Summary
Denne artikkelen presenterer en protokoll for en kontekstuell og spolt frykt condition test ved hjelp av en videoanalysesystem for å vurdere frykt læring og hukommelse i mus.
Abstract
Den kontekstuelle og spolt frykt condition test er en av de atferdsmessige tester som vurderer muligheten for mus til å lære og huske en sammenheng mellom miljø-signaler og aversive opplevelser. I denne testen blir musene anbragt i en kondisjone kammer og gis parings av en betinget stimulus (en auditiv cue) og en ubehagelig ubetinget stimulus (et elektrisk footshock). Etter en tidsforsinkelse, blir musene utsatt for den samme kondisjonekammer og et annerledes formet kammer med presentasjon av det auditive signalet. Frysing oppførsel i løpet av testen måles som en indeks av frykt minne. Å analysere atferden automatisk, har vi utviklet en video analysere systemet med ImageFZ programvare program, som er tilgjengelig som en gratis nedlasting på http://www.mouse-phenotype.org/. Her, for å vise detaljene i vår protokoll, vi viser vår prosedyre for kontekstuell og spolt frykt condition test i C57BL/6J mus bruker ImageFZ system. I tillegg bekreftet vi vår protokollen og videoanalysesystemytelsen ved å sammenligne fryse tid målt ved ImageFZ system eller et photobeam-basert datamaskin målesystem med det lages av en menneskelig observatør. Som vist i våre representative resultater, de data som oppnås ved ImageFZ var lik de som ble analysert ved hjelp av en menneskelig observatør, noe som indikerer at de atferdsmessige analyse ved hjelp av ImageFZ systemet er meget pålitelig. Den nåværende filmen artikkelen gir detaljert informasjon om testprosedyrene og vil fremme forståelsen av den eksperimentelle situasjonen.
Introduction
Den kontekstuelle og spolt frykt condition test er den atferds paradigmet brukes til å vurdere assosiative frykt læring og hukommelse hos gnagere 1-3. Denne testen har vært mye brukt for å forstå nevrobiologiske mekanismer av frykt læring og hukommelse i transgene og knockout mus 1,4-16. Frysing oppførsel, som er definert som fullstendig immobilitet med unntak av pusting, er en vanlig reaksjon for å redde situasjoner. I denne atferds paradigmet, etter at dyr blir utsatt for en sammenkobling av en auditiv kø med en elektrisk footshock, de reagerer på frykt-produserende stimulans ved å vise frysing atferd, som er målt som en indeks for assosiativ frykt læring og hukommelse. Denne testen krever mindre forseggjort utstyr, mindre fysisk anstrengelse av utprøver, og mye mindre treningstid for mus enn andre lærings-og hukommelsesoppgaver, det krever vanligvis ca 5-10 min / dag per mus for to dager. Selv om testprosedyren er simple og krever lite tid til å utføre, må etterforsker nøye observere og måle muse atferd, og derfor har flere automatiserte målesystemer er utviklet for å gjennomføre atferdsanalyse 17-20. Vår video-analyse system, som vi har utviklet med ImageFZ program, tillater oss å enkelt analysere frysing atferd og produsere svært pålitelige resultater. Denne artikkelen gir detaljert informasjon på vår testprosedyre og beskriver hvordan du bruker ImageFZ programmet.
Protocol
Alle forsøkene skal utføres i henhold til veiledning og protokoller etablert av lokale Animal Care og bruk komiteer.
En. Apparatus Setting
- Anordning for kondisjonering og kontekst test er en firkantet kammer med en elektrifiserbar netting-bunn, en lydkilde, og et kalibrert sjokkgenerator. Ulike kammerstørrelser brukes, med dimensjoner som varierer fra 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 til 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. I denne protokollen, består anordningen av en akryl firkantet kammer (33 cm x 25 cm x 28 cm; gjennomsiktige i de fremre og bakre vegger, hvitt i sideveggene) med metallnett (0,2 cm diameter, i avstand 0,5 cm fra hverandre) dekkes av en gjennomsiktig akryl lokk (figur 1A). Det er nødvendig å sette inn i kammeret på en hvit akryl gulvet (figur 1B) for å analysere oppførselen til sort, agouti eller fortynne brune mus fordi en bildeanalysesystem med ImageFZ program (tilgjengelige for gratis nedlasting, se tabell av materialer / reagenser) skiller en mørk gjenstand fra en hvit bakgrunn i hvert fanget videobildet. Albino mus kan også testes ved hjelp av black metal rutenett og en sort akryl etasje (Figur 1B). Lysemitterende diode (LED) lyser er festet til taket over anordningen. Rutenettet gulvet er opplyst om 100 lux av LED-lys. En høyttaler er koblet til en hvit støy / tonegenerator (fig. 1C) er montert på et tak 5 cm over lokket for å presentere en auditiv signalet (en hvit støy, 55 dB) som betinget stimulus (CS). Ristene er kablet til et sjokk generator (figur 1C) å levere en elektrisk footshock som den ubetingede stimulus (US). Prøvekammeret er plassert i et lydisolert rom (170 cm x 210 cm x 200 cm) (fig. 1D) for å minimalisere bakgrunnsstøy under testene. Denne tilstanden forhindrer også at mus som ikke for tiden blir utsatt for enteste fra å høre en auditiv cue eller vokalisering av test mus.
