институциональные уходу и использованию животных Административные Консультативного комитета.
1. MUC1.Tg разведения мыши и распространения
- UC Davis Мышь биологии программы (МВР) пород дикого типа C57BL / 6 мышей-самцов с гетерозиготной MUC1.Tg C57BL / 6 самок мышей установить нашу колонию. MUC1.Tg потомство поставляются для исследования по мере необходимости.
- MBP персонала обрезать пальцы потомство определенному шаблону (0-99) для идентификации мыши, и, когда это применимо клип хвост. Палец ноги или хвост ткань обрабатывается для генотипирования с использованием стандартного выделения ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализа.
2. Дизайн исследования
- Исследовательская группа Задания
- Взвесить каждую мышь по отдельности на баланс и записывать вес в граммах для каждой мыши.
- Эта часть процедуры инвОЛВЕС методологии и дизайна исследования. Для первой части исследования, назначить соответствующего возраста MUC1.Tg и мышей дикого типа, чтобы начать индукцию рака мочевого пузыря с OH-BBN. Эвтаназии мышей через 8 недель после последнего OH-BBN доза, чтобы подтвердить наличие опухоли мочевого пузыря по гистологии.
- Для второй части исследования, случайный мужской MUC1.Tg мыши на соответствующее число лечения и контрольных групп. Эти мыши будет контролироваться для сывороточных цитокинов и Т-клеточного иммунного ответа во время индукции и развитие опухоли, а затем в конце исследования через 8 недель после последнего OH-BBN дозы.
- Индукционные Рак мочевого пузыря
- ОН-BBN является канцерогеном и высокой токсичностью. Пожалуйста, прочитайте и следуйте рекомендациям паспорта безопасности вещества при обработке и хранении этого химического вещества.
- Вычислить дозирования концентрации раствора, необходимую для обеспечения соответствующей дозе (3 мг) в объеме 100 мкл в каждую мышь на основе среднего веса и Numbeр мышей в каждой исследования и группы.
- Развести OH-BBN в 100% этаноле. Довести до конечной концентрации 30 мг / мл стерильной водой. Конечный этанол: вода концентрация должна быть 20:80, об / об
- Администрирование OH-BBN перорально с использованием нержавеющей стали, 20 г иглы зонда в день, 5 дней / неделю в течение 12 недель, основанная на назначении лечения группы начиная с возраста 8 недель.
- Вакцинация Лечение
- Разведите каждый флакон лиофилизированной вакцины пептида в 600 мкл 0,9% стерильного физиологического раствора и тщательно ресуспендируйте рисуя раствора через 0,5 дюйма 27 G игла 6x. Использование солевой раствор, регулировать концентрацию так, что желаемый доза вводится в объеме 100 мкл.
- Начиная с 20 недели, после введения последней дозы ОН-BBN, прививку на еженедельной основе по восемь-недельного цикла путем подкожной инъекции 100 мкл с использованием иглы 25 G (номер недели соответствует возрасту мышей).
- Мониторинга и сбора проб
- Взвесить все мыши и пальпации на наличие новой опухолей один раз в неделю. Усыпить любые мышей, которые потеряли ≥ 20% от массы тела или при наличии ощутимой опухоли, кровь в моче и / или задержка мочи.
- Перед первым OH-BBN дозу и затем каждые 4 недели после этого собирают цельную кровь через подчелюстные кровотечения. Соберите в сыворотке крови свертывания труб (BD Microtainer), и позволяют 30 минут для свертывания крови.
- Центрифуга образцы крови в микроцентрифуге при 3500 х г в течение 10 мин. Тщательно передачи сыворотки, чтобы защитный колпачок криопробирок с помощью пипетки.
- Ледяная вспышка в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до дальнейшего анализа мультиплекса.
- Через восемь недель после последней дозы OH-BBN, усыпить всех мышей CO 2 удушья.
- Место каждой мыши на рассечение доску и придавить на всех четырех конечностях.
