Summary
Denne artikel præsenterer en protokol for en kontekstuel og cued frygt condition test med en video analyse system til at vurdere frygt indlæring og hukommelse i mus.
Abstract
Den kontekstuelle og cued frygt condition test er en af de adfærdsmæssige test, der vurderer evne mus til at lære og huske en sammenhæng mellem miljømæssige signaler og afskrækningsmiddel erfaringer. I denne test anbringes musene i en konditioneringskammeret og får afklip af en betinget stimulus (en auditiv cue) og en aversiv ubetinget stimulus (en elektrisk fodchok). Efter en tidsforsinkelse musene udsat for samme konditioneringskammeret og en anderledes formet kammer med præsentation af den auditive stikord. Frysning adfærd under testen måles som et indeks af frygt hukommelse. At analysere adfærden automatisk, har vi udviklet en video analysere systemet ved hjælp af ImageFZ software program, som er tilgængelig som en gratis download på http://www.mouse-phenotype.org/. Her for at vise detaljerne i vores protokol, viser vi vores procedure for kontekstuelle og cued frygt condition test i C57BL/6J-mus bruge ImageFZ system. Derudover har vi valideret vores protokol og videoen analysere systemets ydeevne ved at sammenligne frysning tid målt ved ImageFZ system eller en photobeam-baseret computer målesystem med at scoret af en menneskelig observatør. Som vist i vores repræsentative resultater, som er tilvejebragt af ImageFZ svarede til dem analyseret ved en menneskelig observatør, der angiver, at den adfærdsmæssige analyse under anvendelse af ImageFZ system er meget pålidelige. Den nuværende film artikel giver detaljerede oplysninger om de testprocedurer og vil fremme forståelsen af den eksperimentelle situation.
Introduction
Den kontekstuelle og cued frygt condition test er den adfærdsmæssige paradigme anvendes til at vurdere associativ frygt indlæring og hukommelse hos gnavere 1-3. Denne test har været meget anvendt til at forstå de neurobiologiske mekanismer frygt indlæring og hukommelse i transgene og knockout-mus 1,4-16. Frysning adfærd, der er defineret som fuldstændig ubevægelighed med undtagelse af vejrtrækning, er en fælles reaktion på frygtsomme situationer. I denne adfærdsmæssige paradigme, efter at dyrene er udsat for en parring af en auditiv cue med en elektrisk fodchok, de reagerer på frygt-producerende stimulus ved at vise frysning adfærd, som måles som et indeks for associativ frygt indlæring og hukommelse. Denne test kræver mindre omfattende udstyr, mindre fysisk anstrengelse af investigator, og meget mindre træningstid for mus end andre indlæring og hukommelse opgaver, det kræver generelt ca 5-10 min / dag per mus i 2 dage. Selv om testproceduren er simple og kræver lidt tid til at udføre, skal investigator omhyggeligt observere og måle mus adfærd, og derfor har flere automatiske målesystemer er udviklet til at gennemføre adfærdsanalyse 17-20. Vores video-analyse-system, som vi har udviklet med ImageFZ software program, der giver os mulighed for nemt at analysere adfærd frysning og producere meget pålidelige resultater. Denne artikel indeholder detaljerede oplysninger om vores testprocedure og beskriver, hvordan du bruger ImageFZ program.
Protocol
Alle eksperimenter bør udføres i henhold til den vejledning og protokoller etableret af lokale Animal Care og brug udvalg.
1.. Apparatur Setting
- Apparatet til konditionering og sammenhæng test er en firkantet kammer med en elektrificeres gitter gulv, en lydkilde, og et kalibreret chok generator. Forskellige kammer størrelser anvendes, med dimensioner, der varierer fra 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 til 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. I denne protokol, apparatet består af en akryl firkantet kammer (33 cm x 25 cm x 28 cm, transparent i de forreste og bageste vægge, hvide i sidevæggene) med metalgitre (0,2 cm i diameter, anbragt med 0,5 cm fra hinanden) er dækket af en gennemsigtig akryl låg (figur 1A). Det er nødvendigt at placere kammeret på en hvid akryl gulv (figur 1B) for at analysere adfærden for sorte, agouti, eller udvande brune mus, fordi et billede analyse-system med ImageFZ software program (tilgængelig til gratis download, se tabel af materialer / reagenser) skelner et mørkt emne fra en hvid baggrund i hvert optagne videobillede. Albino mus kan også testes ved hjælp af black metal net og en sort akryl gulv (figur 1B). Light-emitting diode (LED) lyser er fastgjort til loftet over apparatet. Gittergulvet belyses ved 100 lux ved LED-lys. En højttaler er forbundet til et hvidt støj / tonegenerator (figur 1C) er monteret på et loft 5 cm over låget for at præsentere en auditiv cue (en hvid støj, 55 dB) som en betinget stimulus (CS). Nettene er koblet til et chok generator (Figur 1C) til at levere en elektrisk fodchok som ubetinget stimulus (US). Testkammeret er placeret i et lydisoleret rum (170 cm x 210 cm x 200 cm) (figur 1D) for at minimere ekstern støj under prøverne. Denne betingelse forhindrer også de mus, der ikke i øjeblikket udsat for enteste høre en auditiv cue eller vokalisering af forsøgsmusene.