- Anordningen for cued test består av et kammer som har forskjellige egenskaper fra kondisjoneringskammeret, og gir en ny sammenheng. Det er viktig å forandre de sensoriske signaler så mye som mulig, slik at musen oppfatter den nye forbindelse som å være relatert til den kondisjonekammeret. Vanligvis er en annerledes formet boks eller et triangulært kammer benyttes. I tillegg er forskjellige lys-og / eller lukte-signaler også gitt til musen. I denne protokollen, er anordningen av en akryl trekantet kammer (33 cm x 29 cm x 32 cm; hvite i hver sidevegg) med et flatt, hvitt gulv for svart, agouti eller fortynne brune mus eller en flat, sort etasje til albino mus, dekket med en gjennomsiktig akryl lokk (figur 1E). LED-lysene er festet til taket over anordningen. Belysnings nivået av gulvet er fastsatt til 30 lux. En høyttaler montert i taket 5 cm over lokket til present en hørbar indikator som er den samme som gitt til musene på tidspunktet for kondisjonering. Den trekantede kammeret er plassert i et annet lydisolert rom fra rommet hvori kondisjone og kontekst test utføres.
- Hvert kammer er utstyrt med en takmontert Charge Coupled Device (CCD) kamera tilkobling til en Windows-maskin via quad video splitter og USB image opptaksenheten til å overvåke musen atferd, og bilder av apparater og musen blir fanget og analysert av programvare program ImageFZ (se protokoll 6). Hvit støy og footshock generatorer er automatisk styrt av ImageFZ program, starttidspunkt og varighet av hvit støy og footshock må være skrevet inn i en tekst-fil (se et eksempel tekstfil 'enkel-dirigent' vist i videoen til den detaljer om hvordan parameterne er skrevet i filen), som blir lest inn i programmet.
- Før hver testen starter, akryl veggerog gulv er tørkes med et håndkle fuktet i super hypochlorous vann (pH 6-7), og ristene blir rengjort med 70% etanol for å hindre en skjevhet basert på olfactory signaler. Gitterne er tørkes med etanol i stedet for super hypochlorous vann for å sikre at ristene ikke minske deres elektriske ledningsevne på grunn av rust.
2. Animal Forberedelse
- Vanligvis er 3:58 mus plassert per bur i et temperaturkontrollert venterommet (23 ± 2 ° C) med en 12 timers lys / mørke-syklusen (f.eks lysene på på 7:00).
- I denne protokollen, for å redusere mulige påvirkninger av buret transport på atferd og å tilpasse musene til den eksperimentelle miljøet, er burene som inneholder mus overføres fra dyr å holde rommet i et lydtett venterommet ved siden av en lydtett testing rom minst 30 min før hver test starter.
- Alle eksperimenter (figur 2A) skal utføres i løpet av same tidsperiode i lys eller mørke fase hver dag for å minimalisere de atferdsmessige variasjoner som er produsert ved å teste til forskjellige tider 23,24. I denne protokollen, er alle forsøkene gjennomført mellom en time etter utbruddet av lyset fase og en time før utbruddet av den mørke fasen (08:00-18:00 i lys fase). Hvis bare ett apparat er tilgjengelig, bør mus i hver genotype prøves i en motvekts for å redusere eventuelle effekter av forsøkstiden og testing rekkefølgen av fagene på atferdsmessige ytelse. ImageFZ kan kontrollere maksimalt fire apparater. Testing fire mus samtidig ved hjelp av fire aggregater i en motvekts rekkefølge tillater forskeren å spare tid og reduserer de mulige effektene av de eksperimentelle parametre på mus atferd.
Tre. Conditioning
- Mus blir plassert i kondisjoneringskammeret, og musene blir vanligvis tillates å fritt utforske kammeret til 120 sek. Deretter, auditory cue, for eksempel en hvit støy, tone, og auditiv klikkeren, blir presentert som en CS i 30 sek, og en 0,1 til 0,8 mA footshock er gitt til mus som en amerikansk i løpet av siste 2 sek av lyden. Presentasjonen av CS-amerikansk paring gjentas for å styrke foreningen. Musene blir forlatt i kammeret i en tidsperiode etter at den siste presentasjon for ytterligere å etablere sammenhengen mellom forbindelse med kammeret og motvilje erfaring. I denne protokollen, etter 120 sek av fri utforskning, er en auditiv cue (hvit støy, 55 dB) presenterte i 30 sek, og en 0,3 mA footshock leveres fortløpende i løpet av siste 2 sek av hvit støy. Etter 90 sek, er sammenkoblingen av den auditive signalet med footshock gitt til fagene igjen. Presentasjonen av CS-US gjentas tre ganger per sesjon (120, 240, og 360 sekunder etter starten av kondisjone) (figur 2B). Etter den endelige footshock, blir musene stå uforstyrret i kamrene for 90 sek.
- Før condition økten begynner, kjøre ImageFZ programvare program, velg plug-in menyen 'FZ Conditioning og FZ Online (4 kammer), og setter parameterverdiene steg-for-trinn, som følger.
- Trinn 1: Prosjekt ID. Angi en mappe der du vil lagre dine datafiler.
- Trinn 2: Session Name. Skriv noen ord, for eksempel den eksperimentelle dato, i "Session"-boksen, og velg en referanse tekstfil som starttidspunkt og varighet av hvit støy og footshock er skrevet, i "Reference"-boksen. En prøve tekstfil er vist i videoen.
- Trinn 3: Parameterinnstillinger. Skriv inn parameterverdier i hver boks som følger.
- Rate (ramme / sek): bildefrekvens på bildet oppkjøpet, f.eks en ramme / sek.
- Varighet (sek.): i tilfellet med kondisjonering, er den totale varighet 480 sek.
- Bin varighet (sek): f.eks 60 sek; dataene er analysert i hver blokkav 60 sek.