- Использование щипцов и ножниц, Массачусетске горизонтальный разрез в верхней области живота. Вставьте ножницы в разрез между эпидермальным слоем и брюшную стенку и осторожно отделить кожу от основной ткани с помощью щипцов.
- Сделать вертикальный разрез от горизонтального разреза после средней оси по направлению к переднему концу мыши. Отделить кожу от грудной клетки, и с помощью 1 мл шприц и иглы 22 G, проколов сердце и собирают кровь с гладкой и устойчивой ничьей.
- Обратитесь к шагу 2.4.3 и 2.4.4 для сыворотки изоляции и хранения.
- С помощью пинцета и ножниц, вырезать и отгибают остальной части слоя эпидермиса. Вырезать через брюшную стенку и брюшину и асептически удалить опухоль мочевого пузыря для иммуногистохимии (IHC) и вестерн-блоттинга.
- Сбор селезенки для анализа жизнеспособности клеток (Muse) и ELISpot. Для IHC, место опухоли мочевого пузыря в образце ткани кассеты и закрепить в охлажденном формалина в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день, замените формалина с 70% этанола.
- Для Вестерн-блоттинга опухоли, гомогенизировать опухоли, добавить белок экстракционного буфера плюс ингибиторы протеазы Остановка и передать 1,5 мл микроцентрифужных пробирок.
- Vortex в течение 30-60 сек и удерживайте на льду в течение 5 мин. Ледяная вспышка в жидком азоте и оттепели в окружающей воде. Повторите процесс встряхивания, замораживания и оттаивания в два раза.
- Центрифуга образцов при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и передачи клеточных экстрактов к новым помечены труб.
- Количественная оценка концентрации, выполняя бицинхониновой анализа белка кислота (BCA) на белок измерений. Магазин образцы при -80 ° С до готовности для Вестерн-блоттинга.
3. Молекулярная биология / Западная
Следующие процедуры были выполнены для проверки экспрессии MUC1 в мышиной опухоли мочевого пузыря ткани, используя стандартный протокол Вестерн-блоттинга (данные не показыватьп).
- Отделить белковые экстракты помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а затем передать на PVDF мембраны использованием полусухого аппарата.
- Блок мембранного белка передается с 5% обезжиренным молоком в 0,1% Твин-20 в фосфатном буферном растворе (PBS-T), рН 7,4, в течение 1 часа на орбитальном шейкере при комнатной температуре.
- Инкубируйте мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере с анти-MUC1 или анти-β-актин антител в 0,1% PBS-T.
- Промойте мембраны путем декантации раствора и добавлением 0,1% PBS-T. Вихревой мембраны на шейкере в течение 5 мин и декантируют. Повторите этот шаг дважды.
- Инкубируйте мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированных вторичных антител.
- Промыть 3 раза (см. шаг 3.4).
- Следуйте протокол для расширенного Chemiluminesence (ECL) комплект для активации и читать флюорографию.
4. Мультиплекс Флуорометрические иммуноферментного Microbead
<OL>- Используя 96-луночный планшет карте, назначать заготовки, стандарты, контроль и неизвестными в лунки. Рассчитать количество и объем анализируемых веществ, захват антител и Стрептавидин-Фикоэритрин (SA-PE), необходимых для анализа.
- Разрешить все буферы и разбавителей для уравновешивания до комнатной температуры. Подготовка стандартов и разбавлений образца, используя пустой 96-луночного планшета.
- Восстановить матрицу сыворотки и лиофилизированный стандарт в соответствии с протоколом производителя и сделать 1:05 последовательного разведения стандарта с соответствующими разбавителя в 96-луночный планшет. В контрольные лунки, использовать соответствующий разбавитель.
- Развести все элементы управления и неизвестных образцов 1:02 в соответствующем разбавителе в остальных 96-луночного планшета.
- Для шарик смеси, пипеткой требуемое количество соответствующего разбавителя в 15 мл пробирку. Вихревые каждый шарик флакона в течение 20 сек и пипеткой требуемое количество каждого анализируемого вещества в 15 мл пробирку. Всегда защищайте бусы из света, чтобы избежать фотообесцвечивания. Не ставьте 96-луночный планшет на абсорбирующий материал, чтобы избежать потери образца через влагу.