- Apparatet til cued prøve er sammensat af et kammer, som har forskellige egenskaber fra konditioneringskammeret, hvilket giver en ny sammenhæng. Det er bydende nødvendigt at ændre de sensoriske signaler så meget som muligt, således at musen opfatter romanen sammenhæng som værende relateret til konditioneringskammeret. Generelt er en anderledes formet kasse eller en trekantet kammer anvendes. Desuden er forskellige lysforhold og / eller olfaktoriske tidskoder også til musen. I denne protokol, apparatet er en akryl trekantet kammer (33 cm x 29 cm x 32 cm, hvid i hver sidevæg) med en flad, hvid gulv for sorte, agouti, eller udvande brune mus eller en flad, sort gulv til albino mus, dækket med en gennemsigtig akryl låg (fig. 1E). LED-lys er knyttet til loftet over apparatet. Belysningen af gulvet er sat til 30 lux. En højttaler er monteret på loftet 5 cm over låget til PRESENT en auditiv cue, der er den samme som den, der gives musene på tidspunktet for condition. Den trekantede kammer er placeret i et andet lydisoleret rum fra det rum, hvor konditionering og sammenhæng test er udført.
- Hvert kammer er udstyret med en loftmonteret Charge Coupled Device (CCD) kamera tilslutning til en Windows-computer via quad video splitter og USB billedoptagelse enhed til at overvåge musens adfærd, og billeder af apparatet og musen er fanget og analyseret af applikationssoftware program ImageFZ (se protokol 6). Hvid støj og fodchok generatorer er automatisk styret af ImageFZ software program, starttidspunkt og varighed af hvid støj og fodchok skal skrives ind i en tekstfil (se et eksempel tekstfil "simple-cond ', der vises i videoen for detaljer om, hvordan de parametre, er skrevet i filen), som læses ind i programmet.
- Før hver test begynder, akryl væggeog gulve tørres med et håndklæde dyppet i super hypochlorsyrling vand (pH 6-7), og gitrene er renset med 70% ethanol for at forhindre en bias baseret på olfaktoriske signaler. Gitrene tørres med ethanol i stedet for super hypochlorsyrling vand for at sikre, at nettene ikke mindske deres elektriske ledningsevne på grund af rust.
2. Animal Forberedelse
- Generelt er 03:58 mus opstaldet per bur i en temperatur-kontrolleret bedrift værelse (23 ± 2 ° C) med en 12 timers lys / mørke-cyklus (f.eks lys på 7:00 AM).
- I denne protokol, til at mindske eventuelle påvirkninger af bur transport på adfærd og til at tilpasse mus til den eksperimentelle miljø, Burene med musene overføres fra dyr bedrift rum til et lydisoleret venteværelse støder op til et lydisoleret test værelse mindst 30 min før hver test begynder.
- Alle eksperimenter (figur 2a) skal udføres i løbet af same periode i lys eller mørk fase hver dag for at minimere de adfærdsmæssige variationer produceret ved at teste på forskellige tidspunkter 23,24. I denne protokol, er alle af forsøgene udført mellem 1 time efter udbrud af lys fase og 1 time før begyndelsen af den mørke fase (fra 8:00 til 18:00 i lyset fase). Hvis kun én apparat er til rådighed, bør mus af hver genotype testes i en opvejet for at reducere potentielle virkninger af den eksperimentelle tid og afprøvning rækkefølgen af emner på adfærdsmæssig præstation. ImageFZ kan styre op til 4 apparater. Test 4 mus samtidigt ved hjælp af 4 apparater i en opvejet orden tillader forskeren at spare tid og reducerer de mulige virkninger af de eksperimentelle parametre på mus adfærd.
3. Conditioning
- Musene anbringes i konditioneringskammeret, og musene typisk lov til frit at undersøge kammeret til 120 sek. Derefter auditory cue, såsom en hvid støj, tone og auditive klikkertræning, præsenteres som en CS i 30 sek, og en 0,1-0,8 mA fodchok er givet til mus som en amerikansk løbet af de sidste 2 sek af lyden. Præsentationen af CS-US skrælle gentages for at styrke foreningen. Musene er tilbage i kammeret til et tidsrum efter den sidste præsentation til yderligere at etablere forbindelsen mellem forbindelse med kammeret og aversiv oplevelse. I denne protokol, efter 120 sek af fri udforskning, er en auditiv cue (hvid støj 55 dB) præsenterede i 30 sek, og en 0,3 mA fodchok leveres kontinuerligt under sidste 2 sek af den hvide støj. Efter 90 sekunder, er parring af den auditive cue med fodchok gives til forsøgspersoner igen. Præsentationen af CS og USA gentager tre gange per session (120, 240, og 360 sek efter begyndelsen af konditionering) (figur 2B). Efter den endelige fodchok musene uforstyrret i kamrene i 90 sek.
- Før konditionering sessionen begynder, køre ImageFZ software program, skal du vælge plug-in menu 'FZ Conditioning og FZ Online (4 kammer) ", og fastsætter parameterværdier trin-for-trin som følger.
- Trin 1: Projekt ID. Angiv en mappe, hvor du vil gemme dine datafiler.
- Trin 2: Session Name. Skriv alle ord, fx den eksperimentelle dato i 'Session' boksen, og vælg en reference tekst fil, hvor starttidspunkt og varigheden af den hvide støj og fodchok er skrevet, i 'reference' boksen. En prøve tekstfil vises i videoen.
- Trin 3: parameterindstillinger. Indtast parameterværdierne i hver kasse som følger.
- Rate (frame / sek): frame rate af billedet erhvervelse, fx 1 billede / sek.
- Varighed (sek): i tilfælde af konditionering, den samlede varighed er 480 sek.