- Subject størrelse - min (piksler): ImageFZ oppdager en mus og støy som svarte partikler (noen masse piksler) i en hvit bakgrunn i hvert bilde. Når området av den svarte partikkel (piksler) er mindre enn "Subject størrelse - min (piksler)" verdi (f.eks 100 piksler), blir partiklene regnes som støy og blir ekskludert fra bildeanalyse.
- Subject størrelse - maks (piksler): når størrelsene på de svarte partikler er mer enn størrelsen på "Emne størrelse - max (piksler)" verdi, blir partiklene ekskludert fra analysen.
- Rammestørrelse - bredde / høyde (cm): kammer dimensjon, dvs. 33 cm bred og 25 cm høy.
- Frysing kriterium (piksler): f.eks 30 piksler, se detaljer i Protokoll 6.
- Frysing varighet - min (sek): f.eks 2 sek, når ingen mus bevegelse oppdages for bare mindre enn 2 sek, er dens oppførsel ikke regnet som "fryser";.
- Shock rate (ramme / sek): se detaljene i Protokoll 6.
- Trinn 4: Tema ID. Skriv inn emne identifikasjon.
- Trinn 5: Kamerainnstillinger. Kontrollere lysstyrken og kontrasten i bildet.
- Trinn 6: Terskel Innstillinger. Juster terskelverdier å oppdage en svart mus som svarte piksler i en hvit bakgrunn i hvert bilde, og å dømme mus oppførsel som "frysing" eller "non-frysing '(se detaljer i Protokoll 6). Å analysere en albino mus, klikk på avkrysningsboksen 'invert mode', og justere terskelverdiene på riktig måte.
- Trinn 7: Set Cage Field. Angi innen hvert kammer som du ønsker å fange. Etter å ha klikket rektangelet knappen i verktøykassen, tegne et rektangel rundt på gulvet av kammeret på det levende bildet vinduet. Deretter velger kammeret nummer og klikk på "Set" knappen. Til slutt klikker du "Fullfør"-knappen.
<li> Etter parameterinnstillingene er satt, bør en forberedende test gis ved hjelp av praksis mus (mus ikke brukes som fag) før den første testen av dagen for å finne ut om bildet analysesystem og hvit støy / sjokk generatorer fungere uten problemer. - Flytt et hjem bur inneholder praksis mus til lydisolerte testing rom fra tilstøtende venterom, og plassere hver mus i condition kammeret. Umiddelbart etter at du plasserer mus i kammeret, klikk på startknappen for ImageFZ. Søknaden programvare vil presentere auditive signaler og / eller elektriske footshocks til musene i den rekkefølgen du angir i en referanse fil.
- Etter 480 sekunder er gått, returnere musene til sine hjem bur og tilbake i buret til hylle i venterommet.
- Rengjør kamrene nøye. Deretter klikker du Neste Analysis "-knappen, og gjenta trinn 3.2.4-3.6 for test mus.
- ImageFZ butikker lever og spore bildene i TIFF-format. Programmet gjør det muligoss å utføre en frakoblet analyse for å Analyser på nytt bildene ved hjelp av modifiserte parameterverdier. Hvis du utfører en frakoblet analyse, velg plug-in menyen 'Fear Conditioning og FZ Offline "og velg data-mappen som du ønsker å Analyser på nytt. Deretter inngangsparameterverdiene igjen, og klikk på 'Fullfør' knappen.
4. Kontekst Test
- Etter condition økten er ferdig, blir musene returnert til samme condition kammer og scoret for frysing atferd å måle kontekstuelt betinget frykt (kontekst test). En forsinkelse intervall mellom condition og konteksten testen er generelt satt til 24 timer. I denne protokoll, for å vurdere siste minne-og langtidshukommelse (målt ved test 1 dag, og mer enn 28 dager etter kondisjonering, henholdsvis) 25, blir musene underkastet sammenheng testen ca 24 timer og 30 dager etter kondisjone økt. Musene er plassert i dirigentitioning kammeret og får lov til å fritt utforske kammeret for 300 sek uten CS og amerikanske presentasjoner (Figur 2C).
- Kjør ImageFZ program og sette programmet programvarens parameterverdier på samme måte som i condition (se avsnitt 3.2.3), men endre varighet av denne testen til 300 sek og velg en referanse tekstfil for sammenheng test . Når du har endret innstillingen, bør en forberedende test gis ved hjelp av praksis mus for å sjekke ImageFZ system.
- Plasser hver mus inn i condition kammeret og klikk på startknappen. Etter 300 sekunder er gått, returnere musene inn i deres hjem buret, og la buret uforstyrret inntil beskjed om testen starter.
- Rengjør kamrene. Deretter klikker du Neste Analysis "-knappen, og gjenta trinn 04.03 til 04.04 i test mus.
5. Cued Test
- Cued prøven utføres på samme dag i sammenheng testen eller på den neste dag.I denne testen blir musene anbragt i en annen testkammer med meget forskjellige egenskaper, noe som gir en ny kontekst som er relatert til kondisjoneringskammeret i 3 min. Ved slutten av de første tre minutter, er det auditive signalet som blir presentert ved kondisjone gitt til mus i 3 min i en ny sammenheng miljø. I denne protokollen, er spolt test utført noen få timer etter at konteksten test. Mus får lov til å utforske den trekantede kammer for 360 sek. I den første 3 min er verken en CS eller USA presentert, og etterpå, er en CS (en 55 dB hvit støy) presenteres for siste 3 min.
- Kjør ImageFZ program og angi parameterverdier på samme måte som i condition, bortsett endre varigheten testtidspunktet til 360 sek og velg en referanse tekstfil for cued test. Når du har justert innstillingen, bør en forberedende test gis ved hjelp av praksis mus til å kontrollere ImageFZ system.