- Предварительно смочите 96-луночных фильтр нижнюю пластину 200 мкл буфера для анализа и позволяют полной пропитки фильтра. Аккуратно слить с использованием 96-луночного планшета вакуумный аппарат и высушить в нижней части пластины с бумажным полотенцем.
- С помощью многоканальной пипетки, пипетки 25 мкл сыворотки матрицы в лунки назначенные для заготовки и стандартов пипеткой 25 мкл буфера для анализа в лунки назначенные для управления и неизвестных.
- Внесите 25 мкл пустым, стандартов, контролей и неизвестных соответствующих назначенных скважин. Вихревые шарик смеси в течение 20 с и передачи шарики с резервуаром.
- Пипеткой 25 мкл шарик смеси в каждую лунку. Закройте планшет с алюминиевой фольгой или непрозрачной крышкой пластины для защиты от света.
- Приготовления раствора антител захвата. Пипеткой требуемое количество 0,1% PBS-T и захват антитела в 15 мл пробирку и вихревые течение 10 сек. Переносят смесь захватывающего антитела к резервуару и пипеткой 25 мкл в каждую лунку.
- Встряхнуть пластины при 500 оборотах в минуту в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере. Слить и промыть пластины с 200 мкл 0,1% PBS-T в два раза. Слейте воду и промокните насухо.
- Подготовьте SA-PE решение. Внесите необходимые объеме 0,1% PBS-T и SA-PE в 15 мл трубки и вихревые течение 10 сек. Перенесите раствор в резервуар и пипеткой 25 мкл в каждую лунку.
- Встряхнуть пластины при 500 оборотах в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере. Слить и промыть пластины с 200 мкл 0,1% PBS-T в два раза. Слейте воду и BМного сухой.
- Вносят по 100 мкл 0,1% PBS-T и встряхивают на шейкере при 500 оборотах в минуту в течение по крайней мере двух минут ресуспендируют бисером. Читать и анализировать табличку на машине Luminex LX200.
5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Получение и анализ
- В кабинете биологической безопасности, обрабатывают селезенки через 100 мкм ткань нейлон сита в 5 мл стерильного фосфатно-солевой буфер (PBS) в стерильные чашки Петри. Слой спленоцитам на 3 мл среды для отделения лимфоцитов в стерильные 15-мл пробирки.
- Центрифуга труб при 600 х г в течение 15 мин для отделения лимфоцитов из эритроцитов. Передача слоистых лимфоцитов выше градиент новые стерильные 15-мл пробирки.
- Отрегулируйте громкость до 10 мл стерильного PBS. Центрифугируют суспензию при 600 х г в течение 10 минут для осаждения клеток.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл PBS для жизнеспособности клеток и считать с Музойанализатора. Следуйте графа Muse и протокол Жизнеспособность Kit.
- Сделать серийные разведения лимфоцитов в 1,5 мл завинчивающейся крышкой центрифужные пробирки на коэффициенты разбавления 1:10, 1:20 и 1:40 (или в случае необходимости) в граф и жизнеспособность реагент (минимальный общий объем 300 мкл). Внесите каждого разведения вверх и вниз несколько раз перемешать и анализировать на Muse.
- Подготовьте тарелку карте образцов и условий для пластины ELISpot. Подготовьте ELISpot пластины в соответствии с протоколом производителя и пипеткой 100 мкл среды, пептидом (10 мкг / мл), либо борьба пептида (10 мкг / мл) в каждую лунку.
- Вносят по 100 мкл клеточной суспензии, обеспечивая 1,0 × 10 6 клеток в каждую лунку и инкубируют планшет при 37 ° С в течение ночи.
- Следуйте протоколу производителя для анализа ELISpot. Анализ проявленной пластины ELISpot использованием рассечение микроскопом.
- Количественная оценка результатов путем подсчета количества цветных пятен соответствующегнг каждого анализируемого вещества в каждую лунку. Пятна соответствуют количеству месте клетки, формирующие (SFC) в каждую лунку.