- Bin varighed (sec): fx 60 sek data analyseres i hver blok60 sek.
- Emne størrelse - min (pixel): ImageFZ registrerer en mus og støj som sorte partikler (nogle masse af pixels) i en hvid baggrund i hvert billede. Når området af den sorte partikel (pixels) er mindre end den 'Emne størrelse - min (pixels) "værdi (fx 100 pixels) partiklerne betragtes som støj og er udelukket fra billedanalyse.
- Emne størrelse - max (pixel): når størrelsen af de sorte partikler er mere end størrelsen af den »Emne størrelse - max (pixels)» værdien partiklerne udelukket fra analysen.
- Ramme størrelse - bredde / højde (cm): kammer dimension, dvs 33 cm bred og 25 cm høj.
- Frysning kriterium (pixels): fx 30 pixels, se detaljerne i protokol 6.
- Frysning varighed - min (sec): fx 2 sek, og når der ikke registreres nogen musen for kun mindre end 2 sek, er dens adfærd ikke regnes som »indefrysning«.
- Shock sats (frame / sek): se detaljerne i protokol 6.
- Trin 4: Emne id. Indtast emnet identifikation.
- Trin 5: kameraindstillinger. Styre lysstyrken og kontrasten i billedet.
- Trin 6: Threshold indstillinger. Juster tærskelværdierne til at opdage en sort mus som sorte pixels i en hvid baggrund i hvert billede og bedømme mus adfærd som »indefrysning« eller »ikke-frysning (se detaljerne i protokol 6). At analysere en albino mus, skal du klikke på afkrydsningsfeltet 'invert mode', og juster tærskelværdierne korrekt.
- Trin 7: Indstil Cage Field. Angive inden for hvert kammer, som du ønsker at fange. Når du har klikket det rektangel knappen i værktøjskassen, tegne et rektangel rundt på gulvet af kammeret på live-billedet vinduet. Dernæst skal du vælge kammeret nummer og klik på knappen "Set". Klik til sidst på knappen "FÆRDIG".
<li> Når indstillingerne parameter er indstillet, bør der gives en forberedende test med praksis mus (mus ikke anvendes som fag), før den første test af dagen for at afgøre, om billedet analysere systemet og hvid støj / udladninger fungere uden problemer. - Flytte et hjem bur indeholdende praksis mus til den lydisoleret test værelse fra tilstødende venteværelse, og læg hver mus i konditioneringskammeret. Umiddelbart efter anbringelse af mus i kammeret, ved at klikke på startknappen på ImageFZ. Ansøgningen software vil præsentere auditive signaler og / eller elektriske footshocks til musene i den rækkefølge, du angiver i en reference fil.
- Efter 480 sek er gået, returnere musene til deres hjem bur og returnere buret til hylden på bedriften værelset.
- Rengør kamrene omhyggeligt. Så 'Næste Analysis', klik, og gentage trin 3.2.4-3.6 for forsøgsmusene.
- ImageFZ butikker bor og spore billederne i TIFF-format. Programmet giver mulighed foros til at udføre en offline analyse genanalysere billederne med ændrede parameterværdier. Hvis du foretage en offline analyse, skal du vælge plug-in menu 'Fear Conditioning og FZ Offline', og vælge de data mappe, du ønsker at reanalyze. Derefter Indtast parameterværdierne igen, og klik på knappen "FÆRDIG".
4.. Context Test
- Efter konditionering sessionen er afsluttet, musene returneres til samme konditioneringskammeret og scoret til frysning adfærd at måle kontekstuelt betinget frygt (kontekst test). En forsinkelse intervallet mellem konditionering og forbindelse testen er generelt sat til 24 timer. I denne protokol, for at vurdere de seneste hukommelse og ekstern hukommelse (målt ved test 1 dag og mere end 28 dage efter konditionering, henholdsvis) 25 musene udsat for kontekst testen ca 24 timer og 30 dage efter konditionering session. Musene anbringes i conditioning kammer og får lov til frit at udforske det kammer til 300 sek uden CS og amerikanske præsentationer (Figur 2C).
- Kør ImageFZ software program og indstille programmet softwarens parameterværdier på samme måde som i conditioning (se afsnit 3.2.3), men ændre varigheden af denne test til 300 sek, og vælg en reference tekstfil for sammenhæng test . Efter ændring af indstillingen, bør der gives en forberedende test med praksis mus for at kontrollere ImageFZ system.
- Placer hver mus i konditioneringskammeret og klik på knappen Start. Efter 300 sek er gået, returnere mus i deres hjem bur, og forlade buret uforstyrret indtil cued testen begynder.
- Rengør kamrene. Så 'Næste Analysis', klik, og gentag trin 4,3-4,4 i forsøgsmusene.
5.. Cued Test
- Cued testen udføres på den samme dag i forbindelse prøve eller den næste dag.I denne test anbringes musene i en anden test kammer med meget forskellige egenskaber, giver en ny kontekst, der er relateret til konditioneringskammeret i 3 minutter. Ved afslutningen af den første 3 min, er det auditive cue, der er præsenteret på tidspunktet for konditionering givet til mus i 3 min i romanen sammenhæng miljø. I denne protokol, er cued test et par timer efter den kontekst testen. Mus får lov til at udforske den trekantede kammer til 360 sek. I den første 3 min, hverken en CS eller amerikansk præsenteret, og derefter er en CS (en 55 dB hvid støj) præsenterede for de sidste 3 min.