- Plasser hver mus inn i trekant kammer og klikk på start-knappen. Etter 360 sekunder er gått, returnere musene til sine hjem bur og tilbake i buret til sokkelen i venterommet.
- Rengjør kamrene. Deretter klikker du på "Neste Analysis"-knappen og gjenta trinn 05.03 til 05.04 i test mus.
- For å teste fjern minnet ytterligere, gjentar Protokoller 4-5 ca 30 dager etter condition økten (Figur 2A).
6. Bildeanalyse
- Utfør datainnsamling og analyse automatisk ved hjelp ImageFZ. Denne applikasjonen programmet er basert på den offentlige sfæren ImageJ program (utviklet av Wayne Rasband ved National Institutes of Health og tilgjengelig på http://rsb.info.nih.gov/ij/), modifisert av Tsuyoshi Miyakawa (ImageFZ programvare , som er tilgjengelig for gratis nedlasting, se tabell av materialer / reagenser).
- For alle eksperimenter, ta bilder på et gitt bildefrekvens (f.eks en fps) med ImageFZ ved hjelp av en USB videoopptaksenhet, inkludert envideokameraet. For å måle distanse fra de etterfølgende bilder, justere 'terskel min' verdien av programmet (f.eks 80 piksler), som er satt til segment bildene inn i en svart partikkel (en mus) og en hvit bakgrunn. Denne distanse er beregnet fra avstanden mellom hvert sett av xy-koordinater for tyngdepunktet av partikkelen i den etterfølgende bilder.
- For å måle frysepunktet oppførsel fra de etterfølgende bilder, justere 'terskelen min (xor)' verdien av programmet (f.eks 160 piksler), som er satt til segment bildene inn i en svart partikkel (mus) og bakgrunn, og deretter beregne Mengden av område (piksler) på ikke-overlappende regioner mellom partikler av hvert par av etterfølgende bilder. Juster verdien ved hjelp av skyveren av terskelen verktøyet inntil den sorte partikler i hvert bilde svarer til formen av hele kroppen av musen uten halen. Hvis arealet av nonoverlaPPING region er under den "fryse kriteriet" verdi (for eksempel 30 piksler), blir virkemåten anses å være "fryser" (fig. 3), som er generelt definert som den fullstendige fravær av enhver bevegelse med unntak av respirasjon og hjerterytme. Når området overskrider denne verdi, blir virkemåten anses å være "ikke-frost" (fig. 3). Dommen bør gjøres basert på definisjonen av frysing. Mus viser noen ganger en subtil bevegelse og en kortvarig immobilitet, som ikke kan anses som et iskaldt atferd som reflekterer frykt. Den immobilitet som varer en kort tid (f.eks mindre enn 2 sek), noe som sannsynligvis forskjellig fra manifestasjon av frykt, kan bli ekskludert fra analysen ved å sette tid terskel for frost. For å stille inn tidsgrensen, inngang 'Frysing varighet - min (sek) "verdi (f.eks 2 sek).
- Den ImageFZ programmet automatisk calculAtes distanse (cm) og andelen av frysing. Resultatene lagres i tekstfiler, og leve og spore bildene er lagret i TIFF-format. For å måle distanse (cm) som en indeks for elektrisk footshock følsomhet, den ImageFZ programmet henter også bilder med høy bildefrekvens (f.eks 4 fps) for 6 sek, målt fra 2 sek før levering av en 2 sek footshock inntil 2 sek etter footshock under online analyse. For å sette bildehastigheten for bildefangst før, under og etter footshock, legge inn en verdi i "Shock rate (ramme / sek)"-boksen. Etter den online analyse, utføre offline analyse ved å velge en plug-in menyen 'FZ Shock Frakoblet å skaffe dataene for distanse.
- Parameterverdiene av ImageFZ program bør optimaliseres for å generere resultater tilsvarende de som oppnås ved menneskelig observatør i forberedende testene. For manuell scoring, er det iskalde oppførsel kontinuerlig målt ved hjelp av en stopwatch og en hendelse-opptak program eller en øyeblikkelig time-sampling prosedyre hver 3-10 sek, under analyse ved hjelp ImageFZ programvare. To observatører typisk gjennomføre atferds observasjon. Slik justerer parameterverdier for ImageFZ program for å sikre at resultatene av bildeanalyse er konsistente med de menneskelige observatører, utføre en frakoblet analyse av ImageFZ programmet, endre den "terskelen min (xor) 'og' fryse kriterium 'verdier . For å utføre offline analyse, velg plug-in menyen 'FZ Offline "og innspill eventuelle parameterverdier.
7. Feilsøking
- Hvordan kan det ImageFZ programmet fås og installert?
Den ImageFZ programmet er tilgjengelig for gratis nedlasting fra vår hjemmeside (se tabell av materialer / reagenser), og kjører på en Windows-maskin. Last ned zip-mappen for ImageFZ og installere programvaren på datamaskinen din. Se 'readme.txt' fil for instapå detaljer og følge trinn-for-trinn-instruksjoner. - Hvorfor er feilmeldingen "Feil innstilling fangst enheten 'vises?
Kontroller tilkoblingen av kamerakabelen og din driver av USB-bildeopptaksenheten. Hvis det er noe problem med innstillingene, så ImageFZ programvaren fungerer kanskje ikke med din bildeopptaksenheten. Se 'readme.txt' file om den aktuelle enheten som skal brukes med ImageFZ programvare. - ImageFZ kan ikke oppdage hele kroppen av musen som en partikkel.