6. Иммуногистохимии (IHC) и гематоксилином и эозином (H & E) Окрашивание
- Возьмем опухоли мочевого пузыря ткани сохранена как описано выше (раздел 2.4.11), вставлять в парафин и шаг сечение в 4 мкм для иммуногистохимического анализа.
- Выполнение IHC использованием MUC1 антитело, которое распознает область тандемный повтор из MUC1. С помощью комплекта животных исследований пероксидаза, чтобы минимизировать реакционной способности вторичного антитела мыши с эндогенного иммуноглобулина, присутствующего в ткани.
- Выполните H & E окрашивания с использованием стандартных протоколов.
7. Статистические методы
Для Мультиплекс Флуорометрические иммуноферментного Microbead, используйте два-Стьюдента-тест, чтобы сравнить средние концентрации сыворотки наблюдается цитокинов между группами лечения и контроля. Для ELISpot, используя один-Wай ANOVA для сравнения месте образуя колонии между контрольными СМИ, яичницу пептидов и пептидных групп. Использование нескольких испытаний Сравнение Даннета, чтобы уменьшить вероятность ложного положительного результата. Р-величина которой ≤ 0,05 считается существенно отличается для всех анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Доклинической оценки воздействия новых иммунотерапии и их комбинаций при раке мочевого пузыря требует разработки соответствующей модели животного. В нашем трансгенных мышах, индукционные с химическим канцерогеном OH-BBN привел высокий уровень заболеваемости раком мочевого пузыря преимущественно TCC с некоторыми SCC, которая похожа на рак мочевого пузыря у людей. Для определения гистологической структуре опухоли, MUC1 выражение статуса и иммунный ответ на пептид лечение вакциной, 21 MUC1.Tg и 18 мышей дикого типа были подвергнуты эвтаназии для сбора крови, пузыри, и селезенки (рис. 1) восемь недель после ОН-BBN индукции (за неделю 28). Заболеваемость раком мочевого пузыря скорости для обоих MUC1.Tg (14/21) и дикого типа (12/18) мышей была 67%. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание подтвердили наличие обоих TCC и ГТК, с преобладающим страны, предоставляющие войска в соотношении 2:1. Среди них мы наблюдали диапазоне низких и полноценного неинвазивной к полноценному инвазивных опухолей.Все MUC1.Tg образцов рака мочевого пузыря были положительно для MUC1 выражения IHC (рис. 2). Следует отметить, что антитело, используемое для MUC1 IHC распознает как нормальных и раковых человеческого MUC1.
Во время разработки модели, сывороточные уровни цитокинов наблюдались последовательно между 8-28 недель. Мы заметили, что воспалительных цитокинов возрастает со временем, с индукцией до конца исследования (фиг.3). Это цитокинов очень похожа на то, что мы наблюдали ранее в нашей рака легких модель 33, который наводит на мысль, что увеличение воспалительных цитокинов может коррелировать с развитием опухоли.
Для оценки Th1 сывороточных цитокинов к пептидной вакцины, 15 вакцинированных и 14, получавших плацебо MUC1.Tg мышей умерщвляли и кровь собирали в конце исследования в неделю 28, 24 часа после последнего введения вакцины. Мультиплекс анализа (FigurЕ 4) предъявляет повышенные сывороточные уровни Th1 цитокинов TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-12 (p70) и IL-17 в вакцине группе по сравнению с группой плацебо. Уровни TNF-α, IFN-γ и IL-17 были значительно выше (р <0,05) в вакцине обработанных мышей. Эти результаты показывают, поляризованный Th1 ответа цитокинов к пептидной вакцины.