- Kør ImageFZ software program og indstille parameterværdier på samme måde som i condition, undtagen ændre varigheden af testen til 360 sek, og vælg en reference tekstfil for cued test. Efter justering af indstillingen, bør der gives en forberedende test med praksis mus for at kontrollere ImageFZ system.
- Placer hver mus i den trekantede kammer og klik startknappen. Efter 360 sek er gået, returnere musene til deres hjem bur og returnere buret til hylden af bedriften rummet.
- Rengør kamrene. Klik derefter på 'Næste Analysis' knappen og gentag trin 5,3-5,4 i forsøgsmusene.
- For yderligere at teste ekstern hukommelse, skal du gentage protokollerne 4-5 omkring 30 dage efter konditionering session (figur 2A).
6.. Image Analysis
- Udføre indsamling og analyse af data automatisk ved hjælp ImageFZ. Denne software program er baseret på det offentlige område ImageJ program (udviklet af Wayne Rasband ved National Institutes of Health og tilgængelig på http://rsb.info.nih.gov/ij/), ændret ved Tsuyoshi Miyakawa (ImageFZ applikationssoftware , kan downloades gratis, se tabel af materialer / reagenser).
- For alle eksperimenter, tage billeder ved en given frame rate (fx 1 fps) med ImageFZ hjælp af en USB video capture enhed, herunder envideokamera. For at måle distance fra hinanden følgende billeder, justere 'tærskel min' værdi af programmet (f.eks 80 pixel), som er sat til segment billederne i en sort partikel (en mus) og en hvid baggrund. Den tilbagelagte afstand beregnes ud fra afstanden mellem hvert sæt af xy koordinater for tyngdepunktet af partiklen i på hinanden følgende billeder.
- For at måle den indefrysning adfærd fra de på hinanden følgende billeder, justere 'tærskel min (xor) »værdien af programmet (f.eks 160 pixels), som er sat til segment billederne ind i et sort partikel (mus) og baggrund, og derefter beregne mængden af areal (pixel) i nonoverlapping regionerne mellem partikler af hvert par af på hinanden følgende billeder. Juster værdien ved hjælp af skyderen tærskel værktøj, indtil den sorte partikel i hvert billede passer til formen af hele kroppen af musen eksklusive halen. Hvis området af nonoverlapping region ligger under "kriterium frysning 'værdi (fx 30 pixels), er den adfærd, anses for at være» indefrysning «(figur 3), som er generelt defineret som den fuldstændige mangel på enhver bevægelse bortset åndedræt og hjerteslag. Når området overstiger denne værdi, adfærd anses for at være ikke-frysning '(figur 3). Dommen bør gøres baseret på definitionen af frost. Mus til tider udviser en subtil bevægelse og en momentan immobilitet, som måske ikke kan betragtes som en indefrysning adfærd, der afspejler frygt. Immobilitet, der varer for en kort tid (fx mindre end 2 sek), hvilket sandsynligvis forskellig fra den manifestation af frygt, kan udelukkes fra analysen ved at sætte tidsgrænse for frost. For at indstille tiden tærskel, input "Frysning varighed - min (sec)» værdien (f.eks 2 sek.)
- Det ImageFZ programmet automatisk calculates den tilbagelagte afstand (cm) og den procentdel af frost. Resultaterne gemmes i tekstfiler, og leve og spore billeder gemmes i en TIFF-format. For at måle distance (cm) som et indeks for elektrisk fodchok følsomhed, den ImageFZ programmet også erhverver billeder med en høj frame rate (fx 4 fps) til 6 sek, målt fra 2 sek før leveringen af en 2 sek fodchok indtil 2 sek efter fodchok i online analyse. Sådan indstiller frame rate for billedoptagelse før, under og efter fodchok, indtaste en værdi i feltet 'Shock sats (frame / sek)' boksen. Efter online-analyse, udføre offline analyse ved at vælge et plug-in menu 'FZ Shock Offline' at indhente data for distance.
- Parameterværdierne for den ImageFZ programmet bør være optimeret til at generere resultater, der ligner dem, der opnås ved de menneskelige observatører i de forberedende tests. For manuel scoring er indefrysning adfærd kontinuerligt målt ved hjælp af en stopwatch og en event-optagelse-program eller en øjeblikkelig procedure tid prøvetagning hver 3-10 sek under analyse ved hjælp ImageFZ software. To observatører typisk gennemføre adfærdsmæssige observation. For at justere parameterværdierne for ImageFZ program for at sikre, at resultaterne af billedanalyse er i overensstemmelse med de menneskelige observatører, udføre en offline analyse af ImageFZ program, modificere 'tærskel min (xor) «og» indefrysning kriterium værdier . For at udføre offline analyse, skal du vælge plug-in menu 'FZ Offline "og indtaste eventuelle parameterværdier.
7.. Fejlfinding
- Hvordan kan ImageFZ program fås og installeres?
Det ImageFZ program er til rådighed for gratis download fra vores hjemmeside (se tabel af materialer / reagenser), og kører på en Windows-computer. Download zip-mappe til ImageFZ og installere softwaren på din computer. Se 'readme.txt' fil for installatipå detaljer og følge trin-for-trin instruktioner. - Hvorfor er fejlmeddelelsen 'Fejl indstilling capture enhed' vises?
Kontroller tilslutningen af kameraets kabel og din driver installationen af USB billedoptagelse enhed. Hvis der ikke er noget problem med indstillingerne, så ImageFZ software fungerer muligvis ikke med din billedoptagelse enhed. Se 'readme.txt' fil hensyn til den relevante enhed til brug med ImageFZ software. - ImageFZ kan ikke registrere hele kroppen på musen som en partikel.