Sett verdien av "terskelen min 'og / eller' terskelen min (xor) 'lavere enn dagens verdi. Hvis ImageFZ ikke kan oppdage musen på et bestemt sted, for eksempel på hjørnet av et testkammer, så utilstrekkelige testforhold, som for eksempel en jevnt belyst gulv eller en litt kontrastforskjell mellom musen og bakgrunnen, kan eksistere. For å løse dette problemet, justerer parameterverdier (f.eks - Bilde fange på et høyt bildefrekvens bremser ned datamaskinen under online analyse.
Sette bildehastigheten til en verdi lavere enn dagens rente, og utføre online analyse. Den ImageFZ analyse, gjennom bildet oppkjøpet på en fps, er tilstrekkelig for nøyaktig måling av frysing, som vist i den representative resultatene delen. - Resultatene av ImageFZ analyse er ikke enig med de av menneskelig scoring.
Undersøk lagret bilde og dom resultatfiler. Hvis ImageFZ overvurderer frysing, sette "fryser kriteriet" til en verdi lavere enn dagens verdi, og utføre offline analyse. Hvis ImageFZ undervurderer frysing, sette 'frysing kriteriet "til en verdi høyere enn dagens verdi. - I optogenetical og in vivo elektrofysiologisk experiments, fiberkabelen festet til hodet av musen forstyrrer dom frysing.
Frakk kablene i hvitt for en svart mus, og endre posisjon og vinkel på kameraet til det kablene ikke blir oppdaget. - Hva er nødvendig for offline analyse?
Lag en mappe som heter 'Image_FZ "i rotkatalogen på ImageFZ programmet. I denne mappen, opprette undermapper 'Images' og 'Sessions'. Flytt en 8 bits gråskala bilde til "Bilder"-mappen, og opprette en tekstfil hvor bildefilen navn er skrevet i "Sessions"-mappen. Deretter kjører du ImageFZ offline analyse, og følg instruksjonene i programmet.
Representative Results
I frykt condition test, menneskelige forskere brukes til å kvantifisere frysing atferd gjennom arbeidskrevende direkte observasjon 26-29, men nylig photobeam-basert datamaskin måling (f.eks «Frys Monitor 'system) og bilde-analyse systemer har blitt brukt til å automatisk måle fryse atferd 26,30-32. ImageFZ er en automatisk bilde-analysesystem, noe som gir resultater er sammenlignbare med dem som oppnås ved menneskelig observasjon, som beskrevet nedenfor. Her har vi sammenlignet resultatene av menneskelig observasjon med de av ImageFZ analyse under varierende parametere: "Rate (ramme / sek)" og "Frysing kriterium (piksler). ' I dette eksperimentet, fem mannlige C57BL/6J mus (gjennomsnittlig kroppsvekt ± SD (g), 31,4 ± 3,55, og en gjennomsnittlig kroppsstørrelse ± SD (piksler), 351,6 ± 62,2) ble anvendt ved 15 til 27 ukers alder. Den menneskelige observasjonen ble gjort ved hjelp av en hendelse-opptak program (en Macintosh OS9 program), en nøkkel-trykke hendelse som fortsetterd for 2 sek eller mer når en mus viste et anfall av ingen bevegelse ble ansett "fryser". Prosentandelen av frysing ble beregnet hvert 60. sekund i hver test og for korrelasjon analyser. Den prosent av iskaldt scoret av de to observatører (interobserver pålitelighet, for condition, r = 0,879, for sammenheng test, r = 0,957, for cued test, r = 0,866, for alle tilfeller, r = 0,888) ble i gjennomsnitt for å generere et menneske score. Korrelasjoner mellom den dypfryste prosenter målt gjennom ImageFZ med hver bildefrekvens (dvs. 1, 2, og 4 fps) og de som er oppnådd gjennom menneskelige observasjoner ble undersøkt. Som illustrert i figur 4, ble fryse prosenter beregnet gjennom ImageFZ (1, 2, og 4 b) høyt korrelert med gjennomsnittsverdien oppnådd fra målingene av de to observatører. Spesielt, ta bilder med høyere bildefrekvens gir ikke alltid den beste korrelasjon. Bilde-analyse på en fps generert resultater som ligner de som ble oppnådd fra humane observatører i each test. Korrelasjoner mellom den dypfryste prosenter målt gjennom menneskelige observasjoner og bruk ImageFZ under hver tilstand av "Fryse kriteriet (piksler)" (dvs. 20, 30, og 40 piksler) ble undersøkt. Frysing prosenter beregnet ved hjelp ImageFZ på "fryser kriteriet (piksler) 'på 20, 30 og 40 piksler ble, i alle tilfeller, høyt korrelert med de som oppnås gjennom menneskelige observasjoner (Figur 5). Som vist i figur 5D, når fryse kriteriet er satt til en lav verdi, den subtile bevegelse med musen, anses som "fryser" av menneskelige observatører, ville bli betraktet som "ikke-fryser" ved hjelp ImageFZ. Derimot, hvis kriteriet er satt til en høy verdi, bevegelsen av en mus, scoret som "non-frysing" av menneskelige observatører, ville bli betraktet som "fryser" ved hjelp ImageFZ (Tall 5C, 5F, og 5I). Derfor, for å få de mest pålitelige resultater, hver parameter av ImageFZ programmet bør kalibreres ossing dataene scoret gjennom menneskelige observasjoner i hver testmiljøet.