Для того чтобы оценить Th1/Th2 иммунный ответ на пептид вакцины спленоцитов оценивали IFN-γ/IL-4 ELISpot. Через двадцать четыре часа после последней обработки, Селезенки были собраны и обработаны, чтобы изолировать лимфоцитов для анализа ELISpot. Лимфоциты были подсчитаны, и анализируются на жизнеспособность Muse Analyzer (рис. 5). ELISpot Планшеты засевали 1 × 10 6 жизнеспособных клеток на лунку и разработали 48 часов позже. Типичные результаты (рис. 6) показывают четкую и конкретную IFN-γ ответ на пептид, который подтверждает Th1 иммунного ответа на пептидвакциной.
Рисунок 1. Мышь вскрытия. Вскрытии проводили при 28 недель, 8 недель после окончания OH-BBN индукции. Печень, опухоль мочевого пузыря и селезенки указаны. Звездочкой (*) отмечены прокол точка для сбора крови. В этом примере, полноценной, инвазивные ГТК наблюдалось. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 2. Представитель срезов тканей мочевого пузыря окрашивали H & E (слева) и человека MUC1 IHC (справа) Norma л мочевой пузырь, инвазивный плоскоклеточный рак, и инвазивным переходно-клеточным раком. (A) Нормальный мочевого пузыря с слизистой оболочки выстлана переходным эпителием, который показывает диффузные MUC1 реактивности. (B) Гнезда инвазивных SCC (стрелка) в подслизистой. Организованная слои кератина (звездочка) линии слизистой оболочки мочевого пузыря. Диффузный реактивности MUC1 видно в гнездах ГТК. (C) Слизистая оболочка содержит TCC выступающие в просвет (слева, справа). Переходно-клеточный рак является анапластическую с вторжением в подслизистой и мышечной (стрелка и вставка). Слизистой оболочки и TCC выступающих в просвет шоу диффундировать MUC1 реактивности (справа, справа), в то время инвазивных TCC имеет менее заметным реактивности (справа, слева). Бар = 200 мкм (основная панель) и 50 мкм (вставка). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
3 "FO: Content-ширина =" 6 дюймов "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 3. Воспалительные цитокины сыворотки на разных стадиях развития опухоли. Серийный образцов сыворотки собирали подчелюстной кровоточит в начале исследования (8 недель), затем каждые 4 недели после этого до окончания учебы. Кровь объединенных (п = 4), и сыворотка была выделена и анализировали на присутствие 20 цитокинов. Концентрации представляют собой среднее из объединенных образцов и барах представляют диапазон. Стрелки указывают на точку, в которой ОН-BBN дозирования заключен. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 4.Th1-цитокины сыворотки после пептид лечение вакциной. Пробы сыворотки брали при исследовании прекращения, через 24 часа после последней дозы вакцины (н = 15) или плацебо (п = 14) и анализируют на присутствие 20 цитокинов. Данные представлены в виде средних концентраций цитокинов и бары представляют положительные стандартное отклонение. * Р <0,05 Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 5. Представитель мыши спленоцита гистограммы. Спленоцитам мыши были выделены на исследования прекращения и анализируются на предмет количества и жизнеспособности использованием Muse Analyzer. Левая панель, сотовые viablility на основе размера ячейки. Правая панель, жизнеспособность клеток на основе ядерных клеток (живые клетки в зеленой зоне, мертвые клетки в белом зоны). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 6. Спленоцитов анализа LISpot на окончания учебы. (A) представитель скважин показывает IFN-γ (красные пятна) и ИЛ-4 (синие точки) производства в ответ на СМИ, яичницу-пептида и пептида. Ясно IFN-γ, антиген-специфическую реакцию наблюдали с пептидом экспозиции. (B) Графическое представление типичной IFN-γ ELISpot данные, показывающие среднее (± стандартное отклонение) местная образуя колонии в ответ на СМИ, яичницу-пептида и пептида._blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешное индукции инвазивных переходных и плоскоклеточный рак мочевого пузыря у человека мышей MUC1.Tg предлагает доклинической модели иммунотерапии развития. Immunotherapeutic исследований требуют использования спонтанное, иммунных нетронутыми модель для оценки воспалительного ответа на прогрессирование опухоли с течением времени, а также иммунного ответа на иммунотерапии. В спонтанной модели развития опухоли, микроокружение опухоли остается неповрежденной и опухоли развиваются в более представительный темп роста, который позволяет для оценки противоопухолевого эффекта лечения. Кроме того, иммунная система может контролировать и измерять через биомаркеров, позволяющих для оценки эффективности лечения.