Indstil værdien af 'tærskel min «og / eller» tærskel min (xor) "lavere end den nuværende værdi. Hvis ImageFZ ikke kan registrere musen på et bestemt sted, fx hjørnet af en test kammer, så utilstrækkelige forhold test, såsom en ensartet belyst gulv eller en lidt kontrasterende forskel mellem musen og baggrunden, kan eksistere. For at løse dette problem, skal du justere parameterværdierne (fx - Billedoptagelse på en høj frame rate sinker computeren under online-analyse.
Indstil frame rate til en lavere værdi end den aktuelle kurs, og udføre online-analyse. Den ImageFZ analyse, billede erhvervelse ved 1 fps, er tilstrækkelig til nøjagtigt at måle frysning, som vist i den repræsentative resultater sektionen. - Resultaterne af ImageFZ analyse er ikke enig med dem af menneskelig scoring.
Undersøg det lagrede billede og dom resultat filer. Hvis ImageFZ overvurderer frysning, skal du indstille "indefrysning kriteriet 'til en lavere værdi end den aktuelle værdi, og udføre offline analyse. Hvis ImageFZ undervurderer frysning, skal du indstille "indefrysning kriteriet 'til en højere værdi end den aktuelle værdi. - I optogenetical og in vivo elektrofysiologiske experiments, fiber kabel fastgjort til hovedet af musen forstyrrer dom for frost.
Frakke kablerne i hvid til en sort mus, og ændre placering og vinkel på kameraet, indtil kablerne ikke opdages. - Hvad der er behov for det offline analyse?
Opret en mappe med navnet 'Image_FZ "i rodbiblioteket på ImageFZ programmet. I denne mappe, oprette undermapper 'Billeder' og 'Sessions'. Flyt en 8 bit gråskalabilledet til mappen 'Billeder', og oprette en tekstfil, hvor billedfilen navn er skrevet i 'Sessions' mappe. Derefter køre ImageFZ offline analyse, og følg vejledningen i programmet.
Representative Results
I frygt condition test, menneskelige eksperimentatorer anvendes til at kvantificere indefrysning adfærd gennem arbejdsintensiv direkte observation 26-29, men for nylig photobeam-baseret computer måling (f.eks "Freeze Monitor"-system), og image-analysere systemer har været anvendt til automatisk måle indefrysning adfærd 26,30-32. ImageFZ er en automatiseret image-analyse-system, der producerer resultater, der er sammenlignelige med dem, der opnås gennem menneskelig observation, som beskrevet nedenfor. Her har vi sammenlignet resultaterne af menneskelig observation med de ImageFZ analyse under varierende parametre: "Rate (frame / sek) 'og' Frysning kriterium (pixels). I dette eksperiment, fem mandlige C57BL/6J-mus (gennemsnitlig kropsvægt ± SD (g), 31,4 ± 3,55, betyder kropsstørrelse ± SD (pixels), 351,6 ± 62,2) blev anvendt i 15-27 ugers alderen. Den menneskelige observation blev foretaget ved hjælp af en event-optagelse-program (en Macintosh OS9 software program), en nøgle-presning begivenhed, der fortsætterd 2 sekunder eller mere, når en mus viste et anfald af ingen bevægelse blev betragtet som »indefrysning«. Procentdelen af nedfrysning blev beregnet hver 60 sek i hver test, og anvendes til korrelation analyser. Den procent af nedfrysning scoret af de 2 observatører (interobserver pålidelighed, for konditionering, r = 0,879, for kontekst test, r = 0,957, for cued test, r = 0,866, for alle tilfælde, r = 0,888) blev i gennemsnit til at generere et menneske score. Korrelationer mellem de fryse procenter målt gennem ImageFZ med hver frame rate (dvs. 1, 2 og 4 fps), og dem, der opnås gennem de menneskelige observationer blev undersøgt. Som illustreret i figur 4 blev indefrysning procenter beregnes ved ImageFZ (1, 2 og 4 fps) korreleret med den gennemsnitlige værdi fra målingerne af de 2 observatører. Især optager billeder ved en højere frame rate ikke altid producere den bedste korrelation. Billedanalyse på 1 FPS genererede resultater svarende til dem, der opnås fra humane observatører each test. Korrelationer mellem de fryse procenter målt gennem menneskelige observationer og hjælp ImageFZ under hver betingelse af »Indefrysning kriterium (pixels)« (dvs. 20, 30, og 40 pixels) blev undersøgt. Indefrysningen procenter beregnes ved hjælp ImageFZ på 'Frysning kriterium (pixels), «i 20, 30, og 40 pixels blev i alle tilfælde, stærkt korreleret med dem, der opnås gennem de menneskelige observationer (figur 5). Som vist i figur 5D, når kriteriet indefrysningen er indstillet til en lav værdi, den subtile bevægelse af en mus, anses for at være »indefrysning« af menneskelige iagttagere, ville blive betragtet som "ikke-frysning 'Brug ImageFZ. Omvendt, hvis kriteriet er indstillet til en høj værdi, flytning af en mus, scorede som »ikke-frysning 'af menneskelige iagttagere, ville blive betragtet som» indefrysning «hjælp ImageFZ (figur 5C, 5F og 5I). Således at opnå de mest pålidelige resultater, hver parameter i ImageFZ program bør kalibreres osning af data scoret gennem menneskelige observationer i hver testmiljø.