I tillegg har vi sammenlignet med resultatene som genereres av en menneskelig observatør, ved hjelp av en photobeam-basert datamaskin målesystem (Frys monitor system), de som er oppnådd ved hjelp av ImageFZ (se figur 6). Den menneskelige observatør ble blindet for behandlingsgruppen og resultatene av ImageFZ scoring. For parameterinnstillingene for Freeze Monitor system, brukte vi tre mål på andelen av frysepunktet fra en tidligere validert system 30. Kort, hvor dyrene forutsatte antall 10-sek intervaller mer enn 1 eller 2 sek til å krysse den første nye stråle av intervallet (1 sek 10 sek, og 2 sek 10 sek, henholdsvis), og latensen mellom begynnelsen av hvert intervall, og 5 sek den tredje nye strålen avbrudd innenfor dette intervallet (Latency3) ble målt. Prosentene i de intervaller under hvilke mus ble frysing eller prosentandelen av den totale mengden av tid required å bryte den tredje photobeam ble beregnet.
Prosentandelene av frysing, målt i hvert system er illustrert i figur 6.. Gruppene ble sammenlignet ved bruk av to-veis repeterte målinger ANOVA etterfulgt av t-tester (se tabell 1). De fryse prosenter målt ved hjelp ImageFZ (figur 6B) var mer lik de som mottok gjennom menneskelig observasjon (figur 6A) enn de data som oppnås ved hjelp av en photobeam-basert system (figurene 6C-E). Frysing prosenter målt ved hjelp av ImageFZ program i hver test ble høyt korrelert med de scoret gjennom menneskelig observasjon (condition, r = 0,947; sammenheng test, r = 0,970; cued test, r = 0,934), mens korrelasjonen mellom den dypfryste prosenter målt bruker photobeam-basert datamaskin målesystem (1 sek 10 sek, 2 sek 10 sek, eller Latency3) og den menneskelige observatør var lavere (condition, r = 0,503, 0,593 og 0,761; sammenheng test, r = 0,772, 0,819 og 0,912) i forhold til sammenhengene mellom den dypfryste prosenter målt ved hjelp ImageFZ og menneskelig observasjon (7A og 7B). I tillegg, figur 7 viser at forskjellene mellom de fryseprosentene oppnådd ved menneskelig observasjon og ved hjelp ImageFZ i hver mus var de minste forskjeller. Disse resultatene indikerte at frysing prosenter, målt ved hjelp av ImageFZ var lik de som ble oppnådd ved menneskelig observasjon og at ImageFZ er meget nøyaktig ved å måle mengden av frysepunktet.
Figur 1. Apparater for det kontekstuelle og spolt frykt condition test. (A) En akryl firkantet kammer for condition og kontekst test, (
Figur 2. Skjematisk fremstilling av protokollen. (A) Oversikt over kontekstuell og spolt frykt condition test, (B) condition, (C) context test, og (D) cued test. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Bildeanalyse av ImageFZ programmet. For hvert par av følgende bilder, er mengden av området (piksler) gjennom der muse flyttet beregnet av ImageFZ. Når dette område er under en viss terskel (f.eks 30 piksler), blir virkemåten bedømmes til å være "fryser". Når mengden av området lik eller overstiger terskelverdien, er atferd som anses å være "non-frysing". Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Sammenligninger av frysing prosenter beregnet fra bilder på ulike bildefrekvens ved hjelp ImageFZ med de som er målt gjennom menneskelig observasjon. Frykten condition testene ble utført med mannlige C57BL/6J mus (n = 5). Under testene, to observatører scoret iskaldt atferd. Samtidig ble levende bilder tatt på 4 fps bruker ImageFZ programmet. Filene fanget på 4 fps ble forminsket etter utpakking rammene å tilsvare bilder tatt på en fps eller to fps. Parameterverdier "Rate (ramme / sek)" ble satt til 1, 2 eller 4 fps, og frysing prosenter i hver 60-sek bin ble beregnet ut fra bildefiler ved hjelp ImageFZ offline analyse. Hver prikk representerer en frysing prosentandel av hver 60-sek bin. Pearsons korrelasjonskoeffisienter mellom data innhentet fra menneskelig observasjon og ImageFZ analyse ble beregnet.Klikk her for å se større bilde.
Figur 5. Frysing prosenter beregnet fra bildene på ulike frysekriterieverdier ved hjelp ImageFZ og de som er målt gjennom menneskelige observasjoner ble sammenlignet. Frykten condition testene ble utført med mannlige C57BL/6J mus (n = 5). Under testene, to observatører registrert frysing atferd, og de levende bildene ble tatt med ImageFZ programmet. Frysing prosenter i hver 60 sek bin ble beregnet ut fra bildene (1 ramme / sek) gjennom ImageFZ offline analyse, sette parameterverdier "Fryse kriteriet (piksler) 'til 20, 30, eller 40 piksler. Hver prikk representerer en frysing prosentandel av hver 60-sek bin. Pearsons korrelasjon coefficients mellom data innhentet fra menneskelig observasjon og ImageFZ analysen ble beregnet i hver test. Klikk her for å se større bilde.
Figur 6. Prosenter av frysing ble målt ved hjelp av automatiserte systemer og menneskelig observasjon i ubetingede og klimaanlegg grupper av mannlige C57BL/6J mus (n = 5, hver gruppe). (A) Menneskelig observasjon, (B) ImageFZ, (C) Freeze Monitor system 1 (1 sek 10 sek), (D) Freeze Monitor system 2 (2 sek 10 sek), og (E) Freeze Monitor system 3 (Latency3). Gruppe sammenligninger ble utført ved hjelp av to-veis gjentatte tiltak ANOVA etterfulgt av t-tester (unconditioned gruppe vs betinget gruppe, *, P <0,05; †, p <0,01). Data innhentet ved hjelp ImageFZ var lik de scoret gjennom menneskelig observasjon. Klikk her for å se større bilde.