Другие опухолей мыши описанных в литературе для тестирования иммунотерапии включают как модели ксенотрансплантата и трансплантации моделей. Хотя эти модели удобны и широко используются в исследованиях рака,Есть ряд важных ограничений необходимо учитывать при проведении исследований иммунотерапевтическую. Ни ксенотрансплантаты ни пересаженной опухоли развиваются спонтанно, и они размножаются в микросреду, что не является репрезентативным для ткани, из которой опухоли были первоначально получены. Кроме того, ксенотрансплантаты и пересадить опухоли растут быстрее, чем спонтанные опухоли, что позволяет меньше времени, чтобы изучить иммунные эффекты терапии. Самое главное, эти модели требуют хозяева с ослабленной иммунной системой.
В дополнение к модели, существует ряд других химически индуцированных моделях рака мочевого пузыря. Например, N-[4 - (5-нитро-2-фурил)-2-тиазолил] формамид (FANFT) и N-метил-N-нитрозомочевины (МНМ) также было показано, чтобы вызвать рак мочевого пузыря у крыс и мышей . Тем не менее, эти химические вещества слегка отличаются по отношению к гистологии опухоли они вызывают. FANFT в первую очередь вызывает уротелиальная рак (UCC) с некоторыми SCC, в то время как MNU вызывает папиллярный рак, что в конечном итоге приводит инвазивных опухолях с низкой частотой метастазирования 34. OH-BBN обычно используется для индукции рака мочевого пузыря на моделях грызунов, потому что страны, предоставляющие войска, которые развиваются напоминают высокий класс страны, предоставляющие войска 34 человека. Рака мочевого пузыря также был индуцирован у собак, кроликов и крыс, а также у мышей использованием ОН-BBN. Хотя клыки имеют сходные метаболические процессы с людьми по отношению к биоактивации 35 канцерогенов, латентный период для развития рака мочевого пузыря в гончих составляет 37 недель 36, и экспериментов с собаками есть как финансовые, так и этических соображений. Кролики иметь даже более длительные периоды ожидания, и при добавлении к дозировке период, как минимум, 21 месяцев требуется для TCC и SCC развитие 37. Как и в мышах, крысах развиваться опухоли, которые гистопатологически похожих на людей, с короткими периодами дозировке 8 недель и латентные периоды 5 недель 38
Ранее мы разработали два нетронутыми человеческой иммунной MUC1 экспрессирующих спонтанные опухоли модели и для 33 легких и рак молочной железы 39. Для того чтобы оценить иммунотерапии при раке мочевого пузыря, мы разработали OH-BBN-индуцированной, спонтанная мышиной модели рака мочевого пузыря. Как и ранее описанные модели 33,39, опухоли, которые развиваются в этой модели выражают ассоциированный с опухолью антиген MUC1 в качестве самостоятельной молекула, которая является целевой пептидной вакцины. Эта модель показала 67% случаев рака мочевого пузыря, все из которых были положительными по экспрессии человеческого MUC1. Гистологические оценки показали, что страны, предоставляющие войска преобладали, что согласуется с тем, что наблюдается в человеческом раке мочевого пузыря. Эта модель идеально подходит для изучения автомобиляcinogenesis, стратегий профилактики и лечения локализованного и передовых рака мочевого пузыря у людей. В будущем мы планируем проводить дополнительные исследования иммунотерапии в сочетании с химиотерапией и лучевой терапии в описанной модели рака мочевого пузыря.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DPV, GTW, SMG, CJK, AMG и ЖКХ заявляют никакого конкурирующих интересов. ММР является главным исследователем грант, полученный от Merck KGaA и MW является сотрудником Merck KGaA.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить UC Davis Мышь биологии Программа для разведения мышей. Это исследование было поддержано грантом Merck KGaA, Дармштадт, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