Desuden sammenlignede vi resultater, som en menneskelig observatør, ved hjælp af en photobeam-baseret computer målesystem (Freeze Monitor-system), dem, der opnås ved hjælp af ImageFZ (se figur 6). Den menneskelige observatør blev blindet til gruppen behandling og resultaterne af ImageFZ scoring. For parameterindstillinger Freeze Monitor systemet, brugte vi 3 mål for andelen af frysning fra en tidligere valideret system 30. Kort fortalt, at antallet af 10 sekunders mellemrum, hvor dyrene krævede mere end 1 eller 2 sekunder til at krydse den første nye stråle af intervallet (1sek 10s og 2s 10sek, henholdsvis) og latenstiden mellem begyndelsen af hver 5 sek interval og den tredje nye lysafbrydelse inden for dette interval (Latency3) blev målt. De procentvise andele af de intervaller, hvorunder mus frysning eller procentdel af den samlede mængde tid required at bryde den tredje photobeam blev beregnet.
Procentdelene af frysning målt i hvert system er illustreret i fig. 6. Grupperne blev sammenlignet under anvendelse af to-vejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af t-tests (se tabel 1). Indefrysningen procenter målt ved hjælp ImageFZ (figur 6B) var mere ligner dem scoret gennem menneskelig observation (figur 6A) end de opnåede data ved hjælp af en photobeam-baseret system (figur 6C-E). Indefrysningen procenter målt ved hjælp af ImageFZ program i hver test var højt korreleret med dem, scoret gennem menneskelig observation (condition, r = 0,947, kontekst test, r = 0,970; cued test, r = 0,934), mens korrelationerne mellem indefrysning procenter målt ved hjælp af photobeam-baseret computer målesystem (1sek 10s, 2s 10sek eller Latency3) og menneskelig observatør var lavere (condition, r = 0,503, 0,593 og 0,761; kontekst test, r = 0,772, 0,819 og 0,912) i forhold til de sammenhænge mellem indefrysning procenter målt ved hjælp ImageFZ og menneskelig observation (7A og 7B). Desuden Figur 7 viser, at forskellene mellem de fryse procentandele, der fremkommer gennem menneskelig observation og ved hjælp ImageFZ i hver mus var de mindste forskelle. Disse resultater viste, at fryse procenter målt ved anvendelse ImageFZ svarede til dem, der opnås gennem menneskelig observation og at ImageFZ er meget nøjagtig, når måling af mængden af frysning.
Figur 1. Apparater til det kontekstuelle og cued frygt condition test. (A) En akryl firkantet kammer til konditionering og sammenhæng test, (
Figur 2. Skematisk fremstilling af protokollen. (A) Oversigt over den kontekstuelle og cued frygt condition test, (B)-condition (C) cBAGGRUNDEN test, og (D) cued test. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Billedanalyse af ImageFZ program. For hvert par af på hinanden følgende billeder, er det areal (pixels), hvorigennem musen bevæges beregnet ved ImageFZ. Når dette område er under en vis grænse (f.eks 30 pixel), er den adfærd, vurderes at være »indefrysning«. Når mængden af areal lig med eller overstiger tærsklen, er den adfærd, anses for at være "ikke-frysning. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Sammenligninger af indefrysning procenter beregnet ud fra billeder ved forskellige frame rates hjælp ImageFZ med dem, der måles gennem menneskelig observation. Frygt conditioning blev udført ved hjælp af mandlige C57BL/6J-mus (n = 5). Under prøverne, to observatører scorede indefrysning adfærd. Samtidig blev levende billeder taget ved 4 fps ved hjælp af ImageFZ programmet. De filer taget med 4 fps blev nedprioriteret efter udvinding rammer at svare til billeder taget ved 1 fps eller 2 fps. Parameterværdierne for "Rate (billede / sek)" blev sat til 1, 2 eller 4 fps og frysning procenter i hver 60 sek bin blev beregnet ud fra billedfiler ved hjælp ImageFZ offline analyse. Hver prik repræsenterer en procentdel af hver 60 sek bin frysning. Pearsons korrelationskoefficienter mellem data fra menneskelig observation og ImageFZ analyse blev beregnet.Klik her for at se større billede.
Figur 5. Indefrysningen procenter er beregnet ud fra billederne på forskellige indefrysning kriterium værdier ved hjælp ImageFZ og dem, der måles gennem menneskelige observationer blev sammenlignet. Frygt conditioning blev udført ved hjælp af mandlige C57BL/6J-mus (n = 5). Under prøverne, indspillet to observatører indefrysning adfærd, og de levende billeder blev taget med ImageFZ programmet. Indefrysningen procenter i hver 60 sek bin blev beregnet ud fra billederne (1 frame / sek) gennem ImageFZ offline analyse, indstilling parameterværdierne af »Indefrysning kriterium (pixels)" til 20, 30 eller 40 pixels. Hver prik repræsenterer en procentdel af hver 60 sek bin frysning. Pearsons korrelation coefficients mellem data fra menneskelig observation og ImageFZ analyse blev beregnet i hver test. Klik her for at se større billede.
Figur 6. Procentdelene af frysning blev målt ved anvendelse af automatiserede systemer og menneskers observation unconditioned og konditioneret grupper af han C57BL/6J mus (n = 5, hver gruppe). (A) menneskelige observation, (B) ImageFZ, (C) Frys Monitor-system 1 (1sek 10sek), (D) Frys Monitor System 2 (2s 10sek), og (E) Frys Monitor System 3 (Latency3). Gruppe sammenligninger blev udført ved anvendelse af to-vejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af t-test (unconditioned gruppe vs betinget gruppe, *, P <0,05, †, p <0,01). De opnåede data ved hjælp ImageFZ svarede til dem, scoret gennem menneskelig observation. Klik her for at se større billede.