Figur 7. Korrelasjon og frekvens fordeling av forskjellene mellom den dypfryste prosenter, målt ved hjelp av automatiserte systemer og menneskelig observasjon. (AB) Scatter plott og Pearsons korrelasjonskoeffisienter mellom frysing prosenter scoret gjennom automatiserte systemer og menneskelig observasjon er vist. Frysing prosenter, beregnet ved hjelp av ImageFZ, var sterkt korrelert med de som oppnås gjennom menneskelig observasjon. (CF) Forekomster av mindre enn en 10% forskjeldifferansen mellom frysing prosentfordelingen fra automatiserte systemer vs menneskelig observasjon var høyest når dataene analyseres ved hjelp ImageFZ ble sammenlignet med de som analysert gjennom menneskelig observasjon. Klikk her for å se større bilde.
| ANOVAs | |||
| Tilstand | Tid | Tilstand x Tid | |
| Dag 1 (condition) | |||
| Menneskelig | F (1,8) = 28.53, p = 0,0007 | F (7,56) = 20.79, p <0,0001 | F (7,56) = 16,58, p <0,0001 |
| ImageFZ | F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 | F (7,56) = 21,40, p <0,0001 | F (7,56) = 11.69, p <0,0001 |
| Freeze Monitor (1sec10sec) | F (1,8) = 5.16, p = 0,0528 | F (7,56) = 2.39, p = 0,0329 | F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 |
| Freeze Monitor (2sec10sec) | F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 | F (7,56) = 3.44, p = 0,0039 | F (7,56) = 1.52, p = 0,1803 |
| Freeze Monitor (Latency3) | F (1,8) = 4.44, p = 0,0682 | F (7,56) = 9.94, p <0,0001 | F (7,56) = 4.33, p = 0,0007 |
| Dag 2 (kontekst) | |||
| Menneskelig | F (1,8) = 42,94, p = 0.0002 | F (4,32) = 1.91, p = 0,1336 | F (4,32) = 1.48, p = 0,2302 |
| ImageFZ | F (1,8) = 49,61, p = 0.0001 | F (4,32) = 2.06, p = 0,1087 | F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 |
| Freeze Monitor (1sec10sec) | F (1,8) = 20,28, p = 0,002 | F (4,32) = 1.63, p = 0,1918 | F (4,32) = 0.55, p = 0,6997 |
| Freeze Monitor (2sec10sec) | F (1,8) = 40,20, p = 0.0002 | F (4,32) = 2.66, p = 0,0504 | F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 |
| Freeze Monitor (Latency3) | F (1,8) = 35,30, p = 0.0003 | F (4,32) = 2.49, p = 0,0626 | F (4,32) = 1.09, p = 0,3793 |
Tabell 1. Sammenligninger av statistikk.
Discussion
Den kontekstuelle og spolt frykt condition test er en av de mest brukte paradigmer for å vurdere læring og hukommelse. Denne testen er en form for Pavlovian condition som en forening er gjort mellom en kontekst og / eller en betinget stimulus (auditiv cue) og en motvilje stimulus (elektrisk footshock). Etter enda en enkelt sammenkobling av konteksten / auditiv kø og footshock, mus vise langvarig frysing når møtt med enten den kontekst eller stikkordet. I denne testen blir fryse oppførsel brukt som en indeks av frykt minne. Farmakologiske og lesjon studier har avdekket at minnet formasjon, konsolidering, og gjenfinning er regulert av flere områder av hjernen, som amygdala, hippocampus, og prefrontal cortex 3,33-35. I tillegg har molekylære genetiske studier demonstrerte betydningen av spesifikke gener og molekyler som er involvert i læring og hukommelse i disse områder av hjernen ved hjelp av genmodifisert mus 36. Derfor er denne testen simple og nyttig for å utforske den nevrobiologisk grunnlag underliggende frykt læring og hukommelse. I denne filmen artikkelen vi introduserte vår protokoll for å gi forskere med detaljert informasjon for å forstå og lett å utføre testen.
Frysing atferd ble kvantifisert gjennom direkte observasjon av menneskelige forskere. En godt trent eksperimentator er forventet å produsere pålitelige, stabile resultater på tvers av observasjoner. Imidlertid innebærer denne metoden potensielle problemer, for eksempel forskjeller i observasjonsmetode, observatør skjevheter, og enkle kvantifisering feil, noe som gjør det vanskelig å direkte sammenligne resultatene fra uavhengige forskere og ulike laboratorier. En automatisert photobeam-basert datamaskin målesystem har også blitt brukt 26,30-32. Men dette systemet presenterer også potensielle problemer med å måle fryse atferd. På grunn av sensorordningen, kan dette systemet være i stand til å oppdage små hodebevegelser som ville typislly scores som "aktiv" gjennom menneskelig observasjon. I tillegg kan skjelving under frysepunktet anses som nonfreezing fordi når et dyr fryser, intermitterende avbrudd i photobeam er observert som følge av skjelving. Som en alternativ metode, har automatiserte image-og video-analyse systemer er utviklet 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 beskrevet noen systemer med bildeanalyse programmer som har god validitet og scorer iskaldt godt 17,20,37-38. Imidlertid er de fleste av disse systemer og analyseprogram må skaffes fra kommersielle leverandører og er vanligvis kostbare. Vi utviklet ImageFZ program for analyse av frysing atferd, og dette programmet er distribuert som et gratis program. ImageFZ oppdager musen som en kropp av piksler (en partikkel) og diskriminerer subtile musebevegelsen som "fryser" eller "non-fryser" avhengig av hvor myeområde av ikke-overlappende regioner mellom partikler av hvert par av etterfølgende bilder. Som vist i de representative resultater, målinger ved hjelp av ImageFZ programmet er i samsvar med, eller mer nøyaktig enn oppnådd ved hjelp av andre metoder. Dermed måler ImageFZ programmet automatisk atferd som menneskelige observatører dømme som frysing ved hjelp av definerte kriterier. I tillegg beregner ImageFZ programmet den tilbakelagte avstanden (cm) før, under og etter eksponering footshock, tilrettelegge for en vurdering av den sjokkfølsomhet og analyse av det fryse oppførsel.