Figur 7. Korrelation og frekvensfordelingen af forskellene mellem de indefrysning procenter, målt ved hjælp af automatiserede systemer og menneskelig observation. (AB) Scatter plots og Pearsons korrelationskoefficienter mellem frysning procentsatser scoret gennem automatiserede systemer og menneskelig observation vises. Indefrysningen procenter, beregnet ved hjælp af ImageFZ, var højt korreleret med dem, der opnås gennem menneskelig observation. (CF) Forekomst af mindre end en 10% diflem indefrysning procenter opnået fra automatiserede systemer vs menneskelig observation var højest, når de analyseres data ved brug ImageFZ blev sammenlignet med dem analyseret gennem menneskelig observation. Klik her for at se større billede.
| ANOVAs | |||
| Betingelse | Tid | Betingelse x Time | |
| Dag 1 (condition) | |||
| Menneskelige | F (1,8) = 28,53, p = 0,0007 | F (7,56) = 20,79, p <0,0001 | F (7,56) = 16,58, p <0,0001 |
| ImageFZ | F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 | F (7,56) = 21,40, p <0,0001 | F (7,56) = 11,69, p <0,0001 |
| Freeze Monitor (1sec10sec) | F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 | F (7,56) = 2,39, p = 0,0329 | F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 |
| Freeze Monitor (2sec10sec) | F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 | F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 | F (7,56) = 1,52, p = 0,1803 |
| Freeze Monitor (Latency3) | F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 | F (7,56) = 9,94, p <0,0001 | F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 |
| Dag 2 (kontekst) | |||
| Menneskelige | F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 | F (4,32) = 1,91, p = 0,1336 | F (4,32) = 1,48, p = 0,2302 |
| ImageFZ | F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 | F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 | F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 |
| Freeze Monitor (1sec10sec) | F (1,8) = 20,28, p = 0,002 | F (4,32) = 1,63, p = 0,1918 | F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 |
| Freeze Monitor (2sec10sec) | F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 | F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 | F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 |
| Freeze Monitor (Latency3) | F (1,8) = 35,30, p = 0,0003 | F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 | F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 |
Tabel 1. Sammenligninger af statistikker.
Discussion
Den kontekstuelle og cued frygt condition test er en af de mest anvendte paradigmer at vurdere indlæring og hukommelse. Denne test er en form for pavlovsk condition i, som en sammenslutning er indgået mellem en kontekst og / eller en betinget stimulus (auditiv cue), og et afskrækningsmiddel stimulus (elektrisk fodchok). Efter blot et enkelt parring af kontekst / auditive cue og fodchok, mus udviser langvarig frost, når de står med enten forbindelse eller stikord. I denne test er frysning adfærd anvendes som et indeks af frygt hukommelse. Farmakologiske og læsion undersøgelser har afsløret, at hukommelsen dannelse, konsolidering og genfinding er reguleret af flere områder af hjernen, såsom amygdala, hippocampus og præfrontale cortex 3,33-35. Desuden har molekylærgenetiske undersøgelser vist betydningen af specifikke gener og molekyler, der er involveret i indlæring og hukommelse i disse områder af hjernen ved hjælp af gensplejsede mus 36. Derfor er denne test er simpee og nyttigt for at udforske den neurobiologiske grundlag underliggende frygt indlæring og hukommelse. I denne film artikel introducerede vi vores protokol for at give eksperimentatorer med detaljerede oplysninger til at forstå og let at udføre testen.
Frysning adfærd blev kvantificeret gennem direkte observation af menneskelige eksperimentatorer. Der forventes en veluddannet forsøgslederen for at producere pålidelige, stabile resultater på tværs af observationer. Men denne metode indebærer potentielle problemer, såsom forskelle i observationsmetoden, observatør bias, og simple kvantificering fejl, hvilket gør det vanskeligt direkte at sammenligne resultaterne fra uafhængige eksperimentatorer og forskellige laboratorier. En automatiseret photobeam-baseret computer målesystem er også blevet anvendt 26,30-32. Men dette system giver også potentielle problemer med at måle indefrysning adfærd. På grund af følerindretningen, kan dette system være i stand til at detektere små bevægelser af hovedet, der ville typically blive scoret som "aktiv" gennem menneskelig observation. Desuden kan rysten under frysning betragtes som nonfreezing fordi når et dyr fryser, intermitterende afbrydelser i photobeam observeres som følge af rysten. Som en alternativ metode, har automatiseret billede-og video-analysesystem udviklet 17-20,37,38. ANAGNOSTARAS et al. 37. beskrev nogle systemer med billedanalyse software programmer, der har god gyldighed og score frysning godt 17,20,37-38. Imidlertid har de fleste af disse systemer og analyse programmer, der skal indhentes fra kommercielle leverandører, og er typisk dyre. Vi udviklede det ImageFZ software program til analyse af frost adfærd, og dette program er distribueret som et gratis program. ImageFZ registrerer musen som et organ af pixels (en partikel) og diskriminerer subtil mus bevægelse som »indefrysning« eller »ikke-frysning«, afhængig af mængden afområde af ikke-overlappende områder mellem partikler af hvert par af på hinanden følgende billeder. Som vist i de repræsentative resultater målinger ved hjælp af ImageFZ program er i overensstemmelse med eller mere præcise end opnået under anvendelse af andre metoder. Således ImageFZ programmet måler automatisk adfærd, menneskelige iagttagere dømme som frysning hjælp definerede kriterier. Desuden ImageFZ programmet beregner distance (cm) før, under og efter fodchok eksponering lette en vurdering af chok følsomhed og analyse af frysning adfærd.
Findes metodologiske forskelle mellem laboratorier. Disse forskelle kan resultere i vanskeligheder med at sammenligne data mellem laboratorier og i at gentage resultater i forskellige laboratorier. For at få mere stabile og sammenlignelige data, er det nødvendigt at standardisere forsøgsprotokollen så meget som muligt. Analysen system ImageFZ fører til automatisering af testprocedurer, som kan bidrage tilstandardisering af protokoller anvendes på tværs af laboratorier.
Flere adfærdsmæssige reaktioner skal overvejes, når man analyserer frysning adfærd. Først, når dyrene står over for en frygtelig situation, kan de flygter i stedet for at fryse 39. Flugt er en af de frygtreaktioner og dens forekomst vil føre til undervurdering frygt hukommelse. For det andet, kan frysning afhænge af en generel aktivitetsniveau, og har brug for aktivitetsniveauet i forsøgs-og kontrol mus, der skal undersøges. For eksempel, selv om mus mangler M1 muskarine acetylcholin receptor viste reducerede niveauer af frysning forhold til vild type mus, forskellige adfærdsmæssige test viste, at resultaterne kan tilskrives deres hyperaktivitet fænotype i stedet for deres hukommelsessvækkelse 18. ImageFZ beregner afstanden (cm) rejste med fagene. Dataene er til rådighed til at undersøge, om forskelle i de generelle aktivitetsniveau mellem fag. Hvis der er en gruppe forskel iden distance, en mulig tilgang til problemet er at overveje den tilbagelagte afstand i løbet af de første 2 min uddannelse som baseline aktivitet og for at bruge en undertrykkelse ratio (undertrykkelse ratio = (aktivitet under afprøvning) / (aktivitet under baseline + aktivitet under afprøvning)) som en sekundær indeks af frygt 17,40. Endelig kan en forskel i smertefølsomhed, inducere ændringer i reaktivitet til en elektrisk fodchok eventuelt resultere i variationer i frysning adfærd. ImageFZ beregner også distance (cm) i detaljer, 2 sekunder før en eksponering af en 2 sek fodchok til 2 sek efter eksponering (6 sekunder), som kan anvendes som et indeks for fodchok følsomhed.
Er blevet udviklet video-analysesystem til måling indefrysning adfærd albino, sort, agouti, og fortyndes brune mus. ImageFZ bruger en sort gulv bakke og sorte gitre til at undersøge hvide mus (se figur 1B). De sorte net er lavet af spe allierede forarbejdede metaller med belagt sort maling og har en elektrisk ledningsevne, der svarer til de noncoated metalgitre, der typisk anvendes til sorte mus. ImageFZ analyserer også indefrysning adfærd hos rotter og andre gnavere gennem tilpasninger af programmet parametre. I den nuværende version af ImageFZ er opførslen af emnet optaget vha. et videokamera fra den øverste væg til at analysere frysning. ImageFZ kunne også anvendes i en opsætning, hvor billederne er indfanget fra den side af kammeret. Desuden ImageFZ styrer højst 4 apparater. Denne funktion gør det muligt for forskeren at samtidig undersøge 4 mus, hvilket sparer tid og reducerer de potentielle påvirkninger fra forskelle i gennemførelsestid for hvert fag og afprøvning orden på adfærd. Således ImageFZ forenkler testproceduren og analyse af frost adfærd, og dette program letter test med mindre arbejde og uden uddannelse for de adfærdsmæssige eksperimenter.
e_content "> I Miyakawa laboratoriet, har vi vurderet mere end 110 stammer af genetisk modificerede mus og vildtype kontrol mus i kontekstuelle og cued frygt condition test ved hjælp af video-analyse system til at belyse effekten af en given gen på indlæring og hukommelse 41-42 Vi har fået et stort sæt af rå data for mere end 5.000 mus De rå data, der blev brugt til publicerede forskningsartikler 4-16 indgår i 'Mus Fænotype database' som en offentlig database (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Nærværende film artikel giver detaljerede oplysninger om detaljerne i vores eksperimentelle procedure og fremmer forståelsen af de test situation.Disclosures
Vi bekræfter, at der er ingen kendte interessekonflikter forbundet med denne publikation, og der har ikke været nogen betydelig finansiel støtte til dette arbejde, som kunne have påvirket resultatet.
Acknowledgments
Nogle af de data, der vises her blev opnået i laboratoriet af Dr. Jacqueline N. Crawley i det amerikanske National Institute of Mental Health, og vi vil gerne takke hende for at tillade os at vise data i papiret. Vi takker også Kazuo Nakanishi for hans hjælp til at udvikle ImageFZ program for adfærdsanalyse. Denne forskning blev støttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (21.300.121), Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning på innovative områder (Comprehensive Brain Science Network) fra Ministeriet for Undervisning, Videnskab, Sport og Kultur i Japan indrømme fra Neuroinformatik Japan Center (NIJC), og tilskud fra CREST Japan Science and Technology Agency (JST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O’Hara & Co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O’Hara & Co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O’Hara & Co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O’Hara & Co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O’Hara & Co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O’Hara & Co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
References
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , John Wiley & Sons. New York. (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