Metodiske forskjeller mellom laboratorier. Disse forskjellene kan resultere i vanskeligheter med å sammenligne data mellom laboratorier og i replikere resultatene i ulike laboratorier. For å oppnå en mer stabil og sammenlignbare data, er det nødvendig å standardtestprotokoll så mye som mulig. Analysesystem med ImageFZ fører til automatisering av testprosedyrer, noe som kan bidra til åstandardisering av protokoller som brukes på tvers av laboratorier.
Flere atferdsmessige reaksjoner må vurderes når analysere frysing atferd. Først når dyrene står overfor en fryktelig situasjon, kan de flykte i stedet for å fryse 39. Flykt er en av frykt svar, og forekomsten vil føre til underslår frykt minne. For det andre kan fryse avhenge av en generell aktivitet, og aktiviteten i eksperimentelle og kontrollmus må undersøkes. For eksempel, selv om mus mangler M1 muskarine acetylcholin-reseptoren viste reduserte nivåer av frysepunktet, sammenlignet med villtype-mus, forskjellige adferdstester viste at resultatene kan tilbakeføres til sin hyperaktivitet fenotype i stedet for deres svekket hukommelse 18.. ImageFZ beregner avstanden (cm) reiste av fagene. Dataene er tilgjengelige for å undersøke hvorvidt forskjeller i de generelle aktivitetsnivå mellom fag. Hvis det er en gruppe forskjelldistanse, en mulig tilnærming til problemet er å vurdere avstanden reist i løpet av første 2 min av trening som grunnlinje aktivitet og å bruke en undertrykkelse ratio (undertrykkelse ratio = (aktivitet under testing) / (aktivitet under baseline + aktivitet under testing)) som en sekundær indeks av frykt 17,40. Endelig kan en forskjell i smertefølsomhet, indusere endringer i reaktiviteten til en elektrisk footshock eventuelt resultere i variasjoner i fryse oppførsel. ImageFZ beregner også den tilbakelagte avstanden (cm) i detalj fra 2 sekunder før en eksponering av en 2 sek footshock til to sekunder etter eksponeringen (for 6 sek), som kan bli brukt som en indeks på footshock følsomhet.
Video-analyse-systemer er blitt utviklet for å måle fryse oppførselen til albino, svart, agouti, og fortynn brune mus. ImageFZ bruker en svart gulv skuffen og svarte tavler for å undersøke hvit mus (se Figur 1B). De svarte tavler er laget av spes ally behandlet metaller belagt med svart maling, og har en elektrisk ledningsevne lik den av de noncoated metallnett, som vanligvis brukes for svart mus. ImageFZ analyserer også frysing atferd hos rotter og andre gnagere gjennom justeringer av programparameterne. I den nåværende versjonen av ImageFZ, er oppførselen til faget er tatt opp med et videokamera fra toppen veggen for å analysere frysing. ImageFZ kan også brukes i et oppsett hvor bildene tatt fra den side av kammeret. I tillegg styrer ImageFZ maksimalt 4 apparatur. Denne funksjonen gjør det mulig for forskeren å samtidig undersøke fire mus, noe som sparer tid og reduserer de potensielle påvirkninger fra forskjeller i gjennomføringstiden for hvert fag og testing orden på atferd. Dermed forenkler ImageFZ testprosedyren og analyse av frysing atferd, og dette programmet forenkler testing med mindre arbeidskraft og uten noen opplæring for de atferdsmessige eksperimenter.
e_content "> I Miyakawa lab, har vi vurdert mer enn 110 stammer av genmanipulerte mus og villtype kontroll mus i den kontekstuelle og spolt frykt condition test ved hjelp av videoanalysesystem for å belyse virkningene av et gitt gen på læring og hukommelse 41-42 Vi har fått et stort sett med rådata for mer enn 5000 mus Rådataene som ble brukt for publiserte forskningsartikler 4-16 inngår i "Mouse Phenotype Database 'som en offentlig database (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Den nåværende filmen artikkelen gir detaljert informasjon om detaljene i vår eksperimentell prosedyre, og fremmer forståelse av testing situasjon.Disclosures
Vi bekrefter at det er ingen kjente interessekonflikter knyttet til denne publikasjonen og det har vært noen betydelig økonomisk støtte til dette arbeidet som kunne ha påvirket utfallet.
Acknowledgments
Noen av dataene er vist her ble innhentet i laboratoriet av Dr. Jacqueline N. Crawley i det amerikanske National Institute of Mental Health og vi ønsker å takke henne for å tillate oss å vise dataene i papiret. Vi takker også Kazuo Nakanishi for hans hjelp i å utvikle ImageFZ program for atferdsanalyse. Denne forskningen ble støttet av Grant-i-Aid for Scientific Research (B) (21300121), Grant-i-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Comprehensive Brain Science Network) fra departementet for utdanning, vitenskap, idrett og kultur i Japan , gi fra Neuroinformatics Japan Center (NIJC), og tilskudd fra CREST av Japan Science and Technology Agency (JSO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O’Hara & Co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O’Hara & Co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O’Hara & Co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O’Hara & Co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O’Hara & Co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O’Hara & Co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
References
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , John Wiley & Sons. New York. (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E.
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
